성인 마우스의 급성 스트리아탈 슬라이스의 산소 소비율 측정

요약

산소 소비율 (OCR)은 미토콘드리아 기능에 대한 일반적인 프록시이며 다른 질병 모델을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 Seahorse XF 분석기를 사용하여 다른 방법보다 생리 학적으로 관련성이 높은 성인 마우스의 급성 줄무늬 조각에서 OCR을 직접 측정하는 새로운 방법을 개발했습니다.

초록

미토콘드리아는 세포 ATP 생산, 반응성 산소 종 조절 및^Ca2+ 농도 조절에 중요한 역할을 합니다. 미토콘드리아 기능 장애는 파킨슨 병 (PD), 헌팅턴 병 및 알츠하이머 병을 포함한 여러 신경 퇴행성 질환의 발병기전에 연루되어 있습니다. 이러한 질병의 모델에서 미토콘드리아의 역할을 연구하기 위해, 우리는 미토콘드리아 기능의 대리자로서 산소 소모율 (OCR)을 통해 미토콘드리아 호흡을 측정 할 수 있습니다. OCR은 이미 세포 배양물뿐만 아니라 단리된 미토콘드리아에서도 성공적으로 측정되었다. 그러나 이러한 기술은 급성 뇌 조각에서 OCR을 측정하는 것보다 생리 학적으로 관련성이 적습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 저자들은 Seahorse XF 분석기를 사용하여 성인 마우스의 급성 줄무늬 조각에서 OCR을 직접 측정하는 새로운 방법을 개발했습니다. 이 기술은 PD 및 헌팅턴 병과 관련된 뇌 영역 인 선조체에 중점을두고 최적화되어 있습니다. 분석기는 24웰 플레이트를 사용하여 살아있는 세포 분석을 수행하며, 이를 통해 24개의 샘플에 대한 동시 동역학적 측정이 가능합니다. 이 방법은 원형 펀치 조각의 삼중항 뇌 조각을 샘플로 사용합니다. 우리는 PD의 마우스 모델의 줄무늬 슬라이스에서 더 낮은 기저 OCR을 확인함으로써이 기술의 효과를 입증합니다. 이 방법은 PD 및 헌팅턴 병 분야에서 일하는 연구자들에게 광범위한 관심사가 될 것입니다.

서문

미토콘드리아 기능 장애는 파킨슨 병 (PD), 헌팅턴 병 및 알츠하이머 병 ^1,2,3을 포함한 여러 신경 질환에 연루되어 있습니다. PINK1 녹아웃 (KO) 마우스 및 래트와 같은 PD 모델은 손상된 미토콘드리아 기능 4,5,6,7,8,9,10,11을 나타낸다. 노화된 PINK1 KO 마우스의 선조체(STR) 또는 전뇌로부터 분리된 미토콘드리아는 복합체 I ^7,10,12,13에서 결함을 나타낸다. 산소 소모율(OCR)을 직접 측정하는 것은 OCR이 미토콘드리아(¹⁴)의 주요 기능인 ATP 생산과 결합되기 때문에 미토콘드리아 기능을 평가하는 가장 일반적인 방법 중 하나이다. 따라서 질병 모델 또는 환자 유래 샘플 / 조직에서 OCR을 측정하면 미토콘드리아 기능 장애가 어떻게 질병으로 이어지는지 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다.

현재, 클라크 전극 및 다른 O2 전극,_{O2 형광 염료}, 및 세포외 플럭스 분석기 15,16,17,18,19를 포함하는 미토콘드리아 OCR을 측정하는 몇 가지 방법이 있다. 이점으로서,_O2 전극-기반 방법은 다양한 기판이 용이하게 첨가될 수 있게 한다. 그러나 여러 샘플을 동시에 측정하기에는 충분하지 않습니다. 전통적인_O2 전극 기반 방법과 비교할 때, 세포 배양 또는 정제 된 미토콘드리아에서 OCR에 일반적으로 사용되는 도구 인 세포 외 플럭스 분석기는 향상된 처리량 ^15,18,20을 제공합니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 모든 방법은 단리된 미토콘드리아 또는 세포 배양물^{6,16,17,19,20,21}에서 OCR을 측정하기 위해 일반적으로 적용^된다. 미토콘드리아의 분리는 의도하지 않은 손상을 일으키고, 추출된 미토콘드리아 또는 세포 배양물은 온전한 뇌 조각(²²)보다 생리학적으로 덜 관련된다. 미세전극이 슬라이스에 사용되는 경우에도, 이들은 배양된 세포⁽²³)에서보다 덜 민감하고 작동하기가 더 어렵다.

이러한 도전들을 충족시키기 위해, 우리는 XF24 세포외 플럭스 분석기를 사용하는 방법을 개발했는데, 이는 마우스⁽²⁴)의 급성 삼중항 뇌 조각으로부터의 다중 대사 파라미터의 분석을 가능하게 한다. 이 기술은 OCR을 통해 미토콘드리아 호흡의 지속적인 직접 정량화를 제공합니다. 간단히 말해서, 삼중 뇌 조각의 작은 부분은 췌도 판의 우물에 배치되며, 분석기는 산소 및 양성자 형광 기반 바이오 센서를 사용하여 OCR 및 세포 외 산성화 속도를 각각^17,21,25로 측정합니다.

분석기의 독특한 특징 중 하나는 최대 네 개의 화합물 또는 시약을 순차적으로 주입하면서 OCR을 계속 측정 할 수있는 네 개의 주입 웰입니다. 이것은 기저 미토콘드리아 OCR, ATP 연결 OCR 및 최대 미토콘드리아 OCR과 같은 여러 세포 호흡 파라미터의 측정을 가능하게 한다. 여기에 제시된 프로토콜에 대한 측정 동안 주입된 화합물은 첫 번째 용액 웰(포트 A)에서 10 mM 피루베이트, 두 번째 용액 웰(포트 B)에서 20 μM 올리고마이신, 세 번째 웰(포트 C)에서 10 μM 카보닐 시아나이드 4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존(FCCP), 및 네 번째 웰(포트 D)에서 20 μM 안티마이신 A의 작동 농도를 작동시키고, Fried et ^al.25에 근거하여. 이들 농도는 작동 농도였고, 10x, 11x, 12x 및 13x의 스톡 용액은 용액 포트 A를 내지 D에 각각 주입하였다는 점에 유의해야 한다. 각 용액을 사용하는 목적은 다음과 같았다: 1) 피루베이트가 없었기 때문에, FCCP의 첨가는 이용가능한 기질의 제한에 의해 야기된 감소된 OCR 반응을 가질 것이기 때문에 필요하였다; 2) 올리고마이신은 ATP 신타제를 억제하고 ATP 연결된 호흡의 측정을 허용한다; 3) FCCP는 인산화로부터 산화를 해제하고 최대 미토콘드리아 용량의 측정을 허용한다; 4) 안티마이신 A는 전자 수송 사슬에서 콤플렉스 III을 억제하고, 따라서, 미토콘드리아에 연결되지 않은 OCR의 측정을 허용한다.

사용된 올리고마이신의 농도는 다음과 같은 이유에 기초하여 결정되었다: 1) 대부분의 세포 유형(단리된 미토콘드리아 또는 세포 배양물)에 대한 올리고마이신의 권장 투여량은 1.5 μM이다. 경험에 비추어 볼 때, 해리 된 세포 용량의 보통 3x-10x는 구배가있을 수 있고 슬라이스 내의 용액의 침투에는 시간이 걸리기 때문에 슬라이스 실험에 사용됩니다. 따라서, 농도는 5 μM 내지 25 μM의 범위이어야 한다. 2) A 20 μM 농도는 Fried et ^al.25에 기초하여 선택되었다. 더 높은 농도는 올리고마이신의 비특이적 독성으로 인해 시도되지 않았다. 3) Underwood et al.26의 보고서에서 저자들은 올리고마이신에 대한 적정 실험을 수행했으며 ^6.25, 12.5, 25 및 50 μg / mL의 용량이 유사한 억제를 초래한다는 것을 발견했습니다. 올리고마이신 농도가 높을수록 (50 μg/mL) 더 많이 억제되지는 않았지만 더 큰 차이가 있었다. 4) 우리의 관찰에서, 결정 인자는 올리고마이신의 침투 능력 인 것으로 보인다. 올리고마이신이 조직에 침투하는 것은 어렵고, 그래서 최대 반응인 고원에 도달하는 데 적어도 7 내지 8 사이클이 걸리는 이유이다. 고원에 도달하는 한, 억제는 최대로 가정된다.

줄무늬 조각에서 OCR을 측정하기 위해 세포외 플럭스 분석기를 적용하는 주요 기술적 과제는 조직 저산소증을 예방하는 것입니다. 완충액이 측정의 전체 기간 (약 4 시간) 동안 산소화되지 않았기 때문에, 저산소증은 중심 문제였다. 이것은 산소가 샘플 전체에 걸쳐 확산 될 수없는 두꺼운 조직 샘플의 경우 특히 그렇습니다. 이 문제를 극복하기 위해 슬라이스를 150 μm 두께로 절개하여 주변 산소가 뇌 조각의 중간에 침투 할 수 있도록했습니다. 또한, 4 mg / mL 소 혈청 알부민 (BSA)을 사전 산소화 된 인공 뇌척수액 (ACSF) 완충액에 첨가하여 이전에 제안 된 바와 같이 최대 OCR의 결정을 용이하게했습니다²³. 우리는 세포가 살아 있는지 여부를 조사했습니다. 먼저, Hoechst 33258 (10 μM) 및 요오드화 프로피듐 (10 μM)을 사용하여 세포가 이러한 조건에서 건강한지 여부를 조사했습니다. 그런 다음 중간 스파이니 뉴런이 패치 클램프 기록을 사용하여 기능적으로 건강한지 여부를 조사했습니다. 우리는 또한 삼중 절편에서 도파민 (DA) 말단이 빠른 스캔 전압전류법을 사용하여 DA 방출을 측정함으로써 기능적으로 건강한지 여부를 평가했습니다. 결과는 산소화되지 않은 줄무늬 조각 (ACSF / BSA 그룹)이 산소화 된 대조군²⁴만큼 건강하다는 것을 보여주었습니다.

그런 다음 슬라이스 두께와 펀치 크기의 다양한 조합을 테스트하여 플럭스 호흡 분석을위한 최적의 스트리아 슬라이스 조건을 결정했습니다. 두께(150 μm 및 200 μm) 및 펀치 크기(직경 1.0 mm, 1.5 mm 및 2.0 mm)가 상이한 Dorsal striatal 슬라이스를 분석기를 사용한 OCR 분석에 사용하였다. 직경 1.5mm의 펀치 크기로 두께가 150μm인 스트리아탈 슬라이스는 분석기⁽²⁴)에 대해 최적의 범위 내에서 가장 높은 결합 효율 및 OCR을 가졌다.

프로토콜

동물 작업을 포함한 모든 절차는 국내 및 국제 지침에 따라 수행되었으며 토마스 제퍼슨 대학의 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 3 내지 14개월의 나이에 수컷 FVB/NTac 마우스를 사용하였다. 다음 단계는 멸균되지 않은 환경에서 수행되었지만 가능한 한 모든 것을 깨끗하게 유지하도록주의해야합니다.

참고 : 여기에 제시된 방법은 Zhi et ^al.24에 의해보고 된 연구에 확립되어 사용되었습니다. 여기에 설명 된 실험은 Seahorse XF24 세포외 플럭스 분석기를 사용했습니다 ( 표 참조). 이러한 방법은 XFe24 분석기에 적용할 수 있으며 일부 결과는 이 분석기를 사용하여 확인되었습니다.

1. 하이드레이트 카트리지 센서(분석 1일 전)

1. 세포외 플럭스 분석 키트( 표 자료 참조)를 열고 센서 카트리지(녹색) 및 유틸리티 플레이트(클리어; 그림 1A). 센서 카트리지를 옆으로 두고(센서를 위로 올림) 센서를 만지지 마십시오.
2. 600 μL의 교정 용액(pH 7.4)을 유틸리티 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트 위에 놓고 센서를 교정 솔루션에 잠급니다. 유틸리티 및 센서 카트리지 플레이트의 삼각형 노치가 올바르게 정렬되어 있는지 확인합니다(그림 1B).
3. 세포외 플럭스 분석 키트를 교정 용액의 증발을 방지하기 위해 밀봉 필름으로 밀봉한 다음,_CO2 또는 산소가 보충되지 않은 37°C 인큐베이터에 밤새 놓는다.

2. 티슈 플레이트 준비(분석 당일)

1. 췌도 포획 마이크로 플레이트를 열고 조직 앉기를 위해 췌도 플레이트를 꺼냅니다.
2. 사전 산소화된 개질된 인공 뇌척수액 (ACSF, 조성물 140 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2.4 mM CaCl2, 1.3 mM MgSO4, 0.3 mM KH2PO4,₂₅ mM 글루코_스, 10 mM HEPES, pH 7.2) 완충액의적절한 부피 (웰 당 625 μL)를 50 mL 튜브 내에서 37°C로 가온하였다. 그런 다음 BSA를 최종 농도 4 mg / mL에 첨가하여 호흡 완충액을 준비하십시오. 일반적으로 50 mL는 한 접시에 충분합니다.
3. 625μL의 호흡 완충액(25mM 포도당과 4mg/mL BSA가 있는 사전 산소화 ACSF 완충액)을 췌도 플레이트의 각 웰에 조심스럽게 넣고 플레이트가 흔들리지 않도록 합니다. 센서 카트리지 위에 잔류 방울이 없고 각 웰의 버퍼에 기포가 없는지 확인합니다.

3. 급성 줄무늬 슬라이스 준비 및 절제 슬라이스 배치

1. 자궁경부 탈구 후 마우스를 탈구시키고, 즉시 10 mL의 빙냉 예비산소화 절단액 (125 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 3.7 mM MgSO4,_0.3 mM KH2PO4, 10 mM 글루코스, pH 7.4)에서 뇌를 해부한다.
2. 섹션 코로나 스트리아탈 슬라이스는 제조사의 지시에 따라 비브라톰( 재료 표 참조)을 얼음처럼 차갑고 산소가 공급된 절삭 용액에서 150μm의 두께로 합니다.
3. 절편을 50 mL의 산소화된 ACSF (125 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 26 mM_NaHCO3, 2.4 mM_CaCl2, 1.3 mM MgSO4, 0.3 mM_KH2PO4, 10 mM 글루코스, 2 mM HEPES, pH 7.4)로 회수하고, 실온에서 최대 30분 동안 용액에 보관하였다 (RT).
4. 회복 후, 슬라이스를 5 mL의 호흡 완충액과 함께 35 mm x 10 mm 페트리 접시로 옮긴다.
5. 스테인리스 스틸 생검 펀치 (예를 들어, 직경 1.5 mm)를 사용하여 슬라이스 된 뇌의 원하는 영역에 원형 조직 조각을 만듭니다. 펀치로 부드럽게 누르면서 슬라이스를 버퍼에 보관하십시오. 펀치가 조직을 절단할만큼 충분히 세게 눌려져 있는지 확인하십시오. 조직의 나머지 부분을 제거하고 펀치를 들어 올린 다음 원형 조직 조각을 버퍼로 제거하십시오.
6. 1mL 피펫 팁의 맨 끝을 잘라 직경 1.5-2.0mm의 구멍을 만들고 구멍을 뚫은 슬라이스를 잡고 캡처 화면 상단으로 옮기는 데 사용합니다. 펀치된 뇌 조직 한 조각을 흡입하고 조심스럽게 조직을 캡처 스크린의 메쉬 측면에 놓습니다(그림 2A). 캡처 화면은 한쪽에 메쉬가 부착 된 원형 플라스틱 조각입니다.
   참고: 캡처 스크린은 마이크로플레이트 팩(재료 표 참조)에 포함되어 있으며 Schuh et al.23에 사용된 것과 유사합니다.
7. 종이 티슈를 부드럽게 사용하여 캡처 화면을 간단히 건조시킵니다. 수분이 제거되면 조직이 끈적 거리게되어 슬라이스가 메쉬의 중앙에 부착 될 수 있습니다. 슬라이스를 너무 많이 말리지 마십시오, 그렇지 않으면 손상 될 것입니다.
8. 캡처 화면 슬라이스를 핀셋으로 옆으로 잡고 인큐베이팅 섬 플레이트의 웰 중 하나에 놓습니다(그림 2B). 슬라이스를 떨어 뜨리지 않도록주의하십시오. 그렇다면 화면을 꺼내 새 슬라이스를 놓습니다.
   참고: 뇌 조각을 췌도 판의 두 개의 배경 보정 우물(A1 및 D6)에 넣지 마십시오.
9. 췌도 플레이트를 37°C에서 적어도 30분 동안 인큐베이터에서 인큐베이션하여 분석을 실행하기 전에 온도 및 pH 평형화를 허용한다.

4. 원하는 화합물로 카트리지 적재

1. 목적 화합물을 개질된 ACSF (37°C)에서 포트 A 내지 D에 대한 작업 농도의 10x, 11x, 12x 및 13x의 최종 스톡 농도로 각각 희석하고, pH 7.4로 조정한다. 시험은 포트 A 내지 D로부터 순서대로 화합물을 투여할 것이다. 이 실험을 위해, 10 mM 피루베이트 (포트 A), 20 μM 올리고마이신 (포트 B), 10 μM 또는 FCCP (포트 C) 및 20 μM 안티마이신 A (포트 D)의 다른 농도와 함께 다음 용액을 사용하였다.
2. 희석된 화합물 75μL를 센서 카트리지의 적절한 주입 포트에 부드럽게 예비로딩합니다. 팁을 주입 포트의 벽에 대해 팁과 함께 45° 각도로 주입 포트에 반쯤 놓습니다. 팁은 주입 포트의 바닥에 완전히 삽입해서는 안되며, 이로 인해 포트를 통해 복합 누출이 발생할 수 있습니다.
3. 기포가 생기지 않도록 포트에서 팁을 조심스럽게 빼내십시오. 기포가 완화되지 않도록 카트리지의 어느 부분도 탭하지 마십시오.
4. 주입 포트에서 균일한 로딩을 육안으로 검사합니다. 모든 액체가 포트에 있고 카트리지 위에 잔류 방울이 없는지 확인하십시오.
5. 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트 위에 놓고 30분 동안 인큐베이터(비_CO2)에 넣어 다시 37°C까지 가열할 수 있도록 한다. 유틸리티 플레이트를 잡기만 하면 조심스럽게 다루십시오. 가능한 한 적게 움직입니다.

5. 교정 및 분석 수행

1. 분석 템플릿을 소프트웨어에 로드합니다. 녹색 START 버튼을 누릅니다.
2. 올바른 프로토콜을 로드해야 합니다. 프로토콜은 3 분 혼합, 3 분 대기 및 2 분 측정 시퀀스의 조합을 포함합니다 (이 세 단계는 하나의 측정을 형성합니다). 기기 설정²⁵의 하드웨어 설정에서 프로브 헤드의 거리를 26,600에서 27,800으로 변경합니다. XFe24 분석기의 프로브 헤드를 변경할 필요가 없습니다. 시작을 누릅니다.
3. 유틸리티 플레이트의 센서 카트리지를 계측기 트레이에 로드합니다. 노치는 앞쪽, 왼쪽 모서리에 있습니다. 플레이트가 올바르게 장착되고 평평한지 확인하십시오. 교정을 위해 약물로 채워진 센서 카트리지를 분석기에 로드합니다.
4. 화면의 지시에 따라 센서를 교정하고 평형을 조정하십시오. 이것은 약 30 분이 걸립니다.
5. 교정 단계가 완료되면 교정 플레이트를 제거하고 췌도 플레이트 (메쉬 및 조직 조각 포함)로 교체하십시오.
6. 분석 프로토콜을 사용하여 플레이트의 각 웰에서 산소 소비량을 측정한다. 프로토콜은 3 분 믹스, 3 분 대기 및 2 분 측정 시퀀스 (이 세 단계가 하나의 측정을 형성)의 조합을 포함하며, 이때 OCR이 계산됩니다.
7. 전체 실험을 위해 4x OCR 측정을 포함하여 기준선을 만든 다음 4x 측정으로 포트 A (pyruvate)를 주입 한 다음 8x 측정으로 포트 B (올리고 마이신)를 주입 한 다음 5x 측정으로 포트 C (FCCP)를 주입하고 마지막으로 6x 측정으로 포트 D (안티 마이신 A)를 주입합니다.
   참고: 각 화합물 주입 후의 이 측정 횟수는 측정이 고원에 도달하는 시기에 따라 결정됩니다.
8. OCR 측정 데이터와 커플링 효율 데이터를 분석한다.

결과

이 연구의 첫 번째 단계는 슬라이스에서 선조체의 섹션을 소비하는 데 사용되는 슬라이스 두께와 펀치 크기를 최적화하는 것이 었습니다 (그림 3A). 150μm 두께의 슬라이스와 1.5mm 펀치 크기로 커플링 효율에 의해 결정된 최상의 결과를 제공했습니다(그림 3B-C). 도 3B에 도시된 바와 같이, OCR은 10% 미만의 런?...

토론

우리가 개발 한 방법을 사용하면 XF 분석기를 사용하여 4 시간의 시간 동안 성인 마우스의 줄무늬 조각에서 OCR을 측정 할 수있었습니다. 이 방법은 해부학적으로 정의 된 뇌 구조에서 절제 된 펀치에서 세포 생물 에너지를 측정하는 새로운 방법을 제공합니다. 분석되는 조직 샘플이 다소 작기 때문에 질병에 관련된 특정 뇌 영역의 대사 매개 변수를 조사 할 수 있습니다. 또한, 급성 슬라이스를 사?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accumet AB150 pH benchtop meter	Thermo Fisher Scientific	13-636-AB150	To measure pH
Antimycin A from streptomyces sp.	SIGMA	A8674	To inhibit complex III of the mitochondria
Bovine Serum Albumin (BSA)	SIGMA	A6003	To make modified artificial cerebrospinal fluid (BSA-ACSF)
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)	SIGMA	C2920	To uncouple mitochondrial respiration
D-Glucose	SIGMA	G8270	To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF)
DMSO	SIGMA	D8418	To dissovle compounds
HEPES	SIGMA	H3375	To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF)
Humidified non-CO2 incubator	Fisher Scientific	11-683-230D	To hydrate plates at 37 °C
Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes	SIGMA	O4876	To inhibit mitochondrial ATP synthase
Parafilm	SIGMA-ALDRICH		sealing film
Rotenone	Tocris	3616	To inhibit complex I of the mitochondria
Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL	Seahorse Bioscience	103681-100	Solution for seahorse calibration
Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer	Seahorse Bioscience		Equipment used to analyze oxygen consumption rate, old generation
Seahorse XFe24 Extracellular Flux Analyzer	Seahorse Bioscience		Equipment used to analyze oxygen consumption rate, new generation
Seahorse XF24 FluxPaks	Seahorse Bioscience	101174-100	Package of flux analyzer sensor cartridges, tissue culture plates, capture screens,  calibrant solution and calibration plates; assay kit.
Sodium pyruvate	SIGMA	P2256	To prevent any substrate-limiting constraints of substrate supply
Stainless steel biopsy punches	Miltex		Device used to punch slices
Sterile cell culture dish, 35 x 10 mm	Eppendrof	0030700102	Used for slice punch
Vibratome	Leica	VT1200	To slice brain tissue
Water bath	Thermo Scientific Precision	282-115	To heat buffer and solutions