מדידת קצב צריכת חמצן בפרוסות סטריאליות חריפות מעכברים בוגרים

Summary

קצב צריכת חמצן (OCR) הוא פרוקסי נפוץ לתפקוד המיטוכונדריה וניתן להשתמש בו כדי לחקור מודלים שונים של מחלות. פיתחנו שיטה חדשה באמצעות מנתח XF של סוסון ים כדי למדוד ישירות את ה-OCR בפרוסות סטריאליות חריפות מעכברים בוגרים, שהיא רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית משיטות אחרות.

Abstract

המיטוכונדריה ממלאת תפקיד חשוב בייצור ATP תאי, בוויסות מיני חמצן תגובתי ובקרת ריכוז Ca²⁺ . תפקוד לקוי של המיטוכונדריה היה מעורב בפתוגנזה של מחלות נוירודגנרטיביות מרובות, כולל מחלת פרקינסון (PD), מחלת הנטינגטון ומחלת אלצהיימר. כדי לחקור את תפקידה של המיטוכונדריה במודלים של מחלות אלה, אנו יכולים למדוד את הנשימה המיטוכונדרית באמצעות קצב צריכת חמצן (OCR) כמייצג לתפקוד המיטוכונדריה. זיהוי תווים אופטי (OCR) כבר נמדד בהצלחה בתרביות תאים, כמו גם במיטוכונדריה מבודדת. עם זאת, טכניקות אלה רלוונטיות פחות מבחינה פיזיולוגית ממדידת זיהוי תווים אופטי (OCR) בפרוסות מוח חריפות. כדי להתגבר על מגבלה זו, המחברים פיתחו שיטה חדשה באמצעות מנתח XF של סוסון ים כדי למדוד ישירות את ה-OCR בפרוסות סטריאליות חריפות מעכברים בוגרים. הטכניקה מותאמת תוך התמקדות בסטריאטום, אזור במוח המעורב בפרקינסון ובמחלת הנטינגטון. המנתח מבצע בדיקת תאים חיים באמצעות לוחית של 24 בארות, המאפשרת מדידה קינטית סימולטנית של 24 דגימות. השיטה משתמשת בפיסות מנוקבות עגולות של פרוסות מוח סטריאליות כדגימות. אנו מדגימים את היעילות של טכניקה זו על ידי זיהוי OCR בסיסי נמוך יותר בפרוסות סטריאליות של מודל עכבר של PD. שיטה זו תעניין חוקרים העוסקים בתחום מחלת הפרקינסון והמחלת הנטינגטון.

Introduction

תפקוד לקוי של המיטוכונדריה היה מעורב במספר מחלות נוירולוגיות, כולל מחלת פרקינסון (PD), מחלת הנטינגטון ומחלת אלצהיימר ^1,2,3. דגמי PD כגון עכברי נוקאאוט PINK1 (KO) וחולדות מציגים תפקוד מיטוכונדריאלי לקוי 4,5,6,7,8,9,10,11. מיטוכונדריה מבודדת מהסטריאטום (STR) או המוח השלם של עכבר PINK1 KO הזקן מפגינה פגמים בקומפלקס I 7,10,12,13. מדידה ישירה של קצב צריכת החמצן (OCR) היא אחת השיטות הנפוצות ביותר להערכת תפקוד המיטוכונדריה מכיוון ש-OCR משולב עם ייצור ATP, הפונקציה העיקרית של המיטוכונדריה¹⁴. לכן, מדידת זיהוי תווים אופטי (OCR) במודלים של מחלות או בדגימות/רקמות שמקורן בחולה יכולה לסייע בחקר האופן שבו תפקוד לקוי של המיטוכונדריה מוביל למחלות.

נכון לעכשיו, ישנן מספר דרכים למדוד OCR מיטוכונדריאלי, כולל אלקטרודת קלארק ואלקטרודות O₂ אחרות, צבע פלואורסצנטי O₂, ומנתח השטף החוץ-תאי 15,16,17,18,19. כיתרון, שיטות מבוססות אלקטרודות O₂ מאפשרות להוסיף בקלות מצעים שונים. עם זאת, הם אינם מספיקים למדידה בו זמנית של מספר דגימות. בהשוואה לשיטות מסורתיות המבוססות על אלקטרודות O₂, מנתח השטף החוץ-תאי, כלי נפוץ ל-OCR בתרביות תאים או מיטוכונדריה מטוהרת, מציע תפוקה משופרת^{של 15,18,20}. עם זאת, כל השיטות הללו מיושמות בדרך כלל למדידת זיהוי תווים אופטי (OCR) במיטוכונדריה מבודדת או בתרביות תאים 6,16,17,19,20,21. הבידוד של המיטוכונדריה גורם לנזק לא מכוון, ומיטוכונדריה מופקת או תרביות תאים פחות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית מאשר פרוסות מוח שלמות²². גם כאשר משתמשים במיקרו-אלקטרוניקה בפרוסות, הן פחות רגישות וקשות יותר לתפעול מאשר בתאים בתרבית²³.

כדי לעמוד באתגרים אלה, פיתחנו שיטה באמצעות מנתח השטף החוץ-תאי XF24, המאפשרת ניתוח של פרמטרים מטבוליים מרובים מפרוסות מוח סטריאליות חריפות של עכברים²⁴. טכניקה זו מספקת כימות ישיר רציף של נשימה מיטוכונדריאלית באמצעות OCR. בקצרה, חלקים קטנים של פרוסות מוח סטריאליות מוכנסים לבארות של צלחת האי, והמנתח משתמש בביו-סנסורים מבוססי חמצן ופרוטונים פלואורסצנטיים כדי למדוד את ה-OCR ואת קצב ההחמצה החוץ-תאית, בהתאמה 17,21,25.

אחד המאפיינים הייחודיים של המנתח הוא ארבע בארות ההזרקה, המאפשרות את המשך המדידה של זיהוי תווים אופטי (OCR) תוך הזרקה רציפה של עד ארבע תרכובות או ריאגנטים; זה מאפשר מדידה של מספר פרמטרים של נשימה תאית, כגון OCR מיטוכונדריאלי בסיסי, OCR המקושר ל-ATP ו-OCR מיטוכונדריאלי מקסימלי. התרכובות שהוזרקו במהלך המדידות עבור הפרוטוקול המוצג כאן היו ריכוזי עבודה של 10 mM pyruvate בבאר התמיסה הראשונה (יציאה A), 20 μM אוליגומיצין בבאר התמיסה השנייה (יציאה B), 10 μM קרבוניל ציאניד 4-(trifluoromethoxy) פניל-הידרזון (FCCP) בבאר השלישית (יציאה C), ו-20 μM אנטימיצין A בבאר הרביעית (יציאה D), מבוסס על פריד ואח' ²⁵. יש לציין כי ריכוזים אלה היו ריכוזי עבודה, ותמיסות מלאי של 10x, 11x, 12x ו- 13x הוזרקו ליציאות התמיסה A עד D, בהתאמה. מטרת השימוש בכל פתרון הייתה כדלקמן: 1) פירובט היה נחוץ שכן, בלעדיו, הוספת FCCP תהיה תגובת OCR מופחתת הנגרמת על ידי הגבלה של מצעים זמינים; 2) אוליגומיצין מעכב ATP סינתאז ומאפשר מדידה של נשימה מקושרת ATP; 3) FCCP משחרר את החמצון מזרחון ומאפשר מדידה של קיבולת מיטוכונדריאלית מקסימלית; 4) אנטימיצין A מעכב קומפלקס III בשרשרת הובלת האלקטרונים, ולכן מאפשר מדידה של OCR שאינו קשור למיטוכונדריה.

ריכוז האוליגומיצין שבו נעשה שימוש נקבע על סמך הסיבות הבאות: 1) המינון המומלץ של אוליגומיצין עבור רוב סוגי התאים (מיטוכונדריה מבודדת או תרביות תאים) הוא 1.5 מיקרומטר. מניסיון, בדרך כלל פי 3-10 ממינון התאים המנותקים משמש לניסויים בפרוסה מכיוון שייתכן שיש שיפוע, והחדירה של התמיסה לפרוסות לוקחת זמן. לכן, הריכוז צריך להיות בטווח של 5 μM עד 25 μM. 2) ריכוז 20 μM נבחר על סמך Fried et ^al.25. ריכוזים גבוהים יותר לא נוסו בשל הרעילות הלא ספציפית של אוליגומיצין. 3) בדו"ח של Underwood et ^al.26, החוקרים ערכו ניסוי טיטרציה עבור אוליגומיצין ומצאו כי מינונים של 6.25, 12.5, 25 ו-50 מיקרוגרם/מ"ל גרמו לעיכוב דומה. הריכוז הגבוה יותר של אוליגומיצין (50 מיקרוגרם/מ"ל) לא עיכב יותר, אך הייתה לו שונות גדולה יותר. 4) בתצפית שלנו, נראה שהגורם הקובע הוא היכולת החודרת של אוליגומיצין. קשה לאוליגומיצין לחדור לרקמה, ולכן לוקח לפחות 7 עד 8 מחזורים להגיע למישור, התגובה המקסימלית. כל עוד הוא מגיע למישור, מניחים שהעיכוב הוא מקסימלי.

אתגר טכני מרכזי בהתאמת מנתח השטף החוץ-תאי למדידת זיהוי תווים אופטי (OCR) בפרוסות סטריאליות הוא למנוע היפוקסיה של רקמות. מכיוון שהמאגר לא היה מחומצן במשך כל משך המדידות (כ-4 שעות), היפוקסיה הייתה בעיה מרכזית. זה נכון במיוחד עבור דגימות רקמה עבות יותר, שבהן חמצן לא יכול להתפזר לאורך הדגימות. כדי להתגבר על בעיה זו, פרוסות נחתכו בעובי של 150 מיקרומטר, כך שחמצן הסביבה יכול היה לחדור לאמצע פרוסות המוח. בנוסף, נוספו 4 מ"ג/מ"ל אלבומין בסרום בקר (BSA) למאגר הנוזלים השדרתיים המלאכותיים (ACSF) שהתחמצן מראש, מה שאיפשר את קביעתו של זיהוי תווים אופטי (OCR) מקסימלי, כפי שהוצע בעבר²³. בדקנו אם התאים חיים. ראשית, Hoechst 33258 (10 μM) ו- propidium iodide (10 μM) שימשו כדי לבחון אם התאים היו בריאים בתנאים אלה. לאחר מכן בחנו אם נוירונים קוצניים בינוניים היו בריאים מבחינה תפקודית באמצעות רישום מהדק טלאי. הערכנו עוד אם מסופי דופמין (DA) בפרוסות הסטריאטליות היו בריאים מבחינה תפקודית על ידי מדידת שחרור DA באמצעות וולטמטריה בסריקה מהירה. התוצאות הראו כי פרוסות סטריאליות שלא היו מחומצנות (קבוצת ACSF/BSA) היו בריאות כמו קבוצת הביקורת המחומצנת²⁴.

לאחר מכן בדקנו שילובים שונים של עובי פרוסה וגודל האגרוף כדי לקבוע את תנאי הפרוסה הסטריאלית האופטימליים למבחן הנשימה של השטף. פרוסות סטריאליות דורסליות בעוביים שונים (150 מיקרומטר ו-200 מיקרומטר) וגדלי אגרוף (1.0 מ"מ, 1.5 מ"מ וקוטר 2.0 מ"מ) שימשו לניתוח OCR באמצעות המנתח. פרוסות סטריאטליות בעובי של 150 מיקרומטר עם גודל אגרוף של 1.5 מ"מ קוטר היו בעלות יעילות הצימוד הגבוהה ביותר ו- OCRs בטווח אופטימלי עבור המנתח²⁴.

Protocol

כל ההליכים, כולל עבודה בבעלי חיים, נערכו על פי הנחיות לאומיות ובינלאומיות ואושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת תומאס ג'פרסון. נעשה שימוש בעכברי FVB/NTac זכרים בגיל 3 עד 14 חודשים. הצעדים הבאים בוצעו בסביבה לא סטרילית, אך יש להיזהר כדי לשמור על הכל נקי ככל האפשר.

הערה: השיטה המוצגת כאן הוקמה ונעשה בה שימוש במחקר שדווח על ידי Zhi et ^al.24. הניסויים המתוארים כאן השתמשו בניתוח שטף חוץ-תאי של סוסון ים XF24 (ראו טבלת חומרים). ניתן להתאים שיטות אלה עבור מנתח XFe24, וכמה תוצאות אושרו באמצעות מנתח זה.

1. הידרציה של חיישני מחסניות (יום אחד לפני הבדיקה)

1. פתח את ערכת בדיקת השטף החוץ-תאי (ראה טבלת חומרים) והסר הן את מחסנית החיישן (ירוקה) והן את לוחית השירות (ברורה; איור 1A). הניחו את מחסנית החיישן בצד (חיישנים למעלה) ואל תיגעו בחיישנים.
2. הוסף 600 μL של תמיסת calibrant (pH 7.4) לכל באר של לוח השירות. הניחו את מחסנית החיישן על גבי לוחית השירות והטביעו את החיישנים בתמיסת הקליברנט. ודא שהחריץ המשולש של לוחית כלי השירות ולוחית מחסנית החיישן מיושרים כהלכה (איור 1B).
3. אטמו את ערכת בדיקת השטף החוץ-תאי עם סרט איטום כדי למנוע אידוי של תמיסת הקליפרנט, ולאחר מכן הניחו אותה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ללא תוספת של CO₂ או חמצן במהלך הלילה.

2. מכינים את צלחת הרקמות (ביום הבדיקה)

1. פתחו את המיקרו-פלטה ללכידת האיים והוציאו את צלחת האיון לישיבת רקמות.
2. יש לחמם נפח מתאים (625 μL לבאר) של נוזל מוחי מלאכותי מעובד שעבר חיטוי מראש (ACSF, הרכב של 140 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2.4 mM CaCl₂, 1.3 mM MgSO₄, 0.3 mM KH₂PO₄, 25 mM גלוקוז, 10 mM HEPES, pH 7.2) חיץ עד 37 °C בצינור 50 מ"ל. לאחר מכן הוסיפו BSA לריכוז סופי של 4 מ"ג/מ"ל כדי להכין את מאגר הנשימה. באופן כללי, 50 מ"ל מספיק לצלחת אחת.
3. הוסיפו 625 μL של מאגר נשימה (חיץ ACSF מחומצן מראש עם 25 מ"מ גלוקוז ו-4 מ"ג/מ"ל BSA) לכל באר של צלחת האיון בזהירות והימנעו מניעור הצלחת. ודא שאין טיפות שיוריות על גבי מחסנית החיישן ולא קיימות בועות אוויר במאגר של כל באר.

3. הכנת פרוסות סטריאליות חריפות ומיקום פרוסה נכרת

1. ערפו את העכבר לאחר נקע צוואר הרחם ומיד נתחו את המוח ב-10 מ"ל של תמיסת חיתוך טרום-מחומצנת של קר כקרח (125 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 26 mM NaHCO₃, 3.7 mM MgSO₄, 0.3 mM KH₂PO₄, 10 mM גלוקוז, pH 7.4).
2. חתך פרוסות סטריאליות קורונליות עם ויברטום בהתאם להוראת היצרן (ראו טבלת חומרים) בעובי של 150 מיקרומטר בתמיסת חיתוך קרה כקרח ומחומצנת מראש.
3. שחזרו את הפרוסות ב-50 מ"ל של ACSF מחומצן (125 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 26 mM NaHCO₃, 2.4 mM CaCl₂, 1.3 mM MgSO₄, 0.3 mM KH₂PO₄, 10 mM גלוקוז, 2 mM HEPES, pH 7.4) ושמרו בתמיסה עד 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
4. לאחר ההתאוששות, מעבירים את הפרוסות לצלחת פטרי בגודל 35 מ"מ x 10 מ"מ עם 5 מ"ל של חיץ נשימה.
5. השתמשו בביופסיה מפלדת אל-חלד (למשל, קוטר 1.5 מ"מ) כדי ליצור פיסת רקמה עגולה באזור הרצוי של המוח הפרוס. שמור את הפרוסה במאגר תוך כדי לחיצה עדינה כלפי מטה עם האגרוף. וודאו שהאגרוף נדחף חזק מספיק כלפי מטה כדי לחתוך את הרקמה. הסר את שאר הרקמה, הרם את האגרוף והסר את פיסת הרקמה העגולה לתוך המאגר.
6. חותכים את הקצה של קצה פיפטה של 1 מ"ל כדי ליצור חור בקוטר 1.5-2.0 מ"מ ולהשתמש בו כדי להחזיק ולהעביר את הפרוסה המנוקבת לחלק העליון של מסך הלכידה. ינקו חתיכה אחת של רקמת מוח מנוקבת והניחו בזהירות את הרקמה על צד הרשת של מסך הלכידה (איור 2A). מסך הלכידה יהיה חתיכת פלסטיק עגולה עם הרשת המחוברת לצד אחד.
   הערה: מסכי הלכידה כלולים בחבילת המיקרו-פלטות (ראה טבלת חומרים) והם דומים לאלה המשמשים ב- Schuh et ^al.23.
7. השתמשו בעדינות בטישו מנייר כדי לייבש את מסך הלכידה לזמן קצר. עם הסרת הלחות, הרקמה הופכת דביקה, מה שמאפשר לפרוסה להתחבר למרכז הרשת. אין לייבש את הפרוסה יותר מדי, אחרת היא תיפגע.
8. החזיקו את פרוסת מסך הלכידה בצד עם פינצטה והניחו אותה באחת הבארות של צלחת האיים המדגרת (איור 2B). היזהרו לא להפיל את הפרוסה; אם כן, הוציאו את המסך והניחו עליו פרוסה חדשה.
   הערה: אין למקם פרוסות מוח בשתי בארות תיקון הרקע (A1 ו- D6) בלוח האיי.
9. דגירה של צלחת האי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור למשך 30 דקות לפחות כדי לאפשר שיווי משקל טמפרטורה ו- pH לפני הפעלת הבדיקה.

4. טעינת מחסניות עם תרכובות רצויות

1. דיללו את התרכובות הרצויות ב-ACSF מותאם (37 מעלות צלזיוס) לריכוז המלאי הסופי של 10x, 11x, 12x ו-13x מריכוז העבודה עבור יציאות A עד D, בהתאמה, והתאימו את עצמכם ל-pH 7.4. הבדיקה תיתן את התרכובות לפי הסדר מיציאה A עד D. לניסוי זה נעשה שימוש בתמיסות הבאות, כאשר ריכוז העבודה שלהן הוזכר לפניהן: 10 mM פירובט (יציאה A), 20 μM אוליגומיצין (יציאה B), 10 μM או ריכוזים אחרים של FCCP (יציאה C) ו-20 μM אנטימיצין A (יציאה D).
2. טען מראש בעדינות 75 μL של התרכובות המדוללות לתוך יציאות ההזרקה המתאימות של מחסנית החיישן. מניחים את הקצוות באמצע הדרך לתוך יציאות ההזרקה בזווית של 45° עם הקצה על דופן יציאת ההזרקה. אין להכניס טיפים לחלוטין לתחתית יציאות ההזרקה מכיוון שהדבר עלול לגרום לדליפת תרכובת דרך היציאה.
3. משכו את הקצוות מהיציאות בזהירות כדי להימנע מיצירת בועות אוויר. אין להקיש על חלק כלשהו במחסנית כדי להימנע מהקלה על בועות אוויר.
4. בדוק חזותית את יציאות ההזרקה לטעינה אחידה. ודא שכל הנוזלים נמצאים ביציאה ואין טיפות שיוריות על גבי המחסנית.
5. הניחו את מחסנית החיישן על לוחית השירות והכניסו אותה לחממה (שאינה CO₂) למשך 30 דקות כדי לאפשר לה להתחמם שוב עד 37 מעלות צלזיוס. טפלו בזהירות על ידי החזקה בלבד בצלחת השירות. לזוז כמה שפחות.

5. כיול וביצוע הבדיקה

1. טען את תבנית הבדיקה בתוכנה. לחץ על לחצן התחל הירוק.
2. הקפד לטעון את הפרוטוקול הנכון. הפרוטוקול מכיל שילוב של מיקס של 3 דקות, המתנה של 3 דקות ורצפי מדידה של 2 דקות (שלושת השלבים האלה יוצרים מדידה אחת). שנה את המרחק של ראש הגשושית מ-26,600 ל-27,800 בהגדרות החומרה תחת הגדרות המכשיר²⁵. אין צורך לשנות את ראש הבדיקה עבור מנתח XFe24. לחץ על התחל.
3. טען את מחסנית החיישן על לוח השירות למגש המכשירים. החריץ הולך בפינה הקדמית, השמאלית. ודא שהצלחת יושבת כראוי ושטוחה. טען את מחסנית החיישן המלאה בתרופות לתוך המנתח לצורך כיול.
4. בצע את ההוראות שעל המסך על מנת לכייל ולאזן את החיישנים. זה לוקח בערך 30 דקות.
5. לאחר סיום שלב הכיול, הסר את לוחית הכיול והחלף אותה בפלטת האי (המכילה את פרוסות הרשת והרקמות).
6. מדוד את צריכת החמצן בכל באר של הצלחת באמצעות פרוטוקולי הבדיקה. הפרוטוקול מכיל שילוב של תערובת של 3 דקות, המתנה של 3 דקות ורצפי מדידה של 2 דקות (שלושת השלבים האלה יוצרים מדידה אחת), ואז מחושב ה-OCR.
7. עבור הניסוי כולו, לכלול 4x מדידות OCR כדי ליצור קו בסיס, ואחריו הזרקת יציאה A (פירובט) עם מדידות 4x, לאחר מכן הזרקת יציאה B (אוליגומיצין) עם 8x מדידות, לאחר מכן הזרקה של יציאה C (FCCP) עם 5x מדידות, ולבסוף, הזרקת יציאה D (אנטימיצין A) עם מדידות 6x.
   הערה: מספר מדידות זה לאחר כל הזרקה מורכבת נקבע בהתאם למועד שבו המדידה מגיעה למישור.
8. נתח את נתוני מדידת ה-OCR ואת נתוני יעילות הצימוד.

תוצאות

הצעד הראשון של המחקר הזה היה לייעל את עובי הפרוסה ואת גודל האגרוף ששימשו לכריתת קטע מהסטריאטום מהפרוסה (איור 3A). פרוסה בעובי של 150 מיקרומטר וגודל אגרוף של 1.5 מ"מ נתנו את התוצאות הטובות ביותר שנקבעו על ידי יעילות הצימוד (איור 3B-C). כפי שניתן לר?...

Discussion

השיטה שפיתחנו אפשרה למנתח XF לשמש למדידת זיהוי תווים אופטי (OCR) בפרוסות סטריאליות מעכברים בוגרים על פני פרק זמן של 4 שעות. שיטה זו מספקת דרך חדשה למדוד ביו-אנרגיה תאית באגרופים שנלקחו ממבני מוח המוגדרים אנטומית. מאחר שדגימות הרקמה המנותחות קטנות למדי, ניתן לחקור את הפרמטרים המטבוליים של אזור...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accumet AB150 pH benchtop meter	Thermo Fisher Scientific	13-636-AB150	To measure pH
Antimycin A from streptomyces sp.	SIGMA	A8674	To inhibit complex III of the mitochondria
Bovine Serum Albumin (BSA)	SIGMA	A6003	To make modified artificial cerebrospinal fluid (BSA-ACSF)
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)	SIGMA	C2920	To uncouple mitochondrial respiration
D-Glucose	SIGMA	G8270	To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF)
DMSO	SIGMA	D8418	To dissovle compounds
HEPES	SIGMA	H3375	To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF)
Humidified non-CO2 incubator	Fisher Scientific	11-683-230D	To hydrate plates at 37 °C
Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes	SIGMA	O4876	To inhibit mitochondrial ATP synthase
Parafilm	SIGMA-ALDRICH		sealing film
Rotenone	Tocris	3616	To inhibit complex I of the mitochondria
Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL	Seahorse Bioscience	103681-100	Solution for seahorse calibration
Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer	Seahorse Bioscience		Equipment used to analyze oxygen consumption rate, old generation
Seahorse XFe24 Extracellular Flux Analyzer	Seahorse Bioscience		Equipment used to analyze oxygen consumption rate, new generation
Seahorse XF24 FluxPaks	Seahorse Bioscience	101174-100	Package of flux analyzer sensor cartridges, tissue culture plates, capture screens,  calibrant solution and calibration plates; assay kit.
Sodium pyruvate	SIGMA	P2256	To prevent any substrate-limiting constraints of substrate supply
Stainless steel biopsy punches	Miltex		Device used to punch slices
Sterile cell culture dish, 35 x 10 mm	Eppendrof	0030700102	Used for slice punch
Vibratome	Leica	VT1200	To slice brain tissue
Water bath	Thermo Scientific Precision	282-115	To heat buffer and solutions