成体マウスの急性線条体スライスにおける酸素消費率の測定

要約

酸素消費率(OCR)は、ミトコンドリア機能の一般的なプロキシであり、さまざまな疾患モデルを研究するために使用することができます。我々は、シーホースXF分析装置を用いて、成体マウスの急性線条体切片のOCRを直接測定する新しい方法を開発した。

要約

ミトコンドリアは、細胞のATP産生、活性酸素種の調節、および^Ca2+ 濃度制御において重要な役割を果たしている。ミトコンドリア機能障害は、パーキンソン病(PD)、ハンチントン病、アルツハイマー病を含む複数の神経変性疾患の病因に関与している。これらの疾患のモデルにおけるミトコンドリアの役割を研究するために、我々はミトコンドリア機能の代理として酸素消費速度(OCR)を介してミトコンドリア呼吸を測定することができる。OCRは、細胞培養物および単離されたミトコンドリアにおいて、すでに首尾よく測定されている。しかし、これらの技術は、急性脳スライスでOCRを測定するよりも生理学的に関連性が低い。この制限を克服するために、著者らは、成体マウスの急性線条体スライスのOCRを直接測定するために、タツノオトシゴXF分析装置を使用する新しい方法を開発した。この技術は、PDおよびハンチントン病に関与する脳領域である線条体に焦点を当てて最適化されています。分析器は、24ウェルプレートを使用して生細胞アッセイを行い、24サンプルの同時速度論的測定を可能にします。この方法は、サンプルとして線条体脳スライスの円形パンチ片を使用する。我々は、PDのマウスモデルの線条体スライスにおいてより低い基底OCRを同定することによって、この技術の有効性を実証する。この方法は、PDおよびハンチントン病の分野で働く研究者にとって幅広い関心事となるでしょう。

概要

ミトコンドリア機能障害は、パーキンソン病(PD)、ハンチントン病、およびアルツハイマー病を含むいくつかの神経学的疾患に関与している^1,2,3。PINK1ノックアウト(KO)マウスおよびラットなどのPDモデルは、ミトコンドリア機能障害⁴、⁵、⁶、⁷、^8、9、^10、11を示す。老化PINK1 KOマウスの線条体(STR)または全脳から単離されたミトコンドリアは、複合体^I7、^10、12、13において欠損を示す。酸素消費速度(OCR)を直接測定することは、OCRがミトコンドリア¹⁴の主要な機能であるATP産生と結合しているため、ミトコンドリア機能を評価する最も一般的な方法の1つです。したがって、疾患モデルまたは患者由来のサンプル/組織でOCRを測定することは、ミトコンドリア機能障害が疾患にどのようにつながるかを調査するのに役立ちます。

現在、ミトコンドリアOCRを測定するには、クラーク電極および他のO2電極、_O2蛍光色素、および細胞外フラックス分析装置15、16、¹⁷、^18、19を含むいくつかの方法がある。利点として、_O2電極ベースの方法は、様々な基板を容易に添加することを可能にする。しかし、複数のサンプルを同時に測定するには不十分です。従来の_O2電極ベースの方法と比較して、細胞培養物または精製ミトコンドリアにおけるOCRに一般的に使用されるツールである細胞外フラックスアナライザーは、改善されたスループット15,18,20を提供する。それにもかかわらず、これらの方法はすべて、通常、単離されたミトコンドリアまたは細胞培養物6、¹⁶、¹⁷、^19、20、21におけるOCRを測定するために適用される。ミトコンドリアの単離は不注意による損傷を引き起こし、抽出されたミトコンドリアまたは細胞培養物は、無傷の脳スライス²²よりも生理学的関連性が低い。微小電極がスライスに使用される場合でも、それらは培養細胞²³よりも感度が低く、操作がより困難である。

これらの課題に対応するために、我々は、マウス24の急性線条体脳切片からの複数の代謝パラメータの分析を可能にする^XF24細胞外フラックスアナライザーを使用する方法を開発しました24。この技術は、OCRを介したミトコンドリア呼吸の連続的な直接定量化を提供する。要するに、線条体脳スライスの小さな切片が膵島プレートのウェルに入れられ、分析器は酸素およびプロトン蛍光ベースのバイオセンサーを使用してOCRおよび細胞外酸性化速度を測定する^17、21、25。

分析装置のユニークな特徴の1つは、最大4つの化合物または試薬を順次注入しながらOCRの継続的な測定を可能にする4つの注入ウェルです。これにより、基底ミトコンドリアOCR、ATP結合OCR、最大ミトコンドリアOCRなどのいくつかの細胞呼吸パラメータの測定が可能になります。ここに示したプロトコールの測定中に注入された化合物は、第1溶液ウェル(ポートA)における10mMピルビン酸、第2溶液ウェル(ポートB)における20μMオリゴマイシン、第3ウェル(ポートC)における10μMカルボニルシアン化4-(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン(FCCP)、および第4ウェル(ポートD)における20μMアンチマイシンAの作業濃度であり、 Fried et ^al.25に基づく。これらの濃度は作業濃度であり、10x、11x、12x、および13xのストック溶液がそれぞれ溶液ポートA〜Dに注入されたことに留意しなければならない。各溶液を使用する目的は以下の通りであった:1)ピルビン酸は、それがなければ、FCCPの添加は、利用可能な基質の制限によって引き起こされるOCR応答を低下させるので、必要であった。2)オリゴマイシンはATP合成酵素を阻害し、ATP結合呼吸の測定を可能にする。3)FCCPはリン酸化から酸化を結合解除し、最大ミトコンドリア容量の測定を可能にする。4)アンチマイシンAは、電子輸送鎖中の複合体IIIを阻害し、したがって、ミトコンドリアに連結されていないOCRの測定を可能にする。

使用したオリゴマイシンの濃度は、以下の理由に基づいて決定した:1)ほとんどの細胞型(単離されたミトコンドリアまたは細胞培養物)に対するオリゴマイシンの推奨用量は1.5μMである。経験から、通常、勾配がある可能性があるため、解離した細胞用量の3x〜10xがスライス実験に使用され、スライス内の溶液の浸透には時間がかかる。したがって、濃度は5 μM〜25 μMの範囲であるべきである2)Fried et ^{al.25に基づいて20} μM濃度が選択された。より高い濃度は、オリゴマイシンの非特異的毒性のために試みられなかった。3) Underwood et al.26による報告において、著者らはオリゴマイシンの滴定実験を行い、^6.25、12.5、25、および50μg/mLの用量が同様の抑制をもたらすことを見出した。高濃度のオリゴマイシン(50 μg/mL)はそれ以上阻害しなかったが、より大きな分散を有していた。4)我々の観察では、決定因子はオリゴマイシンの浸透能力であると思われる。オリゴマイシンが組織に浸透することは困難であり、それがプラトーに達するのに少なくとも7〜8サイクルかかる理由であり、最大の応答である。プラトーに達する限り、阻害は最大であると仮定される。

線条体スライスのOCRを測定するために細胞外フラックス分析装置を適応させる重要な技術的課題は、組織低酸素症を予防することです。バッファーは測定の全期間(約4時間)の間酸素化されなかったため、低酸素症が中心的な問題でした。これは、酸素がサンプル全体に拡散できない、より厚い組織サンプルに特に当てはまります。この問題を克服するために、周囲酸素が脳スライスの中央に浸透できるように、スライスを150μmの厚さで切片化した。さらに、4mg/mLのウシ血清アルブミン(BSA)を予め酸素化した人工脳脊髄液(ACSF)緩衝液に添加し、以前に示唆されたように、最大OCRの決定を容易にした²³。細胞が生きているかどうかを調べた。まず、ヘキスト33258(10 μM)およびヨウ化プロピジウム(10 μM)を使用して、これらの条件下で細胞が健康であるかどうかを調べました。次に、中程度の棘状ニューロンが機能的に健康であるかどうかをパッチクランプ記録を用いて調べた。我々はさらに、線条体スライス中のドーパミン(DA)末端が機能的に健全であるかどうかを、高速スキャンボルタンメトリーを用いてDA放出を測定することによって評価した。結果は、酸素化されていない線条体スライス(ACSF/BSA群)が酸素化対照群²⁴と同じくらい健康であることを示した。

次に、スライスの厚さとパンチサイズのさまざまな組み合わせをテストして、フラックス呼吸アッセイに最適な線条体スライス条件を決定しました。厚さ(150 μmおよび200 μm)およびパンチサイズ(直径1.0 mm、1.5 mm、および2.0 mm)の背側線条体スライスを、分析装置を使用したOCR分析に使用した。厚さ150μm、パンチサイズ1.5mmの線条体スライスは、結合効率が最も高く、OCRは分析器²⁴にとって最適な範囲内にあった。

プロトコル

動物作業を含むすべての手順は、国内および国際的なガイドラインに従って実施され、トーマスジェファーソン大学の動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。生後3~14ヶ月の雄性FVB/NTacマウスを用いた。次の手順は非滅菌設定で実行しましたが、すべてをできるだけ清潔に保つように注意する必要があります。

注:ここで紹介した方法は、Zhiらによって報告された研究で確立され、使用されました²⁴。ここで説明する実験では、タツノオトシゴXF24細胞外フラックス分析装置を使用しました( 材料表を参照)。これらの方法はXFe24アナライザーに適応させることができ、このアナライザーを使用していくつかの結果が確認されました。

1. ハイドレートカートリッジセンサー(アッセイの1日前)

1. 細胞外フラックスアッセイキットを開き( 材料表を参照)、センサーカートリッジ(緑色)とユーティリティプレート(透明; 図1A)。センサーカートリッジを脇に置き(センサーを上にして)、センサーに触れないでください。
2. 600 μL のキャリブラント溶液 (pH 7.4) をユーティリティプレートの各ウェルに加えます。センサーカートリッジをユーティリティプレートの上に置き、センサーをキャリブラント溶液に沈めます。ユーティリティプレートとセンサーカートリッジプレートの三角形の切り込みが正しく揃っていることを確認します(図1B)。
3. キャリブラント溶液の蒸発を防ぐために細胞外フラックスアッセイキットをシーリングフィルムで密封し、_CO2 または酸素を一晩補充しない37°Cのインキュベーターに入れます。

2.ティッシュプレートを準備する(アッセイ当日)

1. 膵島捕獲マイクロプレートを開き、組織座位用の膵島プレートを取り出す。
2. 予め酸素化された修飾人工脳脊髄液(ACSF、組成140 mM NaCl、2.5 mM KCl、2.4 mM CaCl 2、1.3 mM MgSO4、0.3 mM KH2 _PO4、₂₅mM グルコース、10 mM HEPES、pH 7.2)緩衝液を50 mLチューブ中で37°Cに適量(1ウェルあたり625 μL)を温める。その後、BSAを終濃度4mg/mLとなるように添加し、呼吸バッファーを調製した。一般に、1枚のプレートには50mLで十分です。
3. 625 μL の呼吸バッファー (25 mM グルコースと 4 mg/mL BSA を含む事前酸素化 ACSF バッファー) を膵島プレートの各ウェルに慎重に加え、プレートの振れを避けます。センサーカートリッジの上に残留滴がなく、各ウェルのバッファーに気泡がないことを確認します。

3. 急性線条体スライス調製および切除スライス配置

1. 子宮頸部脱臼後にマウスを断頭し、直ちに10 mLの氷冷予備酸素切断溶液(125 mM NaCl、2.5 mM KCl、26 mM NaHCO 3、3.7 mM_MgSO4、_0.3 mM_KH2PO 4、10 mM グルコース、pH_7.4)で脳を解剖する。
2. 氷冷、予備酸素化切断溶液中で厚さ150μmで、製造業者の指示( 材料表を参照)に従ってビブラトームを有する冠状動脈線条体スライスを切除する。
3. スライスを50 mLの酸素化ACSF(125 mM NaCl、2.5 mM KCl、26 mM NaHCO 3、2.4 mM CaCl 2、1.3 mM MgSO4、_0.3 mM_KH2PO 4、10 mM グルコース、₂ mM HEPES、pH_7.4)で回収し、室温(RT)で最大30分間溶液中に保管します。
4. 回収後、スライスを5 mLの呼吸バッファーを含む35 mm x 10 mmのシャーレに移します。
5. ステンレス製の生検パンチ(例えば、直径1.5mm)を使用して、スライスされた脳の所望の領域に円形の組織片を作成する。スライスをバッファーに入れたまま、パンチで静かに押し下げます。パンチが組織を切断するのに十分なほど強く押し下げられていることを確認してください。残りの組織を取り出し、パンチを持ち上げて、円形の組織片をバッファーに取り除きます。
6. 1 mL のピペットチップの端を切断して直径 1.5 ~ 2.0 mm の穴を開け、それを使用してパンチしたスライスを保持し、キャプチャ画面の上部に移します。打ち抜かれた脳組織を1枚吸引し、キャプチャ画面のメッシュ側に組織を慎重に配置します(図2A)。キャプチャ画面は、片側にメッシュが取り付けられた円形のプラスチック片になります。
   注:キャプチャスクリーンはマイクロプレートパックに含まれており(材料表を参照)、Schuh et al.23で使用されているものと似ています。
7. 紙のティッシュをそっと使用して、キャプチャ画面を少し乾かします。水分を除去すると、組織は粘着性になり、スライスがメッシュの中心に付着することを可能にする。スライスを乾燥させすぎないでください、さもなければ、それは損傷するでしょう。
8. ピンセットでキャプチャスクリーンスライスを側面から下向きにし、インキュベート膵島プレートのウェルの1つに置きます(図2B)。スライスを落とさないように注意してください。その場合は、画面を取り出し、その上に新しいスライスを配置します。
   注:膵島プレートの2つのバックグラウンド補正ウェル(A1およびD6)に脳スライスを配置しないでください。
9. アッセイを実行する前に、温度およびpH平衡を可能にするために、インキュベーター内で37°Cで膵島プレートを少なくとも30分間インキュベートする。

4. 所望の化合物を含むカートリッジの装填

1. 修飾ACSF(37°C)中で目的化合物を、ポートA〜Dの作業濃度のそれぞれ10x、11x、12x、および13xの最終ストック濃度に希釈し、pH7.4に調整する。試験は、ポートAからDへの順序で化合物を投与する。この実験では、10 mM ピルビン酸 (ポート A)、20 μM オリゴマイシン (ポート B)、10 μM または他の濃度の FCCP (ポート C)、および 20 μM アンチマイシン A (ポート D) のそれぞれの作業濃度で、以下の溶液を使用しました。
2. 希釈化合物 75 μL をセンサーカートリッジの適切な注入口に穏やかにプリロードします。先端を注入ポートの壁に当てて、先端を45°の角度で注入ポートの途中まで置きます。チップは、ポートを介して化合物漏れを引き起こす可能性があるため、注入ポートの底部に完全に挿入しないでください。
3. 気泡が発生しないように、ポートからチップを慎重に引き出します。気泡を緩和しないように、カートリッジのどの部分も叩かないでください。
4. インジェクションポートに均一な負荷がかかっているかどうかを目視で確認します。すべての液体がポートにあり、カートリッジの上部に残留滴がないことを確認します。
5. センサーカートリッジをユーティリティプレートに置き、インキュベーター(非_CO2)に30分間入れて、再び37°Cまで加熱できるようにします。ユーティリティプレートにつかまるだけで慎重に取り扱います。できるだけ動かないようにします。

5. キャリブレーションとアッセイの実行

1. アッセイテンプレートをソフトウェアにロードします。緑色の スタート ボタンを押します。
2. 必ず正しいプロトコルをロードしてください。このプロトコルには、3 分間のミックス、3 分間の待機、および 2 分間の測定シーケンスの組み合わせが含まれています (これらの 3 つのステップは 1 つの測定を形成します)。計測器設定²⁵のハードウェア設定でプローブヘッドの距離を26,600から27,800に変更します。XFe24アナライザーのプローブヘッドを変更する必要はありません。 スタートを押します。
3. ユーティリティプレートのセンサーカートリッジを計器トレイにセットします。ノッチは正面の左隅にあります。プレートが正しく取り付けられ、平らであることを確認します。薬物で満たされたセンサーカートリッジを分析装置にセットして校正します。
4. 画面の指示に従って、センサーを校正および平衡化します。これには約30分かかります。
5. キャリブレーションステップが完了したら、キャリブレーションプレートを取り外し、アイソレットプレート(メッシュとティッシュスライスを含む)と交換します。
6. アッセイプロトコルを用いてプレートの各ウェルにおける酸素消費量を測定する。このプロトコルには、3 分間のミックス、3 分間の待機、および 2 分間の測定シーケンス (これらの 3 つのステップが 1 つの測定を形成する) の組み合わせが含まれており、その時点で OCR が計算されます。
7. 実験全体について、ベースラインを作成するための4倍のOCR測定を含め、続いてポートA(ピルビン酸)を4倍の測定値で注入し、次にポートB(オリゴマイシン)を8倍の測定値で注入し、次にポートC(FCCP)を5倍の測定値で注入し、最後にポートD(アンチマイシンA)を6倍の測定値で注入する。
   注:各化合物注入後のこの測定回数は、測定がプラトーに達したときに応じて決定されます。
8. OCR測定データと結合効率データを分析します。

結果

この研究の最初のステップは、スライスから線条体のセクションを切り取るために使用されるスライスの厚さとパンチサイズを最適化することでした(図3A)。厚さ150μmのスライスと1.5mmのパンチサイズは、カップリング効率によって決定される最良の結果をもたらしました(図3B-C)。図3Bに示すように、O...

ディスカッション

私たちが開発した方法では、XFアナライザーを使用して、成体マウスの線条体スライスのOCRを4時間の期間にわたって測定することができました。この方法は、解剖学的に定義された脳構造から切り取られたパンチにおける細胞生体エネルギーを測定する新しい方法を提供する。分析される組織サンプルはかなり小さいので、疾患に関与する特定の脳領域の代謝パラメータを調査することがで?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accumet AB150 pH benchtop meter	Thermo Fisher Scientific	13-636-AB150	To measure pH
Antimycin A from streptomyces sp.	SIGMA	A8674	To inhibit complex III of the mitochondria
Bovine Serum Albumin (BSA)	SIGMA	A6003	To make modified artificial cerebrospinal fluid (BSA-ACSF)
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)	SIGMA	C2920	To uncouple mitochondrial respiration
D-Glucose	SIGMA	G8270	To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF)
DMSO	SIGMA	D8418	To dissovle compounds
HEPES	SIGMA	H3375	To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF)
Humidified non-CO2 incubator	Fisher Scientific	11-683-230D	To hydrate plates at 37 °C
Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes	SIGMA	O4876	To inhibit mitochondrial ATP synthase
Parafilm	SIGMA-ALDRICH		sealing film
Rotenone	Tocris	3616	To inhibit complex I of the mitochondria
Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL	Seahorse Bioscience	103681-100	Solution for seahorse calibration
Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer	Seahorse Bioscience		Equipment used to analyze oxygen consumption rate, old generation
Seahorse XFe24 Extracellular Flux Analyzer	Seahorse Bioscience		Equipment used to analyze oxygen consumption rate, new generation
Seahorse XF24 FluxPaks	Seahorse Bioscience	101174-100	Package of flux analyzer sensor cartridges, tissue culture plates, capture screens,  calibrant solution and calibration plates; assay kit.
Sodium pyruvate	SIGMA	P2256	To prevent any substrate-limiting constraints of substrate supply
Stainless steel biopsy punches	Miltex		Device used to punch slices
Sterile cell culture dish, 35 x 10 mm	Eppendrof	0030700102	Used for slice punch
Vibratome	Leica	VT1200	To slice brain tissue
Water bath	Thermo Scientific Precision	282-115	To heat buffer and solutions