Misurazione del tasso di consumo di ossigeno nelle fette striatali acute di topi adulti

Riepilogo

Il tasso di consumo di ossigeno (OCR) è un proxy comune per la funzione mitocondriale e può essere utilizzato per studiare diversi modelli di malattia. Abbiamo sviluppato un nuovo metodo utilizzando un analizzatore Seahorse XF per misurare direttamente l'OCR in fette striatal acute di topi adulti che è più fisiologicamente rilevante rispetto ad altri metodi.

Abstract

I mitocondri svolgono un ruolo importante nella produzione cellulare di ATP, nella regolazione delle specie reattive dell'ossigeno e nel controllo della concentrazione^{di Ca 2} +. La disfunzione mitocondriale è stata implicata nella patogenesi di più malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Parkinson (PD), la malattia di Huntington e il morbo di Alzheimer. Per studiare il ruolo dei mitocondri nei modelli di queste malattie, possiamo misurare la respirazione mitocondriale attraverso il tasso di consumo di ossigeno (OCR) come proxy per la funzione mitocondriale. L'OCR è già stato misurato con successo in colture cellulari e mitocondri isolati. Tuttavia, queste tecniche sono meno fisiologicamente rilevanti rispetto alla misurazione dell'OCR in fette di cervello acute. Per superare questa limitazione, gli autori hanno sviluppato un nuovo metodo utilizzando un analizzatore Seahorse XF per misurare direttamente l'OCR in fette striatali acute di topi adulti. La tecnica è ottimizzata con particolare attenzione allo striato, un'area del cervello coinvolta nel PD e nella malattia di Huntington. L'analizzatore esegue un test di cellule vive utilizzando una piastra a 24 pozzetti, che consente la misurazione cinetica simultanea di 24 campioni. Il metodo utilizza pezzi circolari di fette di cervello striatale come campioni. Dimostriamo l'efficacia di questa tecnica identificando un OCR basale inferiore in fette striatali di un modello murino di PD. Questo metodo sarà di ampio interesse per i ricercatori che lavorano nel campo del PD e della Malattia di Huntington.

Introduzione

La disfunzione mitocondriale è stata implicata in diverse malattie neurologiche, tra cui il morbo di Parkinson (PD), la malattia di Huntington e il morbo di Alzheimer ^1,2,3. I modelli PD come i topi e i ratti PINK1 knockout (KO) mostrano una funzione mitocondriale compromessa 4,5,6,7,8,9,10,11. I mitocondri isolati dallo striato (STR) o dall'intero cervello del topo PINK1 KO invecchiato presentano difetti nel complesso I 7,10,12,13. La misurazione diretta del tasso di consumo di ossigeno (OCR) è uno dei metodi più comuni per valutare la funzione mitocondriale poiché l'OCR è accoppiato con la produzione di ATP, la funzione principale dei mitocondri¹⁴. Pertanto, la misurazione dell'OCR in modelli di malattia o campioni / tessuti derivati dal paziente può aiutare a indagare su come la disfunzione mitocondriale porta alla malattia.

Attualmente, ci sono diversi modi per misurare l'OCR mitocondriale, tra cui l'elettrodo clark e altri elettrodi O₂, il colorante fluorescente O₂ e l'analizzatore di flusso extracellulare ^{15,16,17,18,19}. Come vantaggio, i metodi basati su elettrodi O₂ consentono di aggiungere facilmente vari substrati. Tuttavia, sono insufficienti per misurare contemporaneamente più campioni. Rispetto ai tradizionali metodi basati su elettrodi O₂, l'analizzatore di flusso extracellulare, uno strumento comunemente usato per l'OCR in colture cellulari o mitocondri purificati, offre una produttività migliorata 15,18,20. Tuttavia, tutti questi metodi sono solitamente applicati per misurare l'OCR in mitocondri isolati o colture cellulari 6,16,17,19,20,21. L'isolamento dei mitocondri provoca danni involontari e i mitocondri estratti o le colture cellulari sono meno fisiologicamente rilevanti delle fette di cervello intatte²². Anche quando i microelettrodi sono usati nelle fette, sono meno sensibili e più difficili da usare rispetto alle cellule coltivate²³.

Per affrontare queste sfide, abbiamo sviluppato un metodo utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare XF24, che consente l'analisi di più parametri metabolici da fette di cervello striatale acuto di topi²⁴. Questa tecnica fornisce una quantificazione diretta continua della respirazione mitocondriale tramite l'OCR. In breve, piccole sezioni di fette di cervello striatale vengono collocate in pozzetti della piastra isolotta e l'analizzatore utilizza biosensori a base di ossigeno e protoni fluorescenti per misurare l'OCR e il tasso di acidificazione extracellulare, rispettivamente 17,21,25.

Una delle caratteristiche uniche dell'analizzatore sono i quattro pozzetti di iniezione, che consentono la misurazione continua dell'OCR mentre iniettano sequenzialmente fino a quattro composti o reagenti; ciò consente la misurazione di diversi parametri di respirazione cellulare, come l'OCR mitocondriale basale, l'OCR legato all'ATP e l'OCR mitocondriale massimale. I composti iniettati durante le misurazioni per il protocollo qui mostrato erano concentrazioni di lavoro di 10 mM di piruvato nel primo pozzo di soluzione (porta A), 20 μM di oligomicina nel secondo pozzo di soluzione (porta B), 10 μM di carbonil cianuro 4-(trifluorometossi) fenilidrazone (FCCP) nel terzo pozzo (porta C) e 20 μM di antimicina A nel quarto pozzo (porta D), basato su Fried et ^al.25. Va notato che queste concentrazioni erano concentrazioni di lavoro e soluzioni stock di 10x, 11x, 12x e 13x sono state iniettate nelle porte della soluzione da A a D, rispettivamente. Lo scopo dell'utilizzo di ciascuna soluzione era il seguente: 1) Il piruvato era necessario poiché, senza di esso, l'aggiunta di FCCP avrebbe una diminuzione della risposta OCR causata da una limitazione dei substrati disponibili; 2) L'oligomicina inibisce l'ATP sintasi e consente la misurazione della respirazione legata all'ATP; 3) FCCP sgancia l'ossidazione da fosforilazione e permette la misura della massima capacità mitocondriale; 4) L'antimicina A inibisce il complesso III nella catena di trasporto degli elettroni e, quindi, permette la misurazione dell'OCR non legato ai mitocondri.

La concentrazione di oligomicina utilizzata è stata determinata in base ai seguenti motivi: 1) La dose raccomandata di oligomicina per la maggior parte dei tipi di cellule (mitocondri isolati o colture cellulari) è di 1,5 μM. Per esperienza, di solito 3x-10x della dose di cellule dissociate viene utilizzata per gli esperimenti di fetta poiché potrebbe esserci un gradiente e la penetrazione della soluzione nelle fette richiede tempo. Pertanto, la concentrazione dovrebbe essere compresa tra 5 μM e 25 μM. 2) Una concentrazione di 20 μM è stata selezionata sulla base di Fried et ^al.25. Non sono state provate concentrazioni più elevate a causa della tossicità non specifica dell'oligomicina. 3) Nel rapporto di Underwood et ^al.26, gli autori hanno fatto un esperimento di titolazione per l'oligomicina e hanno scoperto che le dosi a 6,25, 12,5, 25 e 50 μg / mL hanno provocato un'inibizione simile. La maggiore concentrazione di oligomicina (50 μg/mL) non ha inibito di più, ma ha avuto una maggiore varianza. 4) Nella nostra osservazione, il fattore determinante sembra essere la capacità penetrante dell'oligomicina. È difficile per l'oligomicina penetrare nel tessuto, ed è per questo che ci vogliono almeno 7-8 cicli per raggiungere il plateau, la risposta massima. Finché raggiunge l'altopiano, si presume che l'inibizione sia massima.

Una sfida tecnica chiave per adattare l'analizzatore di flusso extracellulare per misurare l'OCR nelle fette striatali è prevenire l'ipossia tissutale. Poiché il tampone non è stato ossigenato durante l'intera durata delle misurazioni (circa 4 ore), l'ipossia era un problema centrale. Ciò è particolarmente vero per i campioni di tessuto più spesso, dove l'ossigeno non può diffondersi in tutti i campioni. Per superare questo problema, le fette sono state sezionate a 150 μm di spessore, in modo che l'ossigeno ambientale potesse penetrare nel mezzo delle fette di cervello. Inoltre, 4 mg/mL di albumina sierica bovina (BSA) sono stati aggiunti al tampone del liquido cerebrospinale artificiale pre-ossigenato (ACSF), che ha facilitato la determinazione dell'OCR massimale, come precedentemente suggerito²³. Abbiamo esaminato se le cellule erano vive. In primo luogo, Hoechst 33258 (10 μM) e ioduro di propidio (10 μM) sono stati utilizzati per esaminare se le cellule erano sane in queste condizioni. Abbiamo quindi esaminato se i neuroni spinosi medi fossero funzionalmente sani usando la registrazione patch-clamp. Abbiamo inoltre valutato se i terminali della dopamina (DA) nelle fette striatali fossero funzionalmente sani misurando il rilascio di DA utilizzando la voltammetria a scansione rapida. I risultati hanno mostrato che le fette striatali che non erano ossigenate (gruppo ACSF / BSA) erano sane come il gruppo di controllo ossigenato²⁴.

Abbiamo quindi testato diverse combinazioni di spessore della fetta e dimensione del punzone per determinare le condizioni ottimali della fetta striatale per il test di respirazione del flusso. Per l'analisi OCR sono state utilizzate fette striatali dorsali con diversi spessori (150 μm e 200 μm) e punzonature (1,0 mm, 1,5 mm e 2,0 mm di diametro). Le fette striatali spesse 150 μm con una dimensione del punzone di 1,5 mm di diametro avevano la massima efficienza di accoppiamento e OCR entro un intervallo ottimale per l'analizzatore²⁴.

Protocollo

Tutte le procedure, compreso il lavoro sugli animali, sono state condotte secondo le linee guida nazionali e internazionali e sono state approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali della Thomas Jefferson University. Sono stati utilizzati topi FVB/NTac maschi all'età di 3-14 mesi. I seguenti passaggi sono stati eseguiti in un ambiente non sterile, ma è necessario prestare attenzione per mantenere tutto il più pulito possibile.

NOTA: Il metodo qui presentato è stato stabilito e utilizzato nella ricerca riportata da Zhi et ^al.24. Gli esperimenti qui descritti hanno utilizzato un analizzatore di flusso extracellulare Seahorse XF24 (vedi Tabella dei materiali). Questi metodi possono essere adattati per l'analizzatore XFe24 e alcuni risultati sono stati confermati utilizzando questo analizzatore.

1. Sensori a cartuccia idrata (1 giorno prima del test)

1. Aprire il kit di analisi del flusso extracellulare (vedere Tabella dei materiali) e rimuovere sia la cartuccia del sensore (verde) che la piastra di utilità (trasparente; Figura 1A). Posizionare la cartuccia del sensore da parte (sensori verso l'alto) e non toccare i sensori.
2. Aggiungere 600 μL di soluzione calibrante (pH 7,4) a ciascun pozzetto della piastra di utilità. Posizionare la cartuccia del sensore sulla parte superiore della piastra di utilità e immergere i sensori nella soluzione calibrante. Assicurarsi che la tacca triangolare dell'utilità e la piastra della cartuccia del sensore siano allineate correttamente (Figura 1B).
3. Sigillare il kit di analisi del flusso extracellulare con un film sigillante per evitare l'evaporazione della soluzione di calibrante, quindi posizionarlo in un incubatore a 37 °C non integrato con CO₂ o ossigeno durante la notte.

2. Preparare la piastra del tessuto (il giorno del test)

1. Aprire la micropiastra di cattura dell'isolotto ed estrarre la piastra dell'isolotto per la seduta del tessuto.
2. Riscaldare un volume appropriato (625 μL per pozzetto) di liquido cerebrospinale artificiale modificato pre-ossigenato (ACSF, composizione 140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2,4 mM CaCl₂, 1,3 mM MgSO₄, 0,3 mM KH₂PO₄, 25 mM glucosio, 10 mM HEPES, pH 7,2) tampone a 37 °C in un tubo da 50 mL. Quindi aggiungere BSA a una concentrazione finale di 4 mg / mL per preparare il tampone respiratorio. In generale, 50 ml sono sufficienti per un piatto.
3. Aggiungere 625 μL di tampone respiratorio (tampone ACSF preossigenato con 25 mM di glucosio e 4 mg/mL BSA) a ciascun pozzetto della piastra insulare con attenzione ed evitare di agitare la piastra. Assicurarsi che non ci siano gocce residue sulla parte superiore della cartuccia del sensore e che non siano presenti bolle d'aria nel buffer di ciascun pozzetto.

3. Preparazione acuta della fetta striatale e posizionamento della fetta asportata

1. Decapitare il topo dopo la lussazione cervicale e sezionare immediatamente il cervello in 10 mL di soluzione di taglio pre-ossigenata ghiacciata (125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO₃, 3,7 mM MgSO₄, 0,3 mM KH₂PO₄, 10 mM glucosio, pH 7,4).
2. Sezioni di fette striatal coronali con un vibratoma seguendo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali) ad uno spessore di 150 μm in soluzione di taglio preossigenata ghiacciata.
3. Recuperare le fette in 50 mL di ACSF ossigenato (125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO₃, 2,4 mM CaCl₂, 1,3 mM MgSO₄, 0,3 mM KH₂PO₄, 10 mM glucosio, 2 mM HEPES, pH 7,4) e conservare in soluzione fino a 30 minuti a temperatura ambiente (RT).
4. Dopo il recupero, trasferire le fette in una capsula di Petri da 35 mm x 10 mm con 5 ml di tampone respiratorio.
5. Utilizzare un punzone bioptico in acciaio inossidabile (ad esempio, diametro 1,5 mm) per creare un pezzo circolare di tessuto nell'area desiderata del cervello affettato. Tenere la fetta nel tampone mentre si preme delicatamente verso il basso con il punzone. Assicurati che il pugno sia spinto verso il basso abbastanza forte da tagliare il tessuto. Rimuovere il resto del tessuto, sollevare il pugno e rimuovere il pezzo circolare di tessuto nel tampone.
6. Tagliare l'estremità di una punta della pipetta da 1 mL per praticare un foro con un diametro di 1,5-2,0 mm e utilizzarlo per tenere e trasferire la fetta perforata nella parte superiore dello schermo di acquisizione. Aspirare un pezzo di tessuto cerebrale perforato e posizionare con attenzione il tessuto sul lato mesh dello schermo di cattura (Figura 2A). Lo schermo di cattura sarà un pezzo circolare di plastica con la rete attaccata a un lato.
   NOTA: Le schermate di cattura sono incluse nel pacchetto micropiastra (vedi Tabella dei materiali) e sono simili a quella utilizzata in Schuh et ^al.23.
7. Utilizzare delicatamente un fazzoletto di carta per asciugare brevemente lo schermo di acquisizione. Con l'umidità rimossa, il tessuto diventa appiccicoso, il che consente alla fetta di attaccarsi al centro della rete. Non asciugare troppo la fetta perché, altrimenti, risulterà danneggiata.
8. Tenere la fetta dello schermo di acquisizione con una pinzetta e posizionarla in uno dei pozzetti della piastra dell'isolotto in incubazione (Figura 2B). Fare attenzione a non far cadere la fetta; in tal caso, estrarre lo schermo e posizionare una nuova fetta su di esso.
   NOTA: non posizionare fette di cervello nei due pozzetti di correzione dello sfondo (A1 e D6) nella piastra dell'isolotto.
9. Incubare la piastra dell'isolotto a 37 °C in un incubatore per almeno 30 minuti per consentire l'equilibrio della temperatura e del pH prima di eseguire il test.

4. Caricamento delle cartucce con i composti desiderati

1. Diluire i composti desiderati in ACSF modificato (37 °C) alla concentrazione finale di stock di 10x, 11x, 12x e 13x della concentrazione di lavoro per le porte da A a D, rispettivamente, e regolare a pH 7,4. Il test somministrerà i composti in ordine dalla porta A alla D. Per questo esperimento sono state utilizzate le seguenti soluzioni, con la rispettiva concentrazione di lavoro menzionata prima di loro: 10 mM piruvato (porta A), 20 μM oligomicina (porta B), 10 μM o altre concentrazioni di FCCP (porta C) e 20 μM di antimicina A (porta D).
2. Precaricare delicatamente 75 μL dei composti diluiti nelle apposite porte di iniezione della cartuccia del sensore. Posizionare le punte a metà delle porte di iniezione con un angolo di 45° con la punta contro la parete della porta di iniezione. Le punte non devono essere inserite completamente nella parte inferiore delle porte di iniezione in quanto ciò potrebbe causare perdite di composti attraverso la porta.
3. Prelevare accuratamente le punte dalle porte per evitare di creare bolle d'aria. Non toccare alcuna parte della cartuccia per evitare di alleviare le bolle d'aria.
4. Ispezionare visivamente le porte di iniezione per un caricamento uniforme. Assicurarsi che tutto il liquido sia nella porta e che non siano presenti gocce residue sulla parte superiore della cartuccia.
5. Posizionare la cartuccia del sensore sulla piastra di utilità e metterla in un incubatore (non CO₂) per 30 minuti per consentirle di riscaldarsi nuovamente fino a 37 °C. Maneggiare con cura tenendo solo la piastra di utilità. Muoviti il meno possibile.

5. Calibrazione ed esecuzione del test

1. Caricare il modello di analisi nel software. Premere il tasto verde START .
2. Assicurati di caricare il protocollo corretto. Il protocollo contiene una combinazione di 3 min di mix, 3 min di attesa e 2 min di sequenze di misura (questi tre passaggi formano una misura). Modificare la distanza della testa della sonda da 26.600 a 27.800 nelle impostazioni hardware nelle impostazioni dello strumento²⁵. Non è necessario cambiare la testa della sonda per l'analizzatore XFe24. Premere START.
3. Caricare la cartuccia del sensore sulla piastra di utilità nel vassoio dello strumento. La tacca va nella parte anteriore, angolo sinistro. Assicurarsi che la piastra si trovi correttamente e sia piatta. Caricare la cartuccia del sensore riempita di farmaco nell'analizzatore per la calibrazione.
4. Seguire le istruzioni visualizzate sullo schermo per calibrare ed equilibrare i sensori. Questo richiede circa 30 minuti.
5. Una volta terminata la fase di calibrazione, rimuovere la piastra di calibrazione e sostituirla con la piastra dell'isolotto (contenente le fette di rete e tessuto).
6. Misurare il consumo di ossigeno in ciascun pozzetto della piastra utilizzando i protocolli di analisi. Il protocollo contiene una combinazione di 3 min di mix, 3 min di attesa e 2 min di sequenze di misura (questi tre passaggi formano una misurazione), a quel punto viene calcolato l'OCR.
7. Per l'intero esperimento, includere 4x misurazioni OCR per creare una linea di base, seguita dall'iniezione della porta A (piruvato) con misurazioni 4x, quindi l'iniezione della porta B (oligomicina) con misurazioni 8x, quindi l'iniezione della porta C (FCCP) con misurazioni 5x e, infine, l'iniezione della porta D (antimicina A) con misurazioni 6x.
   NOTA: questo numero di misurazioni dopo ogni iniezione di composto viene determinato in base a quando la misurazione raggiunge il plateau.
8. Analizzare i dati di misura OCR e i dati di efficienza di accoppiamento.

Risultati

Il primo passo di questo studio è stato quello di ottimizzare lo spessore della fetta e la dimensione del punzone utilizzati per asportare una sezione dello striato dalla fetta (Figura 3A). Una fetta di spessore di 150 μm e una dimensione del punzone di 1,5 mm hanno dato i migliori risultati determinati dall'efficienza di accoppiamento (Figura 3B-C). Come mostrato nella Figura 3B, l'OCR è relativ...

Discussione

Il metodo che abbiamo sviluppato ha permesso di utilizzare un analizzatore XF per misurare l'OCR in fette striatali di topi adulti in un arco di tempo di 4 ore. Questo metodo fornisce un nuovo modo per misurare la bioenergetica cellulare in pugni asportati da strutture cerebrali anatomicamente definite. Poiché i campioni di tessuto analizzati sono piuttosto piccoli, è possibile studiare i parametri metabolici di specifiche aree cerebrali coinvolte in una malattia. Inoltre, l'uso di fette acute imita più da vicino l'am...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accumet AB150 pH benchtop meter	Thermo Fisher Scientific	13-636-AB150	To measure pH
Antimycin A from streptomyces sp.	SIGMA	A8674	To inhibit complex III of the mitochondria
Bovine Serum Albumin (BSA)	SIGMA	A6003	To make modified artificial cerebrospinal fluid (BSA-ACSF)
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)	SIGMA	C2920	To uncouple mitochondrial respiration
D-Glucose	SIGMA	G8270	To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF)
DMSO	SIGMA	D8418	To dissovle compounds
HEPES	SIGMA	H3375	To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF)
Humidified non-CO2 incubator	Fisher Scientific	11-683-230D	To hydrate plates at 37 °C
Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes	SIGMA	O4876	To inhibit mitochondrial ATP synthase
Parafilm	SIGMA-ALDRICH		sealing film
Rotenone	Tocris	3616	To inhibit complex I of the mitochondria
Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL	Seahorse Bioscience	103681-100	Solution for seahorse calibration
Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer	Seahorse Bioscience		Equipment used to analyze oxygen consumption rate, old generation
Seahorse XFe24 Extracellular Flux Analyzer	Seahorse Bioscience		Equipment used to analyze oxygen consumption rate, new generation
Seahorse XF24 FluxPaks	Seahorse Bioscience	101174-100	Package of flux analyzer sensor cartridges, tissue culture plates, capture screens,  calibrant solution and calibration plates; assay kit.
Sodium pyruvate	SIGMA	P2256	To prevent any substrate-limiting constraints of substrate supply
Stainless steel biopsy punches	Miltex		Device used to punch slices
Sterile cell culture dish, 35 x 10 mm	Eppendrof	0030700102	Used for slice punch
Vibratome	Leica	VT1200	To slice brain tissue
Water bath	Thermo Scientific Precision	282-115	To heat buffer and solutions