Medición de la tasa de consumo de oxígeno en rodajas estriatales agudas de ratones adultos

Resumen

La tasa de consumo de oxígeno (OCR) es un indicador común de la función mitocondrial y se puede utilizar para estudiar diferentes modelos de enfermedades. Desarrollamos un nuevo método utilizando un analizador Seahorse XF para medir directamente el OCR en rodajas estriatales agudas de ratones adultos que es más relevante fisiológicamente que otros métodos.

Resumen

Las mitocondrias juegan un papel importante en la producción celular de ATP, la regulación de especies reactivas de oxígeno y^{el control de la} concentración de Ca 2+. La disfunción mitocondrial se ha implicado en la patogénesis de múltiples enfermedades neurodegenerativas, incluida la enfermedad de Parkinson (EP), la enfermedad de Huntington y la enfermedad de Alzheimer. Para estudiar el papel de las mitocondrias en los modelos de estas enfermedades, podemos medir la respiración mitocondrial a través de la tasa de consumo de oxígeno (OCR) como un proxy de la función mitocondrial. El OCR ya se ha medido con éxito en cultivos celulares, así como en mitocondrias aisladas. Sin embargo, estas técnicas son menos relevantes fisiológicamente que la medición de OCR en cortes cerebrales agudos. Para superar esta limitación, los autores desarrollaron un nuevo método utilizando un analizador Seahorse XF para medir directamente el OCR en cortes estriatales agudos de ratones adultos. La técnica está optimizada con un enfoque en el cuerpo estriado, un área del cerebro involucrada en la EP y la enfermedad de Huntington. El analizador realiza un ensayo de células vivas utilizando una placa de 24 pocillos, que permite la medición cinética simultánea de 24 muestras. El método utiliza piezas perforadas circularmente de cortes de cerebro estriatal como muestras. Demostramos la efectividad de esta técnica mediante la identificación de un OCR basal inferior en rodajas estriatales de un modelo de ratón de EP. Este método será de amplio interés para los investigadores que trabajan en el campo de la EP y la enfermedad de Huntington.

Introducción

La disfunción mitocondrial se ha implicado en varias enfermedades neurológicas, incluida la enfermedad de Parkinson (EP), la enfermedad de Huntington y la enfermedad de Alzheimer ^1,2,3. Los modelos de DP como los ratones y ratas PINK1 knockout (KO) muestran una función mitocondrial deteriorada ^{4,5,6,7,8,9,10,11}. Las mitocondrias aisladas del cuerpo estriado (STR) o del cerebro entero del ratón PINK1 KO envejecido presentan defectos en el complejo I 7,10,12,13. La medición directa de la tasa de consumo de oxígeno (OCR) es uno de los métodos más comunes para evaluar la función mitocondrial, ya que la OCR se combina con la producción de ATP, la función principal de las mitocondrias¹⁴. Por lo tanto, medir el OCR en modelos de enfermedad o muestras / tejidos derivados del paciente puede ayudar a investigar cómo la disfunción mitocondrial conduce a la enfermedad.

Actualmente, hay varias formas de medir el OCR mitocondrial, incluido el electrodo Clark y otros electrodos O₂, el tinte fluorescente O₂ y el analizador de flujo extracelular 15,16,17,18,19. Como ventaja, los métodos basados en electrodos O₂ permiten agregar fácilmente varios sustratos. Sin embargo, son insuficientes para medir simultáneamente varias muestras. En comparación con los métodos tradicionales basados en electrodos de O₂, el analizador de flujo extracelular, una herramienta comúnmente utilizada para OCR en cultivos celulares o mitocondrias purificadas, ofrece un rendimiento mejorado 15,18,20. Sin embargo, todos estos métodos se suelen aplicar para medir el OCR en mitocondrias aisladas o cultivos celulares 6,16,17,19,20,21. El aislamiento de las mitocondrias causa daños inadvertidos, y las mitocondrias extraídas o los cultivos celulares son menos relevantes fisiológicamente que las rebanadas cerebrales intactas²². Incluso cuando se utilizan microelectrodos en rodajas, son menos sensibles y más difíciles de operar que en células cultivadas²³.

Para enfrentar estos desafíos, desarrollamos un método utilizando el analizador de flujo extracelular XF24, que permite el análisis de múltiples parámetros metabólicos a partir de cortes cerebrales estriatales agudos de ratones²⁴. Esta técnica proporciona una cuantificación directa continua de la respiración mitocondrial a través del OCR. En resumen, pequeñas secciones de rebanadas de cerebro estriatal se colocan en los pocillos de la placa de los islotes, y el analizador utiliza biosensores basados en oxígeno y protones fluorescentes para medir la tasa de OCR y acidificación extracelular, respectivamente 17,21,25.

Una de las características únicas del analizador son los cuatro pozos de inyección, que permiten la medición continua de OCR mientras se inyecta secuencialmente hasta cuatro compuestos o reactivos; esto permite la medición de varios parámetros de respiración celular, como el OCR mitocondrial basal, el OCR ligado al ATP y el OCR mitocondrial máximo. Los compuestos inyectados durante las mediciones para el protocolo que se muestra aquí fueron concentraciones de trabajo de piruvato de 10 mM en el primer pozo de solución (puerto A), 20 μM de oligomicina en el segundo pozo de solución (puerto B), 10 μM de cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP) en el tercer pozo (puerto C), y 20 μM de antimicina A en el cuarto pozo (puerto D), basado en Fried et ^al.25. Cabe señalar que estas concentraciones eran concentraciones de trabajo, y las soluciones madre de 10x, 11x, 12x y 13x se inyectaron en los puertos de solución A a D, respectivamente. El propósito de usar cada solución fue el siguiente: 1) El piruvato era necesario ya que, sin él, la adición de FCCP tendría una respuesta de OCR disminuida causada por una limitación de los sustratos disponibles; 2) La oligomicina inhibe la ATP sintasa y permite la medición de la respiración ligada al ATP; 3) FCCP desacopla la oxidación de la fosforilación y permite la medición de la capacidad mitocondrial máxima; 4) La antimicina A inhibe el complejo III en la cadena de transporte de electrones y, por lo tanto, permite la medición de OCR no vinculado a las mitocondrias.

La concentración de oligomicina utilizada se determinó en base a las siguientes razones: 1) La dosis recomendada de oligomicina para la mayoría de los tipos celulares (mitocondrias aisladas o cultivos celulares) es de 1,5 μM. Por experiencia, generalmente se usan 3x-10x de la dosis de células disociadas para los experimentos de rebanadas, ya que puede haber un gradiente, y la penetración de la solución en las rebanadas lleva tiempo. Por lo tanto, la concentración debe estar en el rango de 5 μM a 25 μM. 2) Se seleccionó una concentración de 20 μM basada en Fried et ^al.25. No se probaron concentraciones más altas debido a la toxicidad inespecífica de la oligomicina. 3) En el informe de Underwood et ^al.26, los autores realizaron un experimento de titulación de oligomicina y encontraron que las dosis de 6,25, 12,5, 25 y 50 μg/ml dieron lugar a una inhibición similar. La mayor concentración de oligomicina (50 μg/ml) no inhibió más, pero tuvo una mayor varianza. 4) En nuestra observación, el factor determinante parece ser la capacidad de penetración de la oligomicina. Es difícil que la oligomicina penetre en el tejido, y es por eso que se necesitan al menos de 7 a 8 ciclos para alcanzar la meseta, la respuesta máxima. Mientras alcance la meseta, se supone que la inhibición es máxima.

Un desafío técnico clave de la adaptación del analizador de flujo extracelular para medir el OCR en rodajas estriatales es prevenir la hipoxia tisular. Dado que el tampón no se oxigenó durante toda la duración de las mediciones (aproximadamente 4 h), la hipoxia fue un problema central. Esto es especialmente cierto para las muestras de tejido más gruesas, donde el oxígeno no puede difundirse a través de las muestras. Para superar este problema, las rebanadas se seccionaron a 150 μm de espesor, de modo que el oxígeno ambiental pudiera penetrar en la mitad de las rebanadas cerebrales. Además, se agregaron 4 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA) al tampón de líquido cefalorraquídeo artificial preoxigenado (ACSF), lo que facilitó la determinación de OCR máximo, como se sugirió anteriormente²³. Examinamos si las células estaban vivas. En primer lugar, se utilizaron Hoechst 33258 (10 μM) y yoduro de propidio (10 μM) para examinar si las células estaban sanas en estas condiciones. Luego examinamos si las neuronas espinosas medianas estaban funcionalmente sanas mediante el registro de pinza de parche. Además, evaluamos si los terminales de dopamina (DA) en las rebanadas estriatales eran funcionalmente saludables midiendo la liberación de DA mediante voltamperometría de escaneo rápido. Los resultados mostraron que las rebanadas estriatales que no estaban oxigenadas (grupo ACSF/BSA) eran tan saludables como el grupo control oxigenado²⁴.

Luego probamos diferentes combinaciones de grosor de la rebanada y tamaño de punzón para determinar las condiciones óptimas de la rebanada estriatal para el ensayo de respiración de flujo. Se utilizaron rodajas estriatales dorsales con diferentes espesores (150 μm y 200 μm) y tamaños de punzonado (1,0 mm, 1,5 mm y 2,0 mm de diámetro) para el análisis de OCR utilizando el analizador. Las rodajas estriatales que tenían un grosor de 150 μm con un tamaño de punzonado de 1,5 mm de diámetro tenían la mayor eficiencia de acoplamiento y OCR dentro de un rango óptimo para el analizador²⁴.

Protocolo

Todos los procedimientos, incluido el trabajo con animales, se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas nacionales e internacionales y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Thomas Jefferson. Se utilizaron ratones machos FVB/NTac a la edad de 3 a 14 meses. Los siguientes pasos se realizaron en un entorno no estéril, pero se debe tener precaución para mantener todo lo más limpio posible.

NOTA: El método aquí presentado fue establecido y utilizado en la investigación reportada por Zhi et ^al.24. Los experimentos descritos aquí utilizaron un analizador de flujo extracelular Seahorse XF24 (ver Tabla de Materiales). Estos métodos se pueden adaptar para el analizador XFe24, y algunos resultados se confirmaron utilizando este analizador.

1. Sensores de cartucho de hidrato (1 día antes del ensayo)

1. Abra el kit de ensayo de flujo extracelular (consulte la Tabla de materiales) y retire el cartucho del sensor (verde) y la placa de utilidad (transparente; Figura 1A). Coloque el cartucho del sensor a un lado (sensores hacia arriba) y no toque los sensores.
2. Añadir 600 μL de solución calibrante (pH 7,4) a cada pocillo de la placa de utilidad. Coloque el cartucho del sensor en la parte superior de la placa de utilidad y sumerja los sensores en la solución de calibrante. Asegúrese de que la muesca triangular de la placa del cartucho del utilitario y del sensor estén correctamente alineadas (Figura 1B).
3. Selle el kit de ensayo de flujo extracelular con una película de sellado para evitar la evaporación de la solución calibrante y luego colóquelo en una incubadora de 37 ° C no suplementada con CO₂ u oxígeno durante la noche.

2. Prepare la placa de tejido (el día del ensayo)

1. Abra la microplaca de captura de islotes y saque la placa del islote para sentar el tejido.
2. Calentar un volumen apropiado (625 μL por pocillo) de líquido cefalorraquídeo artificial modificado preoxigenado (ACSF, composición 140 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2.4 mM CaCl₂, 1.3 mM MgSO₄, 0.3 mM KH₂PO₄, 25 mM glucosa, 10 mM HEPES, pH 7.2) tampón a 37 °C en un tubo de 50 mL. Luego agregue BSA a una concentración final de 4 mg / ml para preparar el tampón de respiración. En general, 50 ml es suficiente para una placa.
3. Agregue 625 μL de tampón respiratorio (tampón ACSF preoxigenado con 25 mM de glucosa y 4 mg / ml de BSA) a cada pocillo de la placa de los islotes con cuidado y evite agitar la placa. Asegúrese de que no haya gotas residuales en la parte superior del cartucho del sensor y que no haya burbujas de aire presentes en el búfer de cada pozo.

3. Preparación aguda de rebanadas estriatales y colocación de rodajas extirpadas

1. Decapitar al ratón después de la dislocación cervical e inmediatamente diseccionar el cerebro en 10 ml de solución de corte preoxigenada helada (125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO₃, 3,7 mM MgSO₄, 0,3 mM KH₂PO₄, 10 mM glucosa, pH 7,4).
2. Sección cortes estriatales coronales con un vibratomo siguiendo las instrucciones del fabricante (ver Tabla de Materiales) a un espesor de 150 μm en solución de corte preoxigenada y helada.
3. Recuperar las rodajas en 50 mL de ACSF oxigenado (125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO₃, 2,4 mM CaCl₂, 1,3 mM MgSO₄, 0,3 mM KH₂PO₄, 10 mM glucosa, 2 mM HEPES, pH 7,4) y mantener en solución hasta 30 min a temperatura ambiente (RT).
4. Después de la recuperación, transfiera las rodajas a una placa de Petri de 35 mm x 10 mm con 5 ml de tampón respiratorio.
5. Use una punción de biopsia de acero inoxidable (por ejemplo, 1,5 mm de diámetro) para crear una pieza circular de tejido en el área deseada del cerebro en rodajas. Mantenga la rebanada en el búfer mientras presiona suavemente hacia abajo con el punzón. Asegúrese de que el punzón se empuje hacia abajo lo suficientemente fuerte como para cortar el tejido. Retire el resto del tejido, levante el punzón y retire el trozo circular de tejido en el tampón.
6. Corte el extremo de una punta de pipeta de 1 ml para hacer un orificio con un diámetro de 1.5-2.0 mm y úselo para sostener y transferir la rebanada perforada a la parte superior de la pantalla de captura. Succione una pieza de tejido cerebral perforado y coloque cuidadosamente el tejido en el lado de la malla de la pantalla de captura (Figura 2A). La pantalla de captura será una pieza circular de plástico con la malla unida a un lado.
   NOTA: Las pantallas de captura están incluidas en el paquete de microplacas (ver Tabla de Materiales) y son similares a la utilizada en Schuh et al.23.
7. Use suavemente un pañuelo de papel para secar brevemente la pantalla de captura. Con la humedad eliminada, el tejido se vuelve pegajoso, lo que permite que la rebanada se adhiera al centro de la malla. No seque demasiado la rodaja ya que, de lo contrario, se dañará.
8. Sostenga la rebanada de la pantalla de captura hacia abajo con pinzas y colóquela en uno de los pocillos de la placa del islote incubante (Figura 2B). Tenga cuidado de no dejar caer la rebanada; si es así, saque la pantalla y coloque una nueva rebanada sobre ella.
   NOTA: No coloque cortes de cerebro en los dos pozos de corrección de fondo (A1 y D6) en la placa del islote.
9. Incubar la placa del islote a 37 °C en una incubadora durante al menos 30 min para permitir el equilibrio de la temperatura y el pH antes de ejecutar el ensayo.

4. Carga de cartuchos con los compuestos deseados

1. Diluya los compuestos deseados en ACSF modificado (37 °C) a la concentración final de stock de 10x, 11x, 12x y 13x de la concentración de trabajo para los puertos A a D, respectivamente, y ajustar a pH 7.4. La prueba administrará los compuestos en orden desde el puerto A hasta el D. Para este experimento, se utilizaron las siguientes soluciones, con su respectiva concentración de trabajo mencionada antes que ellos: piruvato de 10 mM (puerto A), 20 μM de oligomicina (puerto B), 10 μM u otras concentraciones de FCCP (puerto C) y 20 μM de antimicina A (puerto D).
2. Precargue suavemente 75 μL de los compuestos diluidos en los puertos de inyección apropiados del cartucho del sensor. Coloque las puntas hasta la mitad de los puertos de inyección en un ángulo de 45° con la punta contra la pared del puerto de inyección. Las puntas no deben insertarse completamente en la parte inferior de los puertos de inyección, ya que esto puede causar fugas de compuestos a través del puerto.
3. Retire las puntas de los puertos con cuidado para evitar la creación de burbujas de aire. No toque ninguna parte del cartucho para evitar aliviar las burbujas de aire.
4. Inspeccione visualmente los puertos de inyección para una carga uniforme. Asegúrese de que todo el líquido esté en el puerto y que no haya gotas residuales en la parte superior del cartucho.
5. Coloque el cartucho del sensor en la placa de utilidad y colóquelo en una incubadora (sin CO₂) durante 30 minutos para permitir que se caliente hasta 37 ° C nuevamente. Manipule con cuidado sosteniendo solo la placa de utilidad. Muévete lo menos posible.

5. Calibración y realización del ensayo

1. Cargue la plantilla de ensayo en el software. Pulse el botón verde START .
2. Asegúrese de cargar el protocolo correcto. El protocolo contiene una combinación de secuencias de medición de 3 minutos, 3 minutos de espera y 2 minutos (estos tres pasos forman una medición). Cambie la distancia del cabezal de la sonda de 26.600 a 27.800 en la configuración de hardware en la configuración del instrumento²⁵. No es necesario cambiar el cabezal de la sonda para el analizador XFe24. Presione START.
3. Cargue el cartucho del sensor en la placa de utilidad en la bandeja de instrumentos. La muesca va en la esquina delantera, izquierda. Asegúrese de que la placa se asiente correctamente y esté plana. Cargue el cartucho del sensor lleno de fármacos en el analizador para su calibración.
4. Siga las instrucciones que aparecen en pantalla para calibrar y equilibrar los sensores. Esto toma alrededor de 30 minutos.
5. Una vez finalizado el paso de calibración, retire la placa de calibración y reemplácela con la placa del islote (que contiene la malla y las rodajas de tejido).
6. Mida el consumo de oxígeno en cada pocillo de la placa utilizando los protocolos de ensayo. El protocolo contiene una combinación de secuencias de medición de 3 minutos, 3 minutos de espera y 2 minutos (estos tres pasos forman una medición), momento en el que se calcula el OCR.
7. Para todo el experimento, incluya 4x mediciones de OCR para crear una línea de base, seguida de la inyección del puerto A (piruvato) con 4x mediciones, luego la inyección del puerto B (oligomicina) con 8x mediciones, luego la inyección del puerto C (FCCP) con 5x mediciones y, finalmente, la inyección del puerto D (antimicina A) con 6x mediciones.
   NOTA: Este número de mediciones después de cada inyección de compuesto se determina dependiendo de cuándo la medición alcanza la meseta.
8. Analice los datos de medición de OCR y los datos de eficiencia de acoplamiento.

Resultados

El primer paso de este estudio fue optimizar el grosor de la rebanada y el tamaño del punzón utilizado para extirpar una sección del cuerpo estriado de la rebanada (Figura 3A). Una rebanada de 150 μm de espesor y un tamaño de punzonado de 1,5 mm dieron los mejores resultados determinados por la eficiencia de acoplamiento (Figura 3B-C). Como se muestra en la Figura 3B, el OCR es relativamente es...

Discusión

El método que desarrollamos permitió utilizar un analizador XF para medir OCR en rodajas estriatales de ratones adultos durante un período de tiempo de 4 h. Este método proporciona una nueva forma de medir la bioenergética celular en punzones extirpados de estructuras cerebrales definidas anatómicamente. Dado que las muestras de tejido que se analizan son bastante pequeñas, se pueden investigar los parámetros metabólicos de áreas cerebrales específicas involucradas en una enfermedad. Además, el uso de rebanad...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accumet AB150 pH benchtop meter	Thermo Fisher Scientific	13-636-AB150	To measure pH
Antimycin A from streptomyces sp.	SIGMA	A8674	To inhibit complex III of the mitochondria
Bovine Serum Albumin (BSA)	SIGMA	A6003	To make modified artificial cerebrospinal fluid (BSA-ACSF)
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)	SIGMA	C2920	To uncouple mitochondrial respiration
D-Glucose	SIGMA	G8270	To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF)
DMSO	SIGMA	D8418	To dissovle compounds
HEPES	SIGMA	H3375	To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF)
Humidified non-CO2 incubator	Fisher Scientific	11-683-230D	To hydrate plates at 37 °C
Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes	SIGMA	O4876	To inhibit mitochondrial ATP synthase
Parafilm	SIGMA-ALDRICH		sealing film
Rotenone	Tocris	3616	To inhibit complex I of the mitochondria
Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL	Seahorse Bioscience	103681-100	Solution for seahorse calibration
Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer	Seahorse Bioscience		Equipment used to analyze oxygen consumption rate, old generation
Seahorse XFe24 Extracellular Flux Analyzer	Seahorse Bioscience		Equipment used to analyze oxygen consumption rate, new generation
Seahorse XF24 FluxPaks	Seahorse Bioscience	101174-100	Package of flux analyzer sensor cartridges, tissue culture plates, capture screens,  calibrant solution and calibration plates; assay kit.
Sodium pyruvate	SIGMA	P2256	To prevent any substrate-limiting constraints of substrate supply
Stainless steel biopsy punches	Miltex		Device used to punch slices
Sterile cell culture dish, 35 x 10 mm	Eppendrof	0030700102	Used for slice punch
Vibratome	Leica	VT1200	To slice brain tissue
Water bath	Thermo Scientific Precision	282-115	To heat buffer and solutions