极端微生物的生物勘探以解决环境污染问题

摘要

从地热泉中分离出抗重金属微生物是生物修复和环境监测生物系统发展的热门话题。本研究为从温泉中分离和鉴定重金属耐受细菌提供了一种方法学方法。

摘要

地热泉富含各种金属离子，这是由于深含水层中发生的岩石和水之间的相互作用。此外，由于pH和温度的季节性变化，在这些极端环境中定期观察到元素组成的波动，从而影响环境微生物群落。在火山热喷口中茁壮成长的极端微生物已经发展出抵抗机制来处理环境中存在的几种金属离子，从而参与复杂的金属生物地球化学循环。此外，极端微生物及其产品在市场上找到了广泛的立足点，这对于他们的酶尤其如此。在这种情况下，它们的表征对于开发用于环境监测和生物修复的生物系统和生物过程具有功能。迄今为止，在实验室条件下分离和培养极端微生物仍然是充分利用其生物技术潜力的瓶颈。这项工作描述了从温泉中分离嗜热微生物的简化方案，并通过以下步骤对其进行基因型和表型鉴定:（1）从地热场所（"Pisciarelli"，意大利那不勒斯Campi Flegrei的火山区）中取样微生物;（2）重金属抗微生物的分离;（3）微生物分离物的鉴定;（4）分离株的表型表征。本著作中描述的方法通常也适用于从其他极端环境中分离微生物。

引言

我们星球上的极端环境是能够忍受恶劣条件（即温度，pH值，盐度，压力和重金属）的微生物的极好来源^{1，2，包括}冰岛，意大利，美国，新西兰，日本，中非和印度，这是最认可和研究的火山地区^{3，4，5，6，7，8，9}.嗜热性在45°C至80°C^10，11，12的温度范围内的恶劣环境中进化而来。嗜热微生物，无论是属于古菌还是细菌王国，都是研究生物多样性，系统发育和生产用于工业应用的独家生物分子的储存库^{13，14，15，16}。事实上，在过去几十年中，全球市场的持续工业需求鼓励了极端微生物和热酶在几个生物技术领域的多样化应用的开发^17，18，19。

温泉是生物体生活在联盟中的丰富来源，是生物多样性的丰富来源，因此代表了研究微生物生态学的有吸引力的栖息地^20，21。此外，这些富含火山金属的地区通常被微生物定殖，这些微生物已经进化出耐受系统，以生存和适应重金属^22，23 的存在，因此积极参与其生物地球化学循环。如今，重金属被认为是人类和环境的优先污染物。抗重金属微生物能够通过转化和重塑其生态系统来溶解和沉淀金属^24，25。对重金属抗性分子机制的理解是开发新型绿色方法^26，27，28的紧迫性的热门话题。在此背景下，发现新的耐受细菌是制定环境生物修复新战略的起点^24，29。在通过微生物程序探索热液环境和增加对支撑重金属耐受性的基因的作用的认识的同时，在意大利Campi Flegrei温泉区进行了微生物筛查。这种富含重金属的环境显示出强大的热液活动，喷气孔和沸腾池，其pH值和温度随季节，降雨和地下地质运动而变化³⁰。从这个角度来看，我们描述了一种易于应用且有效的方法来分离对重金属有抗药性的细菌，例如，来自Campi Flegrei的Pisciarelli地区的 Geobacillus stearothermophilus ^{GF16 31} （命名为分离株1）和 Alicyclobacillus mali FL18³²（命名为分离株2）。

研究方案

1. 地热场微生物采样

1. 选择采样地点作为具有所需温度和pH值的标准地点。通过数字热电偶探头测量物理参数，将其插入选定的池或泥浆中。
2. 收集20克土壤样本（在这种情况下，从Pisciarelli Solfatara热液现场的泥浆中），用无菌勺子将它们捡起。为每个选择的地点至少采集两个样本。
3. 将样品放入50 mL无菌聚丙烯管中，立即关闭。
4. 使用数字热电偶探头直接插入采样部位，测量pH和温度。使用后，用去离子水仔细冲洗探头。

2. 重金属抗微生物的分离

注意:在无菌生物罩下执行步骤2.1-2.7。

1. 将每个收集的样品的2g接种到50mL新鲜制备的Luria-Bertani培养基（LB）中，其中通过加入HCl或NaOH将pH调节至4或7。
2. 将样品在采样部位的相同温度下和±5°C（Pisciarelli样品为55°C和60°C）下在温控轨道振荡器中孵育24小时，振荡率为180rpm。
3. 将200μL生长的样品放在LB琼脂（pH 4或pH 7）上，并在55°C或60°C下在静态条件下孵育48小时。
4. 分离单个菌落并重复条纹电镀循环（步骤2.3和2.4）至少三次。
5. 为了制备-80°C冷冻细胞储备，培养物过夜（ON）生长并向生长的细胞中加入20%甘油（最终体积为1mL）;使用丙酮和干冰的混合物进行快速冷冻。
6. 为了从甘油储备液中制备接种物，在50mL LB（pH 4或pH 6）中接种50μL，并在55°C或60°C下以180rpm ON在轨道振荡器中孵育。
7. 为了获得生长曲线，将预培养物（从步骤2.6获得）稀释至0.1 OD_600nm在10mL LB（pH 4或pH 6）中，在55°C或60°C下在轨道振荡器中生长16小时，并以30分钟的间隔测量OD_600nm 。
8. 根据步骤2.7中获得的数据构建生长曲线，X轴上为时间（分钟），Y轴上为OD_{600 nm} 。
9. 实现步骤2.7和2.8中描述的相同生长曲线，但改变培养基的pH值（±1单位）（例如，对于在pH 4下生长的样品，pH 3和5）以确定实验室条件的最佳pH值。

3. 微生物分离株的鉴定

1. 基因组DNA的制备
   1. 将从甘油储备中条纹的分离物接种在50mL LB培养基（pH 4或pH 6）中，并在55°C或60°C的轨道振荡器中以180rpm ON生长。
   2. 通过以5000×g离心10分钟收获ON培养 物。弃去上清液。
   3. 在使用前立即准备10mL细菌裂解缓冲液:20mM Tris-HCl pH 8.0，2mM EDTA，1.2%Triton X-100和溶菌酶（20mg / mL）。
   4. 将沉淀重悬于180μL细菌裂解缓冲液中。在37°C下孵育30分钟。
   5. 遵循基因组DNA纯化试剂盒（材料表）指示的指南来提取基因组DNA。
   6. 通过紫外可见分光光度计量化提取的基因组DNA及其纯度。对于纯度，确定OD 260/280 nm和OD 260/230 nm的比率。
   7. 通过在0.8%琼脂糖凝胶上加载每个样品的200 ng并将尺寸分布与高重量分子标记物进行比较，评估基因组DNA的完整性。
   8. 委托外部服务16S rRNA片段制备，测序和获得的序列（1000 bp）与美国国家生物技术信息中心（NCBI）核苷酸数据库中存在的序列的比较分析³³。
2. 为了证实16S rRNA测序的数据，还要对消化的染色体DNA进行自动汽化（外部服务， 材料表）。
3. 如果无法仅使用植物学数据确定物种鉴定，请委托进行MALDI-TOF MS分析以进行脂肪酸鉴定。
4. 为了对鉴定的属进行系统发育分析，用BLASTn³⁴分析分离株的16S rRNA序列。必须使用具有99%至97%的序列来构建使用CLUSTAL Omega³⁵的多序列比对。使用默认选项 ClustalW2（简单系统发育）构建邻接树。

4. 重金属和抗生素易感性

1. 从甘油储备液中接种分离物（参见步骤2.5），并在先前确定的最佳pH和温度条件下在200mL LB中生长。
2. 在含有增加重金属浓度的5mL LB培养基（在适当的pH下）中以_{0.1 OD 600nm} 稀释每个预培养物。重金属的浓度从0.01-120 mM不等[As（V），As（III），Cd（II），Co（III），Cr（VI），Cu（II），Hg（II），Ni（II），V（V）]或抗生素[氨苄西林，杆菌肽，氯霉素，环丙沙星，红霉素，卡那霉素，链霉素，四环素和万古霉素]的0.5-1mg / mL。
3. 分别进行重金属和抗生素治疗。使用50 mL聚丙烯管，在温度受控的轨道振荡器中培养细胞，每种条件/处理在55°C或60°C下振荡180rpm的振荡速率为16小时。
4. 通过识别未发生微生物生长的管中的浓度值，即确定16小时后完全抑制细胞生长的值，计算抗生素或重金属的最小抑制浓度（MIC）。
5. 通过接种200μL培养物在LB-琼脂平板上被认为是MIC的值（在适当的pH和温度下）并验证ON孵育后菌落的存在，检查浓度是否对细胞具有抑制性且不致死。
   注意:由于LB琼脂平板上的培养物仅在4°C下存活数周，因此为了将分离物保存更长时间，制备甘油储备液并在-80°C下储存。 对于MIC测定，使用独立培养物进行至少三次独立重复。在一式三份实验中计算标准偏差。

结果

采样现场
该协议说明了从温泉中分离重金属抗性细菌的方法。在这项研究中，将酸性硫化地热环境Pisciarelli地区用作采样点 （图1）。该生态系统的特点是来自火山活动的侵蚀性硫流体的流动。已经证明，酸性硫磺地热系统中的微生物群落受到由高浓度重金属存在产生的极端选择性压力。这些样本是在一年中的两个不同时期（4月和9月）从

讨论

温泉含有未开发的微生物组多样性，具有同样多样化的代谢能力¹².开发分离能够有效将重金属转化为毒性较小的化合物¹⁰ 的微生物的策略代表了全世界越来越感兴趣的研究领域。本文旨在描述一种筛选和分离具有抗有毒化学物质能力的微生物的简化方法。所描述的方法可以很容易地修改，以从不同的环境来源（如水，食物，土壤或沉积物）中分离微生物。然而?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ampicillin	Sigma Aldrich	A9393
Aura Mini	bio air s.c.r.l.		Biological hood
Bacitracin	Sigma Aldrich	B0125
Cadmium chloride	Sigma Aldrich	202908
Chloramphenicol	Sigma Aldrich	C0378
Ciprofloxacin	Sigma Aldrich	17850
Cobalt chloride	Sigma Aldrich	C8661
Copper chloride	Sigma Aldrich	224332
Erythromycin	Sigma Aldrich	E5389
Exernal Service	DSMZ		Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH
Genomic DNA Purification Kit	Thermo Scientific	#K0721
Kanamycin sulphate	Sigma Aldrich	60615
MaxQTM 4000 Benchtop Orbital Shaker	Thermo Scientific	SHKE4000
Mercury chloride	Sigma Aldrich	215465
NanoDrop 1000 Spectrophotometer	Thermo Scientific
Nickel chloride	Sigma Aldrich	654507
Orion Star A221 Portable pH Meter	Thermo Scientific	STARA2218
Sodium (meta) arsenite	Sigma Aldrich	S7400
Sodium arsenate dibasic heptahydrate	Sigma Aldrich	A6756
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S5886
Streptomycin	Sigma Aldrich	S6501
Tetracycline	Sigma Aldrich	87128
Tryptone BioChemica	Applichem Panreac	A1553
Vancomycin	Sigma Aldrich	PHR1732
Yeast extract for molecular biology	Applichem Panreac	A3732