Bioprospecção de microrganismos extreílicos para enfrentar a poluição ambiental

Resumo

O isolamento de micróbios resistentes a metais pesados de fontes geotérmicas é um tema quente para o desenvolvimento de bioremediação e monitoramento ambiental de biossistemas. Este estudo fornece uma abordagem metodológica para isolar e identificar bactérias tolerantes a metais pesados a partir de fontes termais.

Resumo

As nascentes geotérmicas são ricas em vários íons metálicos devido à interação entre rocha e água que ocorre no aquífero profundo. Além disso, devido à variação sazonalidade do pH e da temperatura, a flutuação na composição do elemento é observada periodicamente dentro desses ambientes extremos, influenciando as comunidades microbianas ambientais. Microrganismos extreílicos que prosperam em aberturas térmicas vulcânicas desenvolveram mecanismos de resistência para lidar com vários íons metálicos presentes no ambiente, participando assim de ciclos biogeoquímicos metálicos complexos. Além disso, os extremófilos e seus produtos têm encontrado uma ampla base no mercado, e isso vale especialmente para suas enzimas. Nesse contexto, sua caracterização é funcional para o desenvolvimento de biossistemas e bioprocessos para monitoramento ambiental e bioremediação. Até o momento, o isolamento e o cultivo em condições laboratoriais de microrganismos extreílicos ainda representam um gargalo para a exploração plena de seu potencial biotecnológico. Este trabalho descreve um protocolo simplificado para o isolamento de microrganismos termofílicos de fontes termais, bem como sua identificação genotípica e fenotípica através das seguintes etapas: (1) Amostragem de microrganismos de sítios geotérmicos ("Pisciarelli", uma área vulcânica de Campi Flegrei em Nápoles, Itália); (2) Isolamento de microrganismos resistentes ao metal pesado; (3) Identificação de isolados microbianos; (4) Caracterização fenotípica dos isolados. As metodologias descritas neste trabalho podem ser geralmente aplicadas também para o isolamento de microrganismos de outros ambientes extremos.

Introdução

Os ambientes extremos do nosso planeta são excelentes fontes de microrganismos capazes de tolerar condições severas (ou seja, temperatura, pH, salinidade, pressão e metais pesados)^1,2, sendo Islândia, Itália, EUA, Nova Zelândia, Japão, África Central e Índia, as áreas vulcânicas mais reconhecidas e estudadas 3,4,5,6,7,8,9 . Os termófilos evoluíram em ambientes severos em uma faixa de temperaturas de 45 °C a 80 °C 10,11,12. Os microrganismos termofílicos, pertencentes aos reinos arqueais ou bacterianos, são um reservatório para o estudo da biodiversidade, filogênese e produção de biomoléculas exclusivas para aplicações industriais 13,14,15,16. De fato, nas últimas décadas, a contínua demanda industrial no mercado global tem incentivado a exploração de extremófilos e termozymes para suas aplicações diversificadas em diversos campos biotecnológicos 17,18,19.

As fontes termais, onde os organismos vivem em consórcios, são ricas fontes de biodiversidade, representando assim um habitat atraente para estudar a ecologia microbiana^20,21. Além disso, essas áreas ricas em metais vulcânicos são comumente colonizadas por microrganismos que evoluíram sistemas de tolerância para sobreviver e se adaptar à presença de metais pesados^22,23 e, portanto, estão ativamente envolvidos em seus ciclos biogeoquímicos. Atualmente, metais pesados são considerados poluentes prioritários para os seres humanos e para o meio ambiente. Os microrganismos resistentes ao metal pesado são capazes de solubilizar e precipitar metais transformando-os e remodelando seus ecossistemas^24,25. A compreensão dos mecanismos moleculares da resistência ao metal pesado é um tema quente para a urgência de desenvolver novas abordagens verdes 26,27,28. Nesse contexto, a descoberta de novas bactérias tolerantes representa o ponto de partida para o desenvolvimento de novas estratégias de bioremediação ambiental^24,29. Ao acompanhar os esforços para explorar ambientes hidrotérmicos através de procedimentos microbiológicos e aumentar o conhecimento sobre o papel dos genes que sustentam a tolerância ao metal pesado, foi realizada uma triagem microbiana na área de primavera quente de Campi Flegrei, na Itália. Este ambiente rico em metais pesados mostra uma poderosa atividade hidrotérmica, fumarole e piscinas de ebulição, variável em pH e temperatura em dependência de sazonalidade, chuvas e movimentos geológicos subterrâneos³⁰. Nessa perspectiva, descrevemos uma maneira fácil de aplicar e eficaz de isolar bactérias resistentes a metais pesados, por exemplo, Geobacillus stearothermophilus GF16³¹ (nomeado como isolado 1) e Alicyclobacillus mali FL18³² (nomeado como isolado 2) da área de Pisciarelli de Campi Flegrei.

Protocolo

1. Amostragem de microrganismos de sítios geotérmicos

1. Escolha o local para amostragem usando como critério locais com temperatura e pH desejados. Meça os parâmetros físicos através de uma sonda termopar digital, inserindo-a nas piscinas ou lamas selecionadas.
2. Coletar 20 g de amostras de solos (neste caso, de lama no sítio hidrotérmico de Pisciarelli Solfatara), recolhendo-os com uma colher esterilizada. Pegue pelo menos duas amostras para cada local escolhido.
3. Coloque as amostras em tubos de polipropileno estéreis de 50 mL e feche imediatamente.
4. Meça pH e temperatura com uma sonda termopar digital inserindo-a diretamente no local de amostragem. Após o uso, enxágue a sonda cuidadosamente com água deionizada.

2. Isolamento de microrganismos resistentes ao metal pesado

NOTA: Realizar etapas 2.1-2.7 sob um capô biológico estéril.

1. Inocular 2 g de cada amostra coletada em 50 mL de meio Luria-Bertani recém-preparado (LB), no qual o pH foi ajustado para 4 ou 7 através da adição de HCl ou NaOH.
2. Incubar as amostras na mesma temperatura do local de amostragem e a ±5 °C (55 °C e 60 °C para amostras de Pisciarelli) em um agitador orbital controlado pela temperatura por 24 h com uma taxa de agitação de 180 rpm.
3. Placa 200 μL das amostras cultivadas em ágar LB (pH 4 ou pH 7) e incubar em condição estática por 48 h a 55 °C ou 60 °C.
4. Isole colônias únicas e repita ciclos de revestimento de raia (passos 2.3 e 2.4) pelo menos três vezes.
5. Para preparar -80 °C de estoques de células congeladas, cresça as culturas durante a noite (ON) e adicione às células cultivadas 20% glicerol (em um volume final de 1 mL); use uma mistura de acetona e gelo seco para congelamento rápido.
6. Para preparar um inóculo de um estoque de glicerol, inocular 50 μL em 50 mL de LB (pH 4 ou pH 6) e incubar a 55 °C ou 60 °C no agitador orbital a 180 rpm ON.
7. Para obter um perfil de crescimento, diluir uma pré-cultura (obtida da etapa 2.6) a 0,1 OD_{600 nm} em 10 mL de LB (pH 4 ou pH 6), crescer as células a 55 °C ou 60 °C por 16 horas no agitador orbital, e medir o OD_{600 nm} em intervalos de 30 minutos.
8. Construa uma curva de crescimento a partir dos dados obtidos na etapa 2.7 com tempo (min) no eixo X e OD_{600 nm} no eixo Y.
9. Realize a mesma curva de crescimento descrita nas etapas 2.7 e 2.8, mas variando o pH (± unidade 1) do meio de cultura (por exemplo, pH 3 e 5 para amostras cultivadas em pH 4) para determinar o pH ideal para condições laboratoriais.

3. Identificação de isolados microbianos

1. Preparação de DNA genômico
   1. Inocular o isolado listrado do estoque de glicerol em 50 mL de meio LB (pH 4 ou pH 6) e crescer em um agitador orbital a 55 °C ou 60 °C a 180 rpm ON.
   2. Colher a cultura ON por centrifugação por 10 min a 5000 x g. Descarte o supernatante.
   3. Prepare 10 mL de tampão de lise bacteriana composto por: 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 2 mM EDTA, 1,2% Triton X-100 e lysozyme (20 mg/mL) imediatamente antes do uso.
   4. Resuspense a pelota em 180 μL de tampão de lise bacteriana. Incubar por 30 min a 37 °C.
   5. Siga as diretrizes indicadas por um kit de purificação de DNA genômico (Tabela de Materiais) para extrair DNA genômico.
   6. Quantifique o DNA genômico extraído e sua pureza pela medição UV-Vis. Para razões de determinação de pureza-OD 260/280 nm e OD 260/230 nm.
   7. Avalie a integridade do DNA genômico carregando 200 ng de cada amostra em um gel de 0,8% de agarose e comparando a distribuição de tamanho com um marcador molecular de alto peso.
   8. Comissão para um serviço externo a preparação, sequenciamento e análise comparativa do fragmento de rRNA 16S e análise comparativa da sequência obtida (1000 bp) com os presentes no banco de dados nucleotídeos do Centro Nacional de Informações de Biotecnologia dos EUA (NCBI)³³.
2. Para corroborar dados do sequenciamento de rRNA 16S, também realizar ribotipagem automatizada no DNA cromossômico digerido (serviço externo, Tabela de Materiais).
3. No caso em que a identificação da espécie não pode ser determinada apenas com dados de ribotipagem, comissione uma análise MALDI-TOF MS para identificação de ácidos graxos.
4. Para realizar uma análise filogenética do gênero identificado, analise a sequência de rRNA 16S do isolado com BLASTn³⁴. Sequências com identidades de 99% a 97% devem ser usadas para construir um alinhamento de sequência múltipla usando CLUSTAL Ômega³⁵. Construa uma árvore de junção de vizinhos usando a opção padrão de ClustalW2 (Simple Phylogeny).

4. Suscetibilidade de metais pesados e antibióticos

1. Inocular o isolado de um estoque de glicerol (ver passo 2.5) e cultivá-lo em 200 mL de LB sob o pH ideal e condições de temperatura previamente determinadas.
2. Diluir cada pré-cultura a 0,1 OD_{600 nm} em 5 mL de meio LB (no pH apropriado) contendo concentrações crescentes de metais pesados. As concentrações variam de 0,01-120 mM para metais pesados [As(V), As(III), Cd(II), Co(III), Cr(VI), Cu(II), Hg(II), Ni(II), V(V)] ou 0,5-1 mg/mL para os antibióticos [Ampicillin, Bacitracina, Clorofilicol, Ciprofloxacina, Eritromicina, Kanamicina, Estreptomicina, Tetraciclina e Vancomicina].
3. Realize tratamentos de metais pesados e antibióticos separadamente. Use um tubo de polipropileno de 50 mL e cresça as células em um agitador orbital controlado pela temperatura com uma taxa de agitação de 180 rpm a 55 °C ou 60°C para 16 h para cada condição/tratamento.
4. Calcule a Concentração Inibitória Mínima (MIC) seja para antibióticos ou metais pesados, identificando os valores de concentração nos tubos onde o crescimento microbiano não ocorre, ou seja, determinando os valores que inibem completamente o crescimento celular após 16 h.
5. Verifique se a concentração é inibitória e não letal para as células, emplacando 200 μL da cultura cultivada pelo valor que é considerado como MIC em placas lb-ágar (no pH e temperatura apropriados) e verificando a presença de colônias após a incubação ON.
   NOTA: Como a cultura na placa de ágar LB é viável a 4 °C apenas por algumas semanas, a fim de preservar os isolados por mais tempo, os estoques de glicerol foram preparados e armazenados a -80 °C. Para determinação mic, pelo menos três réplicas independentes utilizando culturas independentes foram realizadas. O desvio padrão foi calculado entre os experimentos triplicados.

Resultados

Local de amostragem
Este protocolo ilustra um método para o isolamento de bactérias resistentes a metais pesados de uma fonte termal. Neste estudo, a área de Pisciarelli, um ambiente geotérmico ácido-sulfísico, foi utilizada como local de amostragem (Figura 1). Este ecossistema é caracterizado pelo fluxo de fluidos sulfúricos agressivos derivados de atividades vulcânicas. Foi demonstrado que as comunidades microbianas em sistemas geotérmicos ác...

Discussão

As fontes termais contêm uma diversidade inexplorada de microbiomas com capacidades metabólicas igualmente diversas¹². O desenvolvimento de estratégias para o isolamento de microrganismos que possam converter eficientemente metais pesados em compostos menos tóxicos¹⁰ representa uma área de pesquisa de crescente interesse em todo o mundo. Este artigo tem como objetivo descrever uma abordagem simplificada para a triagem e isolamento de micróbios com a capacidade de resi...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ampicillin	Sigma Aldrich	A9393
Aura Mini	bio air s.c.r.l.		Biological hood
Bacitracin	Sigma Aldrich	B0125
Cadmium chloride	Sigma Aldrich	202908
Chloramphenicol	Sigma Aldrich	C0378
Ciprofloxacin	Sigma Aldrich	17850
Cobalt chloride	Sigma Aldrich	C8661
Copper chloride	Sigma Aldrich	224332
Erythromycin	Sigma Aldrich	E5389
Exernal Service	DSMZ		Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH
Genomic DNA Purification Kit	Thermo Scientific	#K0721
Kanamycin sulphate	Sigma Aldrich	60615
MaxQTM 4000 Benchtop Orbital Shaker	Thermo Scientific	SHKE4000
Mercury chloride	Sigma Aldrich	215465
NanoDrop 1000 Spectrophotometer	Thermo Scientific
Nickel chloride	Sigma Aldrich	654507
Orion Star A221 Portable pH Meter	Thermo Scientific	STARA2218
Sodium (meta) arsenite	Sigma Aldrich	S7400
Sodium arsenate dibasic heptahydrate	Sigma Aldrich	A6756
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S5886
Streptomycin	Sigma Aldrich	S6501
Tetracycline	Sigma Aldrich	87128
Tryptone BioChemica	Applichem Panreac	A1553
Vancomycin	Sigma Aldrich	PHR1732
Yeast extract for molecular biology	Applichem Panreac	A3732