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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

L'isolamento di microbi resistenti ai metalli pesanti dalle sorgenti geotermiche è un argomento caldo per lo sviluppo di biosistemi di biorisanamento e monitoraggio ambientale. Questo studio fornisce un approccio metodologico per isolare e identificare i batteri tolleranti ai metalli pesanti dalle sorgenti termali.

Abstract

Le sorgenti geotermiche sono ricche di vari ioni metallici a causa dell'interazione tra roccia e acqua che avviene nella falda acquifera profonda. Inoltre, a causa della variazione stagionale del pH e della temperatura, la fluttuazione della composizione degli elementi viene periodicamente osservata all'interno di questi ambienti estremi, influenzando le comunità microbiche ambientali. I microrganismi estremofili che prosperano nelle bocche termiche vulcaniche hanno sviluppato meccanismi di resistenza per gestire diversi ioni metallici presenti nell'ambiente, prendendo così parte a complessi cicli biogeochimici metallici. Inoltre, gli estremofili e i loro prodotti hanno trovato un ampio punto d'appoggio nel mercato, e questo vale soprattutto per i loro enzimi. In questo contesto, la loro caratterizzazione è funzionale allo sviluppo di biosistemi e bioprocessi per il monitoraggio ambientale e il biorisanamento. Ad oggi, l'isolamento e la coltivazione in condizioni di laboratorio di microrganismi estremofili rappresentano ancora un collo di bottiglia per sfruttare appieno il loro potenziale biotecnologico. Questo lavoro descrive un protocollo semplificato per l'isolamento di microrganismi termofili da sorgenti termali e la loro identificazione genotipica e fenotipica attraverso le seguenti fasi: (1) Campionamento di microrganismi da siti geotermici ("Pisciarelli", un'area vulcanica dei Campi Flegrei a Napoli, Italia); (2) Isolamento di microrganismi resistenti ai metalli pesanti; (3) Identificazione di isolati microbici; (4) Caratterizzazione fenotipica degli isolati. Le metodologie descritte in questo lavoro potrebbero essere generalmente applicate anche per l'isolamento di microrganismi provenienti da altri ambienti estremi.

Introduzione

Gli ambienti estremi del nostro pianeta sono eccellenti fonti di microrganismi in grado di tollerare condizioni difficili (cioè temperatura, pH, salinità, pressione e metalli pesanti)1,2, essendo Islanda, Italia, STATI UNITI, Nuova Zelanda, Giappone, Africa centrale e India, le aree vulcaniche più riconosciute e studiate 3,4,5,6,7,8,9 . I termofili si sono evoluti in ambienti difficili in un intervallo di temperature da 45 °C a 80 °C 10,11,12. I microrganismi termofili, appartenenti al regno archeale o batterico, sono un serbatoio per lo studio della biodiversità, della filogenesi e della produzione di biomolecole esclusive per applicazioni industriali 13,14,15,16. Infatti, negli ultimi decenni, la continua domanda industriale nel mercato globale ha favorito lo sfruttamento di estremofili e termoenzimi per le loro applicazioni diversificate in diversi campi biotecnologici 17,18,19.

Le sorgenti termali, dove gli organismi vivono in consorzi, sono ricche fonti di biodiversità, rappresentando quindi un habitat attraente per studiare l'ecologia microbica20,21. Inoltre, queste aree vulcaniche ricche di metalli sono comunemente colonizzate da microrganismi che hanno evoluto sistemi di tolleranza per sopravvivere e adattarsi alla presenza di metalli pesanti22,23 e sono quindi attivamente coinvolti nei loro cicli biogeochimici. Al giorno d'oggi, i metalli pesanti sono considerati inquinanti prioritari per l'uomo e l'ambiente. I microrganismi resistenti ai metalli pesanti sono in grado di solubilizzare e precipitare i metalli trasformandoli e rimodellando i loro ecosistemi24,25. La comprensione dei meccanismi molecolari della resistenza ai metalli pesanti è un argomento caldo per l'urgenza di sviluppare nuovi approcci verdi 26,27,28. In questo contesto, la scoperta di nuovi batteri tolleranti rappresenta il punto di partenza per lo sviluppo di nuove strategie per il biorisanamento ambientale24,29. Accompagnando gli sforzi per esplorare gli ambienti idrotermali attraverso procedure microbiologiche e aumentare le conoscenze sul ruolo dei geni alla base della tolleranza ai metalli pesanti, è stato condotto uno screening microbico nell'area termale dei Campi Flegrei in Italia. Questo ambiente ricco di metalli pesanti mostra una potente attività idrotermale, fumarole e piscine bollenti, variabili in pH e temperatura in dipendenza della stagionalità, delle precipitazioni e dei movimenti geologici sotterranei30. In questa prospettiva, descriviamo un modo facile da applicare ed efficace per isolare batteri resistenti ai metalli pesanti, ad esempio, Geobacillus stearothermophilus GF1631 (denominato isolato 1) e Alicyclobacillus mali FL1832 (denominato isolato 2) dalla zona di Pisciarelli dei Campi Flegrei.

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Protocollo

1. Campionamento di microrganismi da siti geotermici

  1. Scegliere il sito per il campionamento utilizzando come criterio i luoghi con la temperatura e il pH desiderati. Misurare i parametri fisici attraverso una sonda termocoppia digitale, inserendola nelle piscine o nei fanghi selezionati.
  2. Raccogliere 20 g di campioni di terreno (in questo caso, dal fango nel sito idrotermale di Pisciarelli Solfatara), raccogliendoli con un cucchiaio sterilizzato. Prelevare almeno due campioni per ogni sito scelto.
  3. Mettere i campioni in tubi di polipropilene sterile da 50 ml e chiudere immediatamente.
  4. Misura pH e temperatura con una sonda termocoppia digitale inserendola direttamente nel sito di campionamento. Dopo l'uso, sciacquare accuratamente la sonda con acqua deionizzata.

2. Isolamento di microrganismi resistenti ai metalli pesanti

NOTA: Eseguire i passaggi 2.1-2.7 sotto un cappuccio biologico sterile.

  1. Inoculare 2 g di ciascun campione raccolto in 50 ml di terreno Luria-Bertani (LB) appena preparato, in cui il pH è stato regolato a 4 o 7 attraverso l'aggiunta di HCl o NaOH.
  2. Incubare i campioni alla stessa temperatura del sito di campionamento e a ±5 °C (55 °C e 60 °C per i campioni Pisciarelli) in uno shaker orbitale a temperatura controllata per 24 ore con una velocità di agitazione di 180 giri/min.
  3. Piastra 200 μL dei campioni coltivati su LB agar (pH 4 o pH 7) e incubare in stato statico per 48 ore a 55 °C o 60 °C.
  4. Isolare le singole colonie e ripetere i cicli di streak-plating (passaggi 2.3 e 2.4) almeno tre volte.
  5. Per preparare scorte cellulari congelate a -80 °C, far crescere le colture durante la notte (ON) e aggiungere alle cellule cresciute il 20% di glicerolo (in un volume finale di 1 mL); utilizzare una miscela di acetone e ghiaccio secco per un congelamento rapido.
  6. Per preparare un inoculo da un ceppo di glicerolo, inoculare 50 μL in 50 mL di LB (pH 4 o pH 6) e incubare a 55 °C o 60 °C nello shaker orbitale a 180 rpm ON.
  7. Per ottenere un profilo di crescita, diluire una precoltura (ottenuta dallo stadio 2.6) a 0,1 OD600 nm in 10 mL di LB (pH 4 o pH 6), far crescere le cellule a 55 °C o 60 °C per 16 ore nello shaker orbitale e misurare l'OD600 nm a intervalli di 30 minuti.
  8. Costruisci una curva di crescita dai dati ottenuti nel passaggio 2.7 con tempo (min) sull'asse X e OD600 nm sull'asse Y.
  9. Realizzare la stessa curva di crescita descritta nei passaggi 2.7 e 2.8 ma variando il pH (± 1 unità) del terreno di coltura (ad esempio, pH 3 e 5 per campioni cresciuti a pH 4) per determinare il pH ottimale per le condizioni di laboratorio.

3. Identificazione degli isolati microbici

  1. Preparazione del DNA genomico
    1. Inoculare l'isolato striato dal materiale di glicerolo in 50 mL di terreno LB (pH 4 o pH 6) e crescere in uno shaker orbitale a 55 °C o 60 °C a 180 giri/min ON.
    2. Raccogliere la coltura ON per centrifugazione per 10 minuti a 5000 x g. Scartare il surnatante.
    3. Preparare 10 mL di tampone di lisi batterica composto da: 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 2 mM EDTA, 1,2% Triton X-100 e lisozima (20 mg/mL) immediatamente prima dell'uso.
    4. Risospesare il pellet in 180 μL di tampone di lisi batterica. Incubare per 30 minuti a 37 °C.
    5. Seguire le linee guida indicate da un kit di purificazione del DNA genomico (Tabella dei materiali) per estrarre il DNA genomico.
    6. Quantificare il DNA genomico estratto e la sua purezza mediante misurazione UV-Vis. Per la purezza determinare i rapporti-OD 260/280 nm e OD 260/230 nm.
    7. Valutare l'integrità del DNA genomico caricando 200 ng di ciascun campione su un gel di agarosio allo 0,8% e confrontando la distribuzione dimensionale con un marcatore molecolare ad alto peso.
    8. Commissione ad un servizio esterno della preparazione, del sequenziamento e dell'analisi comparativa dei frammenti di rRNA 16S della sequenza ottenuta (1000 bp) con quelli presenti nel database nucleotidico del National Center for Biotechnology Information (NCBI)33 degli Stati Uniti.
  2. Per corroborare i dati del sequenziamento dell'rRNA 16S, eseguire anche la ribotipizzazione automatizzata sul DNA cromosomico digerito (servizio esterno, Tabella dei materiali).
  3. Nel caso in cui l'identificazione della specie non possa essere determinata solo con i dati di ribotipizzazione, commissionare un'analisi MALDI-TOF MS per l'identificazione degli acidi grassi.
  4. Per eseguire un'analisi filogenetica del genere identificato, analizzare la sequenza di rRNA 16S dell'isolato con BLASTn34. Le sequenze con identità dal 99% al 97% devono essere utilizzate per costruire un allineamento di sequenze multiple utilizzando CLUSTAL Omega35. Costruisci un albero adiacente usando l'opzione predefinita di ClustalW2 (Simple Phylogeny).

4. Suscettibilità ai metalli pesanti e agli antibiotici

  1. Inoculare l'isolato da un ceppo di glicerolo (vedere punto 2.5) e coltivarlo in 200 ml di LB nelle condizioni ottimali di pH e temperatura precedentemente determinate.
  2. Diluire ogni precoltura a 0,1 OD600 nm in 5 mL di terreno LB (al pH appropriato) contenente concentrazioni crescenti di metalli pesanti. Le concentrazioni variano da 0,01-120 mM per i metalli pesanti [As(V), As(III), Cd(II), Co(III), Cr(VI), Cu(II), Hg(II), Ni(II), V(V)] o 0,5-1 mg/mL per gli antibiotici [Ampicillina, Bacitracina, Cloramfenicolo, Ciprofloxacina, Eritromicina, Kanamicina, Streptomicina, Tetraciclina e Vancomicina].
  3. Eseguire trattamenti con metalli pesanti e antibiotici separatamente. Utilizzare un tubo di polipropilene da 50 mL e far crescere le celle in uno shaker orbitale a temperatura controllata con una velocità di scuotimento di 180 giri / min a 55 ° C o 60 ° C per 16 ore per ogni condizione / trattamento.
  4. Calcola la concentrazione minima inibitoria (MIC) sia per antibiotici che per metalli pesanti identificando i valori di concentrazione nei tubi in cui non si verifica la crescita microbica, cioè determinando i valori che inibiscono completamente la crescita cellulare dopo 16 ore.
  5. Verificare che la concentrazione sia inibitoria e non letale per le cellule placcando 200 μL della coltura coltivata al valore che si considera MIC su piastre LB-agar (al pH e alla temperatura appropriati) e verificando la presenza di colonie dopo incubazione ON.
    NOTA: Poiché la coltura su piastra di agar LB è praticabile a 4 °C solo per alcune settimane, al fine di conservare gli isolati per un tempo più lungo, le scorte di glicerolo sono state preparate e conservate a -80 °C. Per la determinazione del MIC, sono state effettuate almeno tre repliche indipendenti utilizzando colture indipendenti. La deviazione standard è stata calcolata tra gli esperimenti triplicati.

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Risultati

Sito di campionamento
Questo protocollo illustra un metodo per l'isolamento di batteri resistenti ai metalli pesanti da una sorgente calda. In questo studio, l'area di Pisciarelli, un ambiente geotermico acido-solfidico, è stata utilizzata come sito di campionamento (Figura 1). Questo ecosistema è caratterizzato dal flusso di fluidi solforosi aggressivi derivati da attività vulcaniche. È stato dimostrato che le comunità microbiche nei sistemi geoterm...

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Discussione

Le sorgenti termali contengono una diversità non sfruttata di microbiomi con capacità metaboliche altrettanto diverse12. Lo sviluppo di strategie per l'isolamento di microrganismi in grado di convertire efficacemente i metalli pesanti in composti meno tossici10 rappresenta un'area di ricerca di crescente interesse a livello mondiale. Questo documento mira a descrivere un approccio semplificato per lo screening e l'isolamento dei microbi con la capacità di resistere alle ...

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Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato supportato da ERA-NET Cofund MarTERA: "FLAshMoB: Functional Amyloid Chimera for Marine Biosensing", PRIN 2017-PANACEA CUP:E69E19000530001 e da GoodbyWaste: ObtainGOOD products-exploit BY-products-reduce WASTE, MIUR 2017-JTNK78.006, Italia. Si ringraziano la Dott.ssa Monica Piochi e la Dott.ssa Angela Mormone (Istituto Nazionale di Geofisica e Vulcanologia, Sezione di Napoli Osservatorio Vesuviano, Italia) per l'identificazione e la caratterizzazione del sito geotermico.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
AmpicillinSigma AldrichA9393
Aura Minibio air s.c.r.l.Biological hood
BacitracinSigma AldrichB0125
Cadmium chlorideSigma Aldrich202908
ChloramphenicolSigma AldrichC0378
CiprofloxacinSigma Aldrich17850
Cobalt chlorideSigma AldrichC8661
Copper chlorideSigma Aldrich224332
ErythromycinSigma AldrichE5389
Exernal ServiceDSMZLeibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH
Genomic DNA Purification KitThermo Scientific#K0721
Kanamycin sulphateSigma Aldrich60615
MaxQTM 4000 Benchtop Orbital ShakerThermo ScientificSHKE4000
Mercury chlorideSigma Aldrich215465
NanoDrop 1000 SpectrophotometerThermo Scientific
Nickel chlorideSigma Aldrich654507
Orion Star A221 Portable pH MeterThermo ScientificSTARA2218
Sodium (meta) arseniteSigma AldrichS7400
Sodium arsenate dibasic heptahydrateSigma AldrichA6756
Sodium chlorideSigma AldrichS5886
StreptomycinSigma AldrichS6501
TetracyclineSigma Aldrich87128
Tryptone BioChemicaApplichem PanreacA1553
VancomycinSigma AldrichPHR1732
Yeast extract for molecular biologyApplichem Panreac A3732

Riferimenti

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