Bioprospection de micro-organismes extrêmophiles pour lutter contre la pollution de l’environnement

Résumé

L’isolement des microbes résistants aux métaux lourds des sources géothermiques est un sujet brûlant pour le développement de biosystèmes de bioremédiation et de surveillance de l’environnement. Cette étude fournit une approche méthodologique pour isoler et identifier les bactéries tolérantes aux métaux lourds des sources chaudes.

Résumé

Les sources géothermiques sont riches en divers ions métalliques en raison de l’interaction entre la roche et l’eau qui a lieu dans l’aquifère profond. De plus, en raison de la variation saisonnière du pH et de la température, une fluctuation de la composition des éléments est périodiquement observée dans ces environnements extrêmes, influençant les communautés microbiennes environnementales. Les micro-organismes extrêmophiles qui se développent dans les cheminées thermiques volcaniques ont développé des mécanismes de résistance pour gérer plusieurs ions métalliques présents dans l’environnement, participant ainsi à des cycles biogéochimiques métalliques complexes. De plus, les extrêmophiles et leurs produits ont trouvé un ancrage important sur le marché, et cela est vrai en particulier pour leurs enzymes. Dans ce contexte, leur caractérisation est fonctionnelle au développement de biosystèmes et de bioprocédés pour la surveillance de l’environnement et la bioremédiation. À ce jour, l’isolement et la culture en laboratoire de micro-organismes extrêmophiles représentent encore un goulot d’étranglement pour exploiter pleinement leur potentiel biotechnologique. Ce travail décrit un protocole simplifié pour l’isolement des micro-organismes thermophiles des sources chaudes ainsi que leur identification génotypique et phénotypique à travers les étapes suivantes: (1) Échantillonnage de micro-organismes à partir de sites géothermiques (« Pisciarelli », une zone volcanique de Campi Flegrei à Naples, Italie); (2) Isolement des micro-organismes résistants aux métaux lourds; 3° l’identification des isolats microbiens; (4) Caractérisation phénotypique des isolats. Les méthodologies décrites dans ce travail pourraient être généralement appliquées également pour l’isolement des micro-organismes d’autres environnements extrêmes.

Introduction

Les environnements extrêmes de notre planète sont d’excellentes sources de micro-organismes capables de tolérer des conditions difficiles (température, pH, salinité, pression et métaux lourds)^1,2, étant l’Islande, l’Italie, les États-Unis, la Nouvelle-Zélande, le Japon, l’Afrique centrale et l’Inde, les zones volcaniques les mieux reconnues et étudiées 3,4,5,6,7,8,9 . Les thermophiles ont évolué dans des environnements difficiles dans une gamme de températures allant de 45 °C à 80 °C 10,11,12. Les micro-organismes thermophiles, appartenant aux règnes archéal ou bactérien, sont un réservoir pour l’étude de la biodiversité, la phylogenèse et la production de biomolécules exclusives pour des applications industrielles 13,14,15,16. En effet, au cours des dernières décennies, la demande industrielle continue sur le marché mondial a encouragé l’exploitation des extrêmophiles et des thermozymes pour leurs applications diversifiées dans plusieurs domaines biotechnologiques 17,18,19.

Les sources chaudes, où les organismes vivent en consortiums, sont de riches sources de biodiversité, représentant ainsi un habitat attrayant pour étudier l’écologie microbienne^20,21. De plus, ces zones riches en métaux volcaniques sont généralement colonisées par des micro-organismes qui ont développé des systèmes de tolérance pour survivre et s’adapter à la présence de métaux lourds^22,23 et sont donc activement impliqués dans leurs cycles biogéochimiques. De nos jours, les métaux lourds sont considérés comme des polluants prioritaires pour l’homme et l’environnement. Les micro-organismes résistants aux métaux lourds sont capables de solubiliser et de précipiter les métaux en les transformant et en remodelant leurs écosystèmes^24,25. La compréhension des mécanismes moléculaires de la résistance aux métaux lourds est un sujet brûlant pour l’urgence de développer de nouvelles approches vertes 26,27,28. Dans ce contexte, la découverte de nouvelles bactéries tolérantes représente le point de départ pour le développement de nouvelles stratégies de bioremédiation environnementale^24,29. Dans le cadre des efforts visant à explorer les environnements hydrothermaux par le biais de procédures microbiologiques et à accroître les connaissances sur le rôle du ou des gènes à l’origine de la tolérance aux métaux lourds, un dépistage microbien a été effectué dans la région des sources chaudes de Campi Flegrei en Italie. Cet environnement riche en métaux lourds présente une puissante activité hydrothermale, des bassins fumaroles et bouillants, dont le pH et la température varient en fonction de la saisonnalité, des précipitations et des mouvements géologiques souterrains³⁰. Dans cette perspective, nous décrivons un moyen facile à appliquer et efficace d’isoler les bactéries résistantes aux métaux lourds, par exemple, Geobacillus stearothermophilus GF16³¹ (nommé isolat 1) et Alicyclobacillus mali FL18³² (nommé isolat 2) de la région de Pisciarelli de Campi Flegrei.

Protocole

1. Échantillonnage des micro-organismes des sites géothermiques

1. Choisissez le site d’échantillonnage en utilisant comme critère des endroits avec la température et le pH souhaités. Mesurez les paramètres physiques à l’aide d’une sonde thermocouple numérique, en l’insérant dans les piscines ou les boues sélectionnées.
2. Prélever 20 g d’échantillons de sol (dans ce cas, de la boue dans le site hydrothermal de Pisciarelli Solfatara), en les ramassant avec une cuillère stérilisée. Prélever au moins deux échantillons pour chaque site choisi.
3. Mettez les échantillons dans des tubes de polypropylène stériles de 50 mL et fermez immédiatement.
4. Mesurez le pH et la température à l’aide d’une sonde thermocouple numérique en l’insérant directement dans le site d’échantillonnage. Après utilisation, rincez soigneusement la sonde à l’eau désionisée.

2. Isolement des micro-organismes résistants aux métaux lourds

REMARQUE: Effectuez les étapes 2.1 à 2.7 sous une hotte biologique stérile.

1. Inoculer 2 g de chaque échantillon prélevé dans 50 mL de milieu Luria-Bertani (LB) fraîchement préparé, dans lequel le pH a été ajusté à 4 ou 7 par addition de HCl ou de NaOH.
2. Incuber les échantillons à la même température du site d’échantillonnage et à ±5 °C (55 °C et 60 °C pour les échantillons pisciarelli) dans un agitateur orbital à température contrôlée pendant 24 h avec une vitesse d’agitation de 180 tr/min.
3. Plaquer 200 μL des échantillons cultivés sur gélose LB (pH 4 ou pH 7) et incuber à l’état statique pendant 48 h à 55 °C ou 60 °C.
4. Isoler des colonies individuelles et répéter les cycles de stries (étapes 2.3 et 2.4) au moins trois fois.
5. Pour préparer des stocks cellulaires congelés à -80 °C, faire pousser les cultures pendant la nuit (ON) et ajouter aux cellules cultivées 20 % de glycérol (dans un volume final de 1 mL); utilisez un mélange d’acétone et de glace carbonique pour une congélation rapide.
6. Pour préparer un inoculum à partir d’un stock de glycérol, inoculer 50 μL dans 50 mL de LB (pH 4 ou pH 6) et incuber à 55 °C ou 60 °C dans l’agitateur orbital à 180 tr/min ON.
7. Pour obtenir un profil de croissance, diluer une préculture (obtenue à partir de l’étape 2.6) à 0,1 OD_{600 nm} dans 10 mL de LB (pH 4 ou pH 6), faire croître les cellules à 55 °C ou 60 °C pendant 16 h dans l’agitateur orbital et mesurer la DO_{600 nm} à des intervalles de 30 min.
8. Construisez une courbe de croissance à partir des données obtenues à l’étape 2.7 avec le temps (min) sur l’axe X et OD_{600 nm} sur l’axe Y.
9. Réaliser la même courbe de croissance décrite aux étapes 2.7 et 2.8, mais en faisant varier le pH (± 1 unité) du milieu de culture (p. ex., pH 3 et 5 pour les échantillons cultivés à pH 4) afin de déterminer le pH optimal pour les conditions de laboratoire.

3. Identification des isolats microbiens

1. Préparation de l’ADN génomique
   1. Inoculer l’isolat strié du stock de glycérol dans 50 mL de milieu LB (pH 4 ou pH 6) et croître dans un agitateur orbital à 55 °C ou 60 °C à 180 tr/min ON.
   2. Récolter la culture ON par centrifugation pendant 10 min à 5000 x g. Jetez le surnageant.
   3. Préparer 10 mL de tampon de lyse bactérienne composé de : 20 mM de Tris-HCl pH 8,0, 2 mM d’EDTA, 1,2 % de Triton X-100 et de lysozyme (20 mg/mL) immédiatement avant utilisation.
   4. Remettre en suspension la pastille dans 180 μL de tampon de lyse bactérienne. Incuber pendant 30 min à 37 °C.
   5. Suivez les directives indiquées par un kit de purification de l’ADN génomique (Table des matériaux) pour extraire l’ADN génomique.
   6. Quantifier l’ADN génomique extrait et sa pureté par mesure UV-Vis. Pour la pureté, déterminez les rapports-OD 260/280 nm et OD 260/230 nm.
   7. Évaluez l’intégrité de l’ADN génomique en chargeant 200 ng de chaque échantillon sur un gel d’agarose à 0,8 % et en comparant la distribution granulométrique à un marqueur moléculaire de poids élevé.
   8. Confier à un service externe la préparation, le séquençage et l’analyse comparative des fragments d’ARNr 16S de la séquence obtenue (1000 pb) avec ceux présents dans la base de données sur les nucléotides du National Center for Biotechnology Information (NCBI) des États-Unis(³³).
2. Pour corroborer les données du séquençage de l’ARNr 16S, effectuez également un ribotypage automatisé sur l’ADN chromosomique digéré (service externe, table des matériaux).
3. Dans le cas où l’identification de l’espèce ne peut pas être déterminée uniquement à l’aide de données de ribotypage, commander une analyse MALDI-TOF MS pour l’identification des acides gras.
4. Pour effectuer une analyse phylogénétique du genre identifié, analysez la séquence d’ARNr 16S de l’isolat avec BLASTn³⁴. Les séquences avec des identités de 99% à 97% doivent être utilisées pour construire un alignement de séquences multiples à l’aide de CLUSTAL Omega³⁵. Construisez un arbre voisin à l’aide de l’option par défaut ClustalW2 (phylogénie simple).

4. Sensibilité aux métaux lourds et aux antibiotiques

1. Inoculez l’isolat d’un stock de glycérol (voir étape 2.5) et cultivez-le dans 200 mL de LB dans les conditions optimales de pH et de température préalablement déterminées.
2. Diluer chaque préculture à 0,1 OD_{600 nm} dans 5 mL de milieu LB (au pH approprié) contenant des concentrations croissantes de métaux lourds. Les concentrations varient de 0,01 à 120 mM pour les métaux lourds [As(V), As(III), Cd(II), Co(III), Cr(VI), Cu(II), Hg(II), Ni(II), V(V)] ou de 0,5-1 mg/mL pour les antibiotiques [ampicilline, bacitracine, chloramphénicol, ciprofloxacine, érythromycine, kanamycine, streptomycine, tétracycline et vancomycine].
3. Effectuez des traitements aux métaux lourds et aux antibiotiques séparément. Utilisez un tube en polypropylène de 50 mL et faites pousser les cellules dans un agitateur orbital à température contrôlée avec une vitesse d’agitation de 180 tr/min à 55 °C ou 60 °C pendant 16 h pour chaque condition/traitement.
4. Calculer la concentration minimale inhibitrice (CMI) pour les antibiotiques ou les métaux lourds en identifiant les valeurs de concentration dans les tubes où la croissance microbienne ne se produit pas, c’est-à-dire en déterminant les valeurs qui inhibent complètement la croissance cellulaire après 16 h.
5. Vérifier que la concentration est inhibitrice et non létale pour les cellules en plaquant 200 μL de la culture cultivée à la valeur considérée comme CMI sur des plaques de gélose LB (au pH et à la température appropriés) et en vérifiant la présence de colonies après incubation ON.
   NOTE: Étant donné que la culture sur plaque de gélose LB n’est viable à 4 °C que pendant quelques semaines, afin de conserver les isolats plus longtemps, des stocks de glycérol ont été préparés et stockés à -80 °C. Pour la détermination de la CMI, au moins trois répétitions indépendantes utilisant des cultures indépendantes ont été effectuées. L’écart-type a été calculé parmi les expériences triples.

Résultats

Site d’échantillonnage
Ce protocole illustre une méthode d’isolement des bactéries résistantes aux métaux lourds d’une source chaude. Dans cette étude, la région de Pisciarelli, un environnement géothermique acido-sulfidique, a été utilisée comme site d’échantillonnage (figure 1). Cet écosystème est caractérisé par l’écoulement de fluides sulfureux agressifs dérivés des activités volcaniques. Il a été démontré que les com...

Discussion

Les sources chaudes contiennent une diversité inexploitée de microbiomes aux capacités métaboliques tout aussi diverses¹². Le développement de stratégies d’isolement des micro-organismes capables de convertir efficacement les métaux lourds en composés moins toxiques¹⁰ représente un domaine de recherche d’intérêt croissant dans le monde entier. Cet article vise à décrire une approche simplifiée pour le dépistage et l’isolement des microbes ayant la capac...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ampicillin	Sigma Aldrich	A9393
Aura Mini	bio air s.c.r.l.		Biological hood
Bacitracin	Sigma Aldrich	B0125
Cadmium chloride	Sigma Aldrich	202908
Chloramphenicol	Sigma Aldrich	C0378
Ciprofloxacin	Sigma Aldrich	17850
Cobalt chloride	Sigma Aldrich	C8661
Copper chloride	Sigma Aldrich	224332
Erythromycin	Sigma Aldrich	E5389
Exernal Service	DSMZ		Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH
Genomic DNA Purification Kit	Thermo Scientific	#K0721
Kanamycin sulphate	Sigma Aldrich	60615
MaxQTM 4000 Benchtop Orbital Shaker	Thermo Scientific	SHKE4000
Mercury chloride	Sigma Aldrich	215465
NanoDrop 1000 Spectrophotometer	Thermo Scientific
Nickel chloride	Sigma Aldrich	654507
Orion Star A221 Portable pH Meter	Thermo Scientific	STARA2218
Sodium (meta) arsenite	Sigma Aldrich	S7400
Sodium arsenate dibasic heptahydrate	Sigma Aldrich	A6756
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S5886
Streptomycin	Sigma Aldrich	S6501
Tetracycline	Sigma Aldrich	87128
Tryptone BioChemica	Applichem Panreac	A1553
Vancomycin	Sigma Aldrich	PHR1732
Yeast extract for molecular biology	Applichem Panreac	A3732