Bioprospección de microorganismos extremófilos para hacer frente a la contaminación ambiental

Resumen

El aislamiento de microbios resistentes a metales pesados de las fuentes geotérmicas es un tema candente para el desarrollo de biosistemas de biorremediación y monitoreo ambiental. Este estudio proporciona un enfoque metodológico para aislar e identificar bacterias tolerantes a metales pesados de aguas termales.

Resumen

Los manantiales geotérmicos son ricos en varios iones metálicos debido a la interacción entre la roca y el agua que tiene lugar en el acuífero profundo. Además, debido a la variación estacional en el pH y la temperatura, la fluctuación en la composición de los elementos se observa periódicamente dentro de estos ambientes extremos, influyendo en las comunidades microbianas ambientales. Los microorganismos extremófilos que prosperan en los respiraderos térmicos volcánicos han desarrollado mecanismos de resistencia para manejar varios iones metálicos presentes en el medio ambiente, participando así en complejos ciclos biogeoquímicos metálicos. Además, los extremófilos y sus productos han encontrado un amplio punto de apoyo en el mercado, y esto es cierto especialmente para sus enzimas. En este contexto, su caracterización es funcional al desarrollo de biosistemas y bioprocesos para el monitoreo ambiental y la biorremediación. Hasta la fecha, el aislamiento y el cultivo en condiciones de laboratorio de microorganismos extremófilos siguen representando un cuello de botella para explotar plenamente su potencial biotecnológico. Este trabajo describe un protocolo simplificado para el aislamiento de microorganismos termófilos de aguas termales, así como su identificación genotípica y fenotípica a través de los siguientes pasos: (1) Muestreo de microorganismos de sitios geotérmicos ("Pisciarelli", un área volcánica de Campi Flegrei en Nápoles, Italia); (2) Aislamiento de microorganismos resistentes a metales pesados; (3) Identificación de aislados microbianos; (4) Caracterización fenotípica de los aislados. Las metodologías descritas en este trabajo podrían aplicarse generalmente también para el aislamiento de microorganismos de otros ambientes extremos.

Introducción

Los ambientes extremos de nuestro planeta son excelentes fuentes de microorganismos capaces de tolerar condiciones duras (es decir, temperatura, pH, salinidad, presión y metales pesados)^1,2, siendo Islandia, Italia, ESTADOS UNIDOS, Nueva Zelanda, Japón, África Central e India, las áreas volcánicas más reconocidas y estudiadas ^{3,4,5,6,7,8,9} . Los termófilos han evolucionado en ambientes hostiles en un rango de temperaturas de 45 °C a 80 °C 10,11,12. Los microorganismos termófilos, ya sean pertenecientes a los reinos arqueal o bacteriano, son un reservorio para el estudio de la biodiversidad, la filogénesis y la producción de biomoléculas exclusivas para aplicaciones industriales 13,14,15,16. De hecho, en las últimas décadas, la continua demanda industrial en el mercado global ha fomentado la explotación de extremófilos y termozimas para sus aplicaciones diversificadas en varios campos biotecnológicos 17,18,19.

Las aguas termales, donde los organismos viven en consorcios, son ricas fuentes de biodiversidad, representando así un hábitat atractivo para estudiar la ecología microbiana^20,21. Además, estas áreas volcánicas ricas en metales son comúnmente colonizadas por microorganismos que han desarrollado sistemas de tolerancia para sobrevivir y adaptarse a la presencia de metales pesados^22,23 y, por lo tanto, participan activamente en sus ciclos biogeoquímicos. Hoy en día, los metales pesados se consideran contaminantes prioritarios para los seres humanos y el medio ambiente. Los microorganismos resistentes a metales pesados son capaces de solubilizar y precipitar metales transformándolos y remodelando sus ecosistemas^24,25. La comprensión de los mecanismos moleculares de la resistencia a metales pesados es un tema candente para la urgencia de desarrollar nuevos enfoques verdes 26,27,28. En este contexto, el descubrimiento de nuevas bacterias tolerantes representa el punto de partida para desarrollar nuevas estrategias de biorremediación ambiental^24,29. Para acompañar los esfuerzos para explorar ambientes hidrotermales a través de procedimientos microbiológicos y aumentar el conocimiento sobre el papel del gen (s) que sustenta la tolerancia a los metales pesados, se realizó un cribado microbiano en el área de aguas termales de Campi Flegrei en Italia. Este ambiente rico en metales pesados muestra una poderosa actividad hidrotermal, fumarola y piscinas hirviendo, variables en pH y temperatura en dependencia de la estacionalidad, las precipitaciones y los movimientos geológicos subterráneos³⁰. En esta perspectiva, describimos una forma fácil de aplicar y eficaz de aislar bacterias resistentes a metales pesados, por ejemplo, Geobacillus stearothermophilus GF16³¹ (nombrado como aislado 1) y Alicyclobacillus mali FL18³² (nombrado como aislado 2) del área de Pisciarelli de Campi Flegrei.

Protocolo

1. Muestreo de microorganismos de sitios geotérmicos

1. Elija el sitio para el muestreo utilizando como criterio lugares con la temperatura y el pH deseados. Mida los parámetros físicos a través de una sonda de termopar digital, insertándola en las piscinas o lodos seleccionados.
2. Recolecte 20 g de muestras de suelos (en este caso, de lodo en el sitio hidrotermal de Pisciarelli Solfatara), recogiéndolos con una cuchara esterilizada. Tome al menos dos muestras para cada sitio elegido.
3. Coloque las muestras en tubos de polipropileno estéril de 50 ml y cierre inmediatamente.
4. Mida el pH y la temperatura con una sonda de termopar digital insertándola directamente en el sitio de muestreo. Después de su uso, enjuague la sonda cuidadosamente con agua desionizada.

2. Aislamiento de microorganismos resistentes a metales pesados

NOTA: Realice los pasos 2.1-2.7 bajo una capucha biológica estéril.

1. Inocular 2 g de cada muestra recogida en 50 ml de medio Luria-Bertani (LB) recién preparado, en el que el pH se ha ajustado a 4 o 7 mediante la adición de HCl o NaOH.
2. Incubar las muestras a la misma temperatura del sitio de muestreo y a ±5 °C (55 °C y 60 °C para muestras de Pisciarelli) en un agitador orbital con temperatura controlada durante 24 h con una velocidad de agitación de 180 rpm.
3. Placa 200 μL de las muestras cultivadas en agar LB (pH 4 o pH 7) e incubar en condiciones estáticas durante 48 h a 55 °C o 60 °C.
4. Aísle las colonias individuales y repita los ciclos de recubrimiento de rayas (pasos 2.3 y 2.4) al menos tres veces.
5. Para preparar reservas de células congeladas a -80 °C, cultive los cultivos durante la noche (ON) y agregue a las células cultivadas un 20% de glicerol (en un volumen final de 1 ml); use una mezcla de acetona y hielo seco para una congelación rápida.
6. Para preparar un inóculo a partir de una cepa de glicerol, inocular 50 μL en 50 ml de LB (pH 4 o pH 6) e incubar a 55 °C o 60 °C en el agitador orbital a 180 rpm ON.
7. Para obtener un perfil de crecimiento, diluya un precultivo (obtenido desde el paso 2.6) a 0.1 OD_{600 nm} en 10 mL de LB (pH 4 o pH 6), haga crecer las células a 55 °C o 60 °C durante 16 h en el agitador orbital y mida el OD_{600 nm} a intervalos de 30 min.
8. Construya una curva de crecimiento a partir de los datos obtenidos en el paso 2.7 con tiempo (min) en el eje X y OD_{600 nm} en el eje Y.
9. Realice la misma curva de crecimiento descrita en los pasos 2.7 y 2.8, pero variando el pH (± 1 unidad) del medio de cultivo (por ejemplo, pH 3 y 5 para muestras cultivadas a pH 4) para determinar el pH óptimo para condiciones de laboratorio.

3. Identificación de aislados microbianos

1. Preparación de ADN genómico
   1. Inocular el aislado rayado de la cepa de glicerol en 50 mL de lb medio (pH 4 o pH 6) y crecer en un agitador orbital a 55 °C o 60 °C a 180 rpm ON.
   2. Cosechar el cultivo ON por centrifugación durante 10 min a 5000 x g. Deseche el sobrenadante.
   3. Preparar 10 mL de tampón de lisis bacteriana compuesto por: 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 2 mM EDTA, 1.2% Triton X-100 y lisozima (20 mg/mL) inmediatamente antes de su uso.
   4. Resuspend el pellet en 180 μL de tampón de lisis de bacterias. Incubar durante 30 min a 37 °C.
   5. Siga las pautas indicadas por un kit de purificación de ADN genómico (Tabla de materiales) para extraer ADN genómico.
   6. Cuantificar el ADN genómico extraído y su pureza mediante medición UV-Vis. Para la pureza, determine las proporciones: OD 260/280 nm y OD 260/230 nm.
   7. Evaluar la integridad del ADN genómico cargando 200 ng de cada muestra en un gel de agarosa al 0,8% y comparando la distribución del tamaño con un marcador molecular de alto peso.
   8. Encarga a un servicio externo la preparación del fragmento de ARNr 16S, secuenciación y análisis comparativo de la secuencia obtenida (1000 pb) con las presentes en la base de datos de nucleótidos del Centro Nacional de Información Biotecnológica de Estados Unidos (NCBI)³³.
2. Para corroborar los datos de la secuenciación del ARNr 16S, también se realiza un ribotipado automatizado sobre el ADN cromosómico digerido (servicio externo, Tabla de Materiales).
3. En el caso de que la identificación de la especie no pueda determinarse únicamente con datos de ribotipado, encargar un análisis MALDI-TOF MS para la identificación de ácidos grasos.
4. Para realizar un análisis filogenético del género identificado, analizar la secuencia de ARNr 16S del aislado con BLASTn³⁴. Las secuencias con identidades del 99% al 97% deben usarse para construir una alineación de secuencia múltiple utilizando CLUSTAL Omega³⁵. Construya un árbol de unión al vecino utilizando la opción predeterminada de ClustalW2 (Filogenia simple).

4. Susceptibilidad a los metales pesados y los antibióticos

1. Inocular el aislado de un stock de glicerol (ver paso 2.5) y cultivarlo en 200 mL de LB bajo las condiciones óptimas de pH y temperatura previamente determinadas.
2. Diluir cada precultivo a 0,1 OD_{600 nm} en 5 ml de lb medio (al pH apropiado) que contenga concentraciones crecientes de metales pesados. Las concentraciones varían de 0.01-120 mM para metales pesados [As(V), As(III), Cd(II), Co(III), Cr(VI), Cu(II), Hg(II), Ni(II), V(V)] o 0.5-1 mg/mL para los antibióticos [Ampicilina, Bacitracina, Cloranfenicol, Ciprofloxacina, Eritromicina, Kanamicina, Estreptomicina, Tetraciclina y Vancomicina].
3. Realice tratamientos con metales pesados y antibióticos por separado. Utilice un tubo de polipropileno de 50 ml y haga crecer las células en un agitador orbital con temperatura controlada con una velocidad de agitación de 180 rpm a 55 °C o 60 °C durante 16 h para cada condición/tratamiento.
4. Calcular la Concentración Inhibitoria Mínima (CMI) ya sea para antibióticos o metales pesados identificando los valores de concentración en los tubos donde no se produce crecimiento microbiano, es decir, determinando los valores que inhiben completamente el crecimiento celular después de 16 h.
5. Comprobar que la concentración es inhibitoria y no letal para las células mediante el recubrimiento de 200 μL del cultivo cultivado al valor que se considera como MIC en placas lb-agar (al pH y temperatura adecuados) y verificando la presencia de colonias después de la incubación ON.
   NOTA: Dado que el cultivo en placa de agar LB es viable a 4 °C solo durante unas pocas semanas, para preservar los aislados durante más tiempo, se prepararon y almacenaron existencias de glicerol a -80 °C. Para la determinación de la CMI, se llevaron a cabo al menos tres réplicas independientes utilizando cultivos independientes. La desviación estándar se calculó entre experimentos triplicados.

Resultados

Sitio de muestreo
Este protocolo ilustra un método para el aislamiento de bacterias resistentes a metales pesados de una fuente termal. En este estudio, el área de Pisciarelli, un ambiente geotérmico ácido-sulfídico, se utilizó como sitio de muestreo (Figura 1). Este ecosistema se caracteriza por el flujo de fluidos sulfurosos agresivos derivados de actividades volcánicas. Se ha demostrado que las comunidades microbianas en los sistemas geotérmico...

Discusión

Las aguas termales contienen una diversidad sin explotar de microbiomas con capacidades metabólicas igualmente diversas¹². El desarrollo de estrategias para el aislamiento de microorganismos que puedan convertir eficientemente metales pesados en compuestos menos tóxicos¹⁰ representa un área de investigación de creciente interés a nivel mundial. Este documento tiene como objetivo describir un enfoque simplificado para la detección y el aislamiento de microbios con la c...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ampicillin	Sigma Aldrich	A9393
Aura Mini	bio air s.c.r.l.		Biological hood
Bacitracin	Sigma Aldrich	B0125
Cadmium chloride	Sigma Aldrich	202908
Chloramphenicol	Sigma Aldrich	C0378
Ciprofloxacin	Sigma Aldrich	17850
Cobalt chloride	Sigma Aldrich	C8661
Copper chloride	Sigma Aldrich	224332
Erythromycin	Sigma Aldrich	E5389
Exernal Service	DSMZ		Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH
Genomic DNA Purification Kit	Thermo Scientific	#K0721
Kanamycin sulphate	Sigma Aldrich	60615
MaxQTM 4000 Benchtop Orbital Shaker	Thermo Scientific	SHKE4000
Mercury chloride	Sigma Aldrich	215465
NanoDrop 1000 Spectrophotometer	Thermo Scientific
Nickel chloride	Sigma Aldrich	654507
Orion Star A221 Portable pH Meter	Thermo Scientific	STARA2218
Sodium (meta) arsenite	Sigma Aldrich	S7400
Sodium arsenate dibasic heptahydrate	Sigma Aldrich	A6756
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S5886
Streptomycin	Sigma Aldrich	S6501
Tetracycline	Sigma Aldrich	87128
Tryptone BioChemica	Applichem Panreac	A1553
Vancomycin	Sigma Aldrich	PHR1732
Yeast extract for molecular biology	Applichem Panreac	A3732