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要約

地熱泉からの重金属耐性微生物の単離は、バイオレメディエーションおよび環境モニタリングバイオシステムの開発にとってホットな話題である。この研究は、温泉から重金属耐性菌を単離し同定するための方法論的アプローチを提供する。

要約

地熱泉は、深い帯水層で起こる岩石と水の相互作用により、様々な金属イオンが豊富です。また、pHや温度の季節変動により、これらの極限環境内では元素組成の変動が周期的に観測され、微生物群集の環境に影響を与えています。火山の熱噴出孔で繁栄する極限環境微生物は、環境中に存在するいくつかの金属イオンを処理する耐性メカニズムを開発し、複雑な金属生物地球化学サイクルに参加しています。さらに、極限環境とその製品は市場で広範な足がかりを見つけており、これは特に彼らの酵素に当てはまります。この文脈において、それらの特性評価は、環境モニタリングおよびバイオレメディエーションのためのバイオシステムおよびバイオプロセスの開発に機能する。今日まで、極限環境微生物の実験室条件下での単離と培養は、依然としてバイオテクノロジーの可能性を十分に活用するためのボトルネックとなっています。この研究は、温泉からの好熱性微生物の単離のための合理化されたプロトコルと、次のステップによるそれらの遺伝子型および表現型の同定について記述している:(1)地熱地帯(「Pisciarelli」、イタリアのナポリのカンピ・フレグレイの火山地帯)からの微生物のサンプリング。(2)重金属耐性微生物の単離;(3)微生物分離株の同定;(4)分離株の表現型特性評価。この研究で説明されている方法論は、他の極端な環境からの微生物の単離にも一般的に適用される可能性がある。

概要

地球上の極限環境は、アイスランド、イタリア、アメリカ、ニュージーランド、日本、中央アフリカ、インドなど、過酷な条件(温度、pH、塩分濃度、圧力、重金属)に耐えることができる微生物の優れた供給源であり、最も認識され研究されている火山地域3,4,5,6,7,8,9です。.好熱剤は、45°Cから80°Cまでの過酷な環境で進化してきました10,11,12。好熱性微生物は、古細菌または細菌界に属するか、生物多様性、系統発生、および産業用途のための排他的な生体分子の生産の研究のための貯蔵庫である13、14、15、16。実際、過去数十年間、世界市場における継続的な産業需要は、いくつかのバイオテクノロジー分野での多様な用途のための極限環境およびサーモザイムの搾取を奨励してきた17,18,19。

生物がコンソーシアムで生息する温泉は、生物多様性の豊かな源泉であり、微生物生態学を研究するのに魅力的な生息地である20,21。さらに、これらの火山性金属が豊富な地域は、重金属22,23の存在に生き残り、適応するために耐性システムを進化させた微生物によって一般的に植民地化されているため、生物地球化学的サイクルに積極的に関与しています。今日、重金属は人間と環境にとって優先的な汚染物質と考えられています。重金属耐性微生物は、金属を形質転換し、生態系を再構築することによって、金属を可溶化および沈殿させることができる24,25。重金属耐性の分子メカニズムの理解は、新しいグリーンアプローチ26,27,28を開発する緊急性のためのホットな話題です。この文脈において、新しい耐性細菌の発見は、環境バイオレメディエーションのための新しい戦略を開発するための出発点を表す24,29。微生物学的手順を通じて熱水環境を探索し、重金属耐性を支える遺伝子の役割に関する知識を増やす努力に伴い、イタリアのカンピフレグレイの温泉地域で微生物スクリーニングが行われました。この重金属が豊富な環境は、季節性、降雨量、地下の地質学的動きに応じてpHと温度が変化する強力な熱水活動、噴気孔、沸騰プールを示しています30。この視点では、重金属に耐性のある細菌、例えば、Geobacillus stearothermophilus GF1631(単離物1として命名)およびAlicyclobacillus mali FL1832(単離物2として命名)をカンピフレグレイのピシアレッリ地域から単離するための適用が容易で効果的な方法を説明する。

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プロトコル

1. 地熱地帯からの微生物のサンプリング

  1. 所望の温度とpHを有する場所を基準として使用してサンプリングする部位を選択する。デジタル熱電対プローブを介して物理パラメータを測定し、選択したプールまたは泥に挿入します。
  2. 20gの土壌サンプル(この場合は、Pisciarelli Solfataraの熱水サイトの泥から)を収集し、滅菌されたスプーンでそれらを拾う。選択した各サイトについて、少なくとも 2 つのサンプルを取得します。
  3. サンプルを50mL滅菌ポリプロピレンチューブに入れ、直ちに閉じる。
  4. デジタル熱電対プローブをサンプリングサイトに直接挿入して、pHと温度を測定します。使用後は、プローブをイオン交換水で丁寧にすすいでください。

2. 重金属耐性微生物の単離

メモ:手順2.1~2.7を滅菌した生体フードの下で実行します。

  1. 採取した各試料の2gを、HClまたはNaOHを添加してpHが4または7に調整された50mLの新しく調製したルリア・ベルタニ培地(LB)に接種する。
  2. サンプルをサンプリング部位の同じ温度で、±5°C(ピシアレリサンプルの場合は55°Cおよび60°C)で、温度制御されたオービタルシェーカーで180rpmの振とう速度で24時間インキュベートする。
  3. 増殖したサンプルをLB寒天(pH4またはpH7)上で200μLのプレートに、55°Cまたは60°Cで48時間静置条件下でインキュベートする。
  4. シングルコロニーを分離し、ストリークプレーティングサイクル(ステップ2.3および2.4)を少なくとも3回繰り返します。
  5. -80°C凍結細胞ストックを調製するために、培養物を一晩(ON)増殖させ、増殖した細胞に20%グリセロール(1mLの最終容量で)を加える。アセトンとドライアイスを混ぜて急速凍結してください。
  6. グリセロールストックから接種剤を調製するには、50 μLを50 mLのLB(pH 4またはpH 6)に接種し、180 rpm ONのオービタルシェーカーで55°Cまたは60°Cでインキュベートします。
  7. 増殖プロファイルを得るためには、前培養物(ステップ2.6から得られた)を10 mLのLB(pH4またはpH6)で0.1 OD 600 nmに希釈し、55°Cまたは60°Cで細胞を軌道振とう機で16 時間増殖させ、30分間隔でOD600 nm を測定する。
  8. ステップ2.7で得られたデータから、X軸に時間(分)、Y軸にOD600nm で成長曲線を構築します。
  9. ステップ2.7および2.8で説明したのと同じ増殖曲線を実現するが、培養液のpH(±1単位)を変化させ(例えば、pH4で増殖させたサンプルのpH3および5)、実験室条件に最適なpHを決定する。

3. 微生物分離株の同定

  1. ゲノムDNAの作製
    1. グリセロールストックからストリークした分離株を50mLのLB培地(pH4またはpH6)に接種し、55°Cまたは60°Cのオービタルシェーカーで180rpmのONで増殖させる。
    2. ON培養物を5000 x gで10分間遠心分離して収穫する。上清を捨てる。
    3. 使用直前に、20 mM Tris-HCl pH 8.0、2 mM EDTA、1.2% Triton X-100、およびリゾチーム(20 mg/mL)で構成される細菌溶解バッファー10 mLを調製します。
    4. ペレットを180μLの細菌溶解緩衝液に再懸濁する。37°Cで30分間インキュベートする。
    5. ゲノム DNA 精製キット (材料表) に示されているガイドラインに従って、ゲノム DNA を抽出します。
    6. 抽出したゲノムDNAとその純度をUV-Vis測定により定量する。純度については、OD 260/280 nmおよびOD 260/230 nmの比を決定する。
    7. 各サンプルの 200 ng を 0.8% アガロースゲルにロードし、サイズ分布を高分子マーカーと比較することにより、ゲノム DNA の完全性を評価します。
    8. 16S rRNA断片の調製、シーケンシング、および得られた配列(1000bp)と米国国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)のヌクレオチドデータベースに存在するものとの比較分析を外部サービスに委託する33。
  2. 16S rRNAシーケンシングのデータを裏付けるために、消化された染色体DNAに対して自動リボタイピングも行う(外部サービス、 材料表)。
  3. リボタイピングデータだけでは正種同定ができない場合は、脂肪酸同定のためのMALDI-TOF MS 分析を依頼してください。
  4. 同定された属の系統解析を行うには、単離物の16S rRNA配列をBLASTn34で解析する。99%~97%の同一性を持つ配列は、CLUSTAL Omega35を使用して複数の配列アラインメントを構築するために使用する必要があります。ClustalW2 (Simple Phylogeny) のデフォルトオプションを使用して近傍結合ツリーを構築します。

4. 重金属および抗生物質感受性

  1. グリセロールストックから単離物を接種し(ステップ2.5を参照)、以前に決定した最適pHおよび温度条件下で200mLのLB中で増殖させる。
  2. 各前培養物を、増加する濃度の重金属を含む5mLのLB培地(適切なpHで)中で0.1OD 600 nm で希釈する。濃度は、重金属[As(V)、As(III)、Cd(II)、Co(III)、Cr(VI)、Cu(II)、Hg(II)、Ni(II)、V(V)]の場合は0.01〜120mM、抗生物質[アンピシリン、バシトラシン、クロラムフェニコール、シプロフロキサシン、エリスロマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、およびバンコマイシン]の場合は0.5〜1mg / mLの範囲で変化します。
  3. 重金属と抗生物質の治療を別々に行います。50 mLポリプロピレンチューブを使用し、各条件/処理ごとに55°Cまたは60°Cで180rpmの振とう速度で16時間、温度制御されたオービタルシェーカーで細胞を増殖させます。
  4. 微生物の増殖が起こらないチューブ内の濃度値を特定することによって、抗生物質または重金属の最小阻害濃度(MIC)を計算する、すなわち、16時間後に細胞増殖を完全に阻害する値を決定する。
  5. LB-agarプレートにMICと見なされる値で増殖させた培養物200 μLを(適切なpHおよび温度で)プレーティングし、ONインキュベーション後のコロニーの存在を確認することにより、濃度が細胞に対して阻害性であり、致死的ではないことを確認する。
    注:LB寒天プレート上での培養は4°Cで数週間しか生存できないため、分離株をより長期間保存するために、グリセロールストックを調製し、-80°Cで保存した。 MIC決定のために、独立した培養物を用いて少なくとも3つの独立した複製が実施された。標準偏差は、3連の実験間で計算した。

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結果

サンプリングサイト
このプロトコルは、温泉から重金属耐性菌を単離する方法を示すものである。本研究では、酸性・亜硫酸系地熱環境であるピシアレリ地域をサンプリングサイトとして用いた(図1)。この生態系は、火山活動に由来する攻撃的な硫黄流体の流れによって特徴付けられる。酸性 - 硫化地熱系の微生物群集は、高濃度の重金属?...

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ディスカッション

温泉には、同様に多様な代謝能力を持つ未開発の多様な微生物叢が含まれています12。重金属を毒性の低い化合物に効率的に変換できる微生物の単離戦略の開発10 は、世界中で関心が高まっている研究分野です。この論文は、有毒化学物質に抵抗する能力を持つ微生物のスクリーニングと単離のための合理化されたアプローチを記述することを目的として?...

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開示事項

著者らは、利益相反はないと宣言している。

謝辞

この研究は、ERA-NET Cofund MarTERA: "FLAshMoB: Functional Amyloid Chimera for Marine Biosensing", PRIN 2017-PANACEA CUP:E69E19000530001 および GoodbyWaste: GetGOOD products-exploit BY-products-reduce WASTE, MIUR 2017-JTNK78.006, Italyの支援を受けた。我々は、地熱地帯の特定と特徴付けについて、モニカ・ピオチ博士とアンジェラ・モルモン博士(Istituto Nazionale di Geofisica e Vulcanologia, Sezione di Napoli Osservatorio Vesuviano, Italy)に感謝する。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
AmpicillinSigma AldrichA9393
Aura Minibio air s.c.r.l.Biological hood
BacitracinSigma AldrichB0125
Cadmium chlorideSigma Aldrich202908
ChloramphenicolSigma AldrichC0378
CiprofloxacinSigma Aldrich17850
Cobalt chlorideSigma AldrichC8661
Copper chlorideSigma Aldrich224332
ErythromycinSigma AldrichE5389
Exernal ServiceDSMZLeibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH
Genomic DNA Purification KitThermo Scientific#K0721
Kanamycin sulphateSigma Aldrich60615
MaxQTM 4000 Benchtop Orbital ShakerThermo ScientificSHKE4000
Mercury chlorideSigma Aldrich215465
NanoDrop 1000 SpectrophotometerThermo Scientific
Nickel chlorideSigma Aldrich654507
Orion Star A221 Portable pH MeterThermo ScientificSTARA2218
Sodium (meta) arseniteSigma AldrichS7400
Sodium arsenate dibasic heptahydrateSigma AldrichA6756
Sodium chlorideSigma AldrichS5886
StreptomycinSigma AldrichS6501
TetracyclineSigma Aldrich87128
Tryptone BioChemicaApplichem PanreacA1553
VancomycinSigma AldrichPHR1732
Yeast extract for molecular biologyApplichem Panreac A3732

参考文献

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