Bioprospektion extremophiler Mikroorganismen zur Bekämpfung der Umweltverschmutzung

Zusammenfassung

Die Isolierung von schwermetallbeständigen Mikroben aus geothermischen Quellen ist ein heißes Thema für die Entwicklung von Bioremediations- und Umweltüberwachungsbiosystemen. Diese Studie bietet einen methodischen Ansatz zur Isolierung und Identifizierung von schwermetalltoleranten Bakterien aus heißen Quellen.

Zusammenfassung

Geothermische Quellen sind aufgrund der Wechselwirkung zwischen Gestein und Wasser, die im tiefen Grundwasserleiter stattfindet, reich an verschiedenen Metallionen. Darüber hinaus wird aufgrund der saisonalen Variation von pH-Wert und Temperatur in diesen extremen Umgebungen periodisch eine Fluktuation der Elementzusammensetzung beobachtet, die die mikrobiellen Umweltgemeinschaften beeinflusst. Extremophile Mikroorganismen, die in vulkanischen Wärmequellen gedeihen, haben Resistenzmechanismen entwickelt, um mehrere in der Umwelt vorhandene Metallionen zu handhaben und so an komplexen biogeochemischen Metallkreisläufen teilzunehmen. Darüber hinaus haben Extremophile und ihre Produkte auf dem Markt Fuß gefasst, und dies gilt insbesondere für ihre Enzyme. In diesem Zusammenhang ist ihre Charakterisierung funktional für die Entwicklung von Biosystemen und Bioprozessen zur Umweltüberwachung und Bioremediation. Bis heute stellen die Isolierung und Kultivierung extremophiler Mikroorganismen unter Laborbedingungen einen Engpass dar, um ihr biotechnologisches Potenzial voll auszuschöpfen. Diese Arbeit beschreibt ein optimiertes Protokoll zur Isolierung thermophiler Mikroorganismen aus heißen Quellen sowie deren genotypische und phänotypische Identifizierung durch die folgenden Schritte: (1) Probenahme von Mikroorganismen aus geothermischen Gebieten ("Pisciarelli", ein vulkanisches Gebiet von Campi Flegrei in Neapel, Italien); (2) Isolierung von schwermetallresistenten Mikroorganismen; (3) Identifizierung von mikrobiellen Isolaten; (4) Phänotypische Charakterisierung der Isolate. Die in dieser Arbeit beschriebenen Methoden können im Allgemeinen auch für die Isolierung von Mikroorganismen aus anderen extremen Umgebungen angewendet werden.

Einleitung

Die extremen Umgebungen auf unserem Planeten sind ausgezeichnete Quellen für Mikroorganismen, die in der Lage sind, raue Bedingungen (d.h. Temperatur, pH-Wert, Salzgehalt, Druck und Schwermetalle) zu ^{tolerieren1,2}, wobei Island, Italien, USA, Neuseeland, Japan, Zentralafrika und Indien, die am besten anerkannten und untersuchten vulkanischen Gebiete^sind 3,4,5,6,7,8,9 . Thermophile haben sich in rauen Umgebungen in einem Temperaturbereich von 45 °C bis 80 °C^10,11,12 entwickelt. Thermophile Mikroorganismen, die entweder zum archaealen oder bakteriellen Königreich gehören, sind ein Reservoir für das Studium der Biodiversität, der Phylogenese und der Produktion exklusiver Biomoleküle für industrielle Anwendungen ^13,14,15,16. In der Tat hat in den letzten Jahrzehnten die kontinuierliche industrielle Nachfrage auf dem Weltmarkt die Ausbeutung von Extremophilen und Thermozymen für ihre vielfältigen Anwendungen in verschiedenen biotechnologischen Bereichen gefördert ^17,18,19.

Heiße Quellen, in denen Organismen in Konsortien leben, sind reiche Quellen der biologischen Vielfalt und stellen somit einen attraktiven Lebensraum für die Erforschung der mikrobiellen Ökologie^{dar 20,21}. Darüber hinaus werden diese vulkanischen metallreichen Gebiete häufig von Mikroorganismen besiedelt, die Toleranzsysteme entwickelt haben, um zu überleben und sich an das Vorhandensein von Schwermetallen anzupassen^22,23 und daher aktiv an ihren biogeochemischen ^Kreisläufen beteiligt sind. Schwermetalle gelten heute als prioritäre Schadstoffe für Mensch und Umwelt. Die schwermetallresistenten Mikroorganismen sind in der Lage, Metalle zu lösen und auszufällen, indem sie sie transformieren und ihre Ökosysteme umgestalten^24,25. Das Verständnis der molekularen Mechanismen der Schwermetallresistenz ist ein heißes Thema für die Dringlichkeit, neuartige grüne Ansätze zu entwickeln^26,27,28. In diesem Zusammenhang stellt die Entdeckung neuer toleranter Bakterien den Ausgangspunkt für die Entwicklung neuer Strategien zur ökologischen Bioremediation^{dar 24,29}. Begleitend zu den Bemühungen, hydrothermale Umgebungen durch mikrobiologische Verfahren zu erforschen und das Wissen über die Rolle der Gene, die der Schwermetalltoleranz zugrunde liegen, zu erweitern, wurde ein mikrobielles Screening im Thermalgebiet von Campi Flegrei in Italien durchgeführt. Diese schwermetallreiche Umgebung zeigt eine starke hydrothermale Aktivität, Fumarol- und Siedebecken, die in Abhängigkeit von Saisonalität, Niederschlag und geologischen unterirdischen Bewegungen variabel^{sind 30}. In dieser Perspektive beschreiben wir eine einfach anzuwendende und wirksame Möglichkeit, Bakterien, die gegen Schwermetalle resistent sind, zu isolieren, zum Beispiel Geobacillus stearothermophilus GF16³¹ (benannt als Isolat 1) und Alicyclobacillus mali ^{FL18 32} (benannt als Isolat 2) aus dem Pisciarelli-Gebiet von Campi Flegrei.

Protokoll

1. Probenahme von Mikroorganismen aus geothermischen Standorten

1. Wählen Sie den Ort für die Probenahme anhand von Kriterienorten mit gewünschter Temperatur und pH-Wert. Messen Sie die physikalischen Parameter durch eine digitale Thermoelementsonde und führen Sie sie in die ausgewählten Becken oder Schlämme ein.
2. Sammeln Sie 20 g Bodenproben (in diesem Fall aus Schlamm in der hydrothermalen Stätte von Pisciarelli Solfatara) und sammeln Sie sie mit einem sterilisierten Löffel. Nehmen Sie mindestens zwei Proben für jeden ausgewählten Standort.
3. Legen Sie die Proben in 50 ml sterile Polypropylenröhrchen und schließen Sie sie sofort.
4. Messen Sie pH-Wert und Temperatur mit einer digitalen Thermoelementsonde, indem Sie sie direkt in die Probenahmestelle einführen. Nach Gebrauch die Sonde vorsichtig mit entionisiertem Wasser abspülen.

2. Isolierung von schwermetallresistenten Mikroorganismen

HINWEIS: Führen Sie die Schritte 2.1-2.7 unter einer sterilen biologischen Haube aus.

1. Inokkulieren Sie 2 g jeder gesammelten Probe in 50 ml frisch zubereitetes Luria-Bertani-Medium (LB), in dem der pH-Wert durch Zugabe von HCl oder NaOH auf 4 oder 7 eingestellt wurde.
2. Die Proben werden bei der gleichen Temperatur der Probenahmestelle und bei ±5 °C (55 °C und 60 °C für Pisciarelli-Proben) in einem temperaturgesteuerten Orbitalschüttler für 24 h mit einer Schüttelrate von 180 U/min inkubiert.
3. Platte 200 μL der gezüchteten Proben auf LB-Agar (pH 4 oder pH 7) und Inkubation im statischen Zustand für 48 h bei 55 °C oder 60 °C.
4. Isolieren Sie einzelne Kolonien und wiederholen Sie die Streifenplattierungszyklen (Schritte 2.3 und 2.4) mindestens dreimal.
5. Um -80 °C gefrorene Zellbestände herzustellen, züchten Sie die Kulturen über Nacht (ON) und fügen Sie den gezüchteten Zellen 20% Glycerin (in einem Endvolumen von 1 ml) hinzu; Verwenden Sie eine Mischung aus Aceton und Trockeneis für schnelles Einfrieren.
6. Um ein Inokulum aus einem Glycerinbestand herzustellen, impfen Sie 50 μL in 50 ml LB (pH 4 oder pH 6) und inkubieren Sie bei 55 °C oder 60 °C im Orbitalschüttler bei 180 U/min ON.
7. Um ein Wachstumsprofil zu erhalten, verdünnen Sie eine Vorkultur (erhalten aus Schritt 2.6) auf 0,1 OD 600 nm in 10 ml LB (pH 4 oder pH 6), züchten Sie die Zellen bei 55 °C oder 60 °C für 16 h im Orbitalshaker und messen Sie die OD_{600 nm} in_{30-minütigen} Abständen.
8. Konstruieren Sie eine Wachstumskurve aus den in Schritt 2.7 erhaltenen Daten mit Zeit (min) auf der X-Achse und OD_{600 nm} auf der Y-Achse.
9. Realisieren Sie die gleiche Wachstumskurve, die in den Schritten 2.7 und 2.8 beschrieben ist, variieren Sie jedoch den pH-Wert (± 1 Einheit) des Kulturmediums (z. B. pH 3 und 5 für Proben, die mit pH 4 gezüchtet wurden), um den optimalen pH-Wert für Laborbedingungen zu bestimmen.

3. Identifizierung mikrobieller Isolate

1. Präparation genomischer DNA
   1. Beimpfen Sie das aus dem Glycerinbestand gestreifte Isolat in 50 ml LB-Medium (pH 4 oder pH 6) und wachsen Sie in einem Orbitalschüttler bei 55 ° C oder 60 ° C bei 180 U / min ON.
   2. Ernten Sie die ON-Kultur durch Zentrifugation für 10 min bei 5000 x g. Verwerfen Sie den Überstand.
   3. Bereiten Sie 10 ml Bakterienlysepuffer vor, der sich wie folgt zusammensetzt: 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 2 mM EDTA, 1,2% Triton X-100 und Lysozym (20 mg/ml) unmittelbar vor der Anwendung.
   4. Resuspendiert das Pellet in 180 μL Bakterienlysepuffer. 30 min bei 37 °C inkubieren.
   5. Befolgen Sie die Richtlinien, die von einem Genomic DNA Purification Kit (Table of Materials) angegeben sind, um genomische DNA zu extrahieren.
   6. Quantifizieren Sie die extrahierte genomische DNA und ihre Reinheit durch UV-Vis-Messung. Für die Reinheit bestimmen Sie die Verhältnisse OD 260/280 nm und OD 260/230 nm.
   7. Bewerten Sie die Integrität der genomischen DNA, indem Sie 200 ng jeder Probe auf ein 0,8% Agarosegel laden und die Größenverteilung mit einem hochgewichtigen molekularen Marker vergleichen.
   8. Beauftragung eines externen Dienstes der 16S rRNA-Fragmentpräparation, Sequenzierung und vergleichenden Analyse der erhaltenen Sequenz (1000 bp) mit denen, die in der Nukleotiddatenbank des US National Center for Biotechnology Information (NCBI)³³ vorhanden sind.
2. Um die Daten der 16S rRNA-Sequenzierung zu bestätigen, führen Sie auch eine automatisierte Ribotypisierung der verdauten chromosomalen DNA durch (externer Dienst, Materialverzeichnis).
3. Für den Fall, dass die Probenidentifizierung nicht nur mit Ribotypisierungsdaten bestimmt werden kann, beauftragen Sie eine MALDI-TOF MS-Analyse zur Fettsäureidentifizierung.
4. Um eine phylogenetische Analyse der identifizierten Gattung durchzuführen, analysieren Sie die 16S rRNA-Sequenz des Isolats mit BLASTn³⁴. Sequenzen mit Identitäten von 99% bis 97% müssen verwendet werden, um eine Ausrichtung mit mehreren Sequenzen mit CLUSTAL Omega³⁵ zu erstellen. Erstellen Sie einen Nachbarverbindungsbaum mit der Standardoption von ClustalW2 (Simple Phylogeny).

4. Anfälligkeit für Schwermetalle und Antibiotika

1. Das Isolat wird aus einem Glycerinbestand geimpft (siehe Schritt 2.5) und in 200 ml LB unter den zuvor ermittelten optimalen pH- und Temperaturbedingungen wachsen lassen.
2. Verdünnen Sie jede Vorkultur bei 0,1 OD_{600 nm} in 5 ml LB-Medium (bei entsprechendem pH-Wert), das steigende Schwermetallkonzentrationen enthält. Die Konzentrationen variieren von 0,01-120 mM für Schwermetalle [As(V), As(III), Cd(II), Co(III), Cr(VI), Cu(II), Hg(II), Ni(II), V(V)] oder 0,5-1 mg/ml für die Antibiotika [Ampicillin, Bacitracin, Chloramphenicol, Ciprofloxacin, Erythromycin, Kanamycin, Streptomycin, Tetracyclin und Vancomycin].
3. Führen Sie Schwermetall- und Antibiotikabehandlungen separat durch. Verwenden Sie ein 50-ml-Polypropylenröhrchen und züchten Sie die Zellen in einem temperaturgesteuerten Orbitalschüttler mit einer Schüttelrate von 180 U / min bei 55 ° C oder 60 ° C für 16 Stunden für jeden Zustand / jede Behandlung.
4. Berechnen Sie die minimale inhibitorische Konzentration (MIC) entweder für Antibiotika oder Schwermetalle, indem Sie die Konzentrationswerte in den Röhrchen identifizieren, in denen kein mikrobielles Wachstum stattfindet, d.h. die Werte bestimmen, die das Zellwachstum nach 16 h vollständig hemmen.
5. Überprüfen Sie, ob die Konzentration für die Zellen hemmend und nicht tödlich ist, indem Sie 200 μL der Kultur, die mit dem Wert gezüchtet wird, der als MIC betrachtet wird, auf LB-Agarplatten (bei entsprechendem pH-Wert und Temperatur) plattieren und das Vorhandensein von Kolonien nach der ON-Inkubation überprüfen.
   HINWEIS: Da die Kultur auf LB-Agarplatte bei 4 °C nur für einige Wochen lebensfähig ist, wurden Glycerinvorräte hergestellt und bei -80 °C gelagert, um die Isolate länger haltbar zu halten. Für die MIC-Bestimmung wurden mindestens drei unabhängige Replikationen unter Verwendung unabhängiger Kulturen durchgeführt. Die Standardabweichung wurde unter dreifachen Experimenten berechnet.

Ergebnisse

Probenahmestelle
Dieses Protokoll veranschaulicht eine Methode zur Isolierung von schwermetallresistenten Bakterien aus einer heißen Quelle. In dieser Studie wurde das Gebiet von Pisciarelli, eine säuresulfidische geothermale Umgebung, als Probenahmestelle verwendet (Abbildung 1). Dieses Ökosystem zeichnet sich durch den Fluss aggressiver schwefelhaltiger Flüssigkeiten aus, die aus vulkanischen Aktivitäten stammen. Es wurde gezeigt, dass die mikrobie...

Diskussion

Heiße Quellen enthalten eine ungenutzte Vielfalt von Mikrobiomen mit ebenso unterschiedlichen Stoffwechselkapazitäten¹². Die Entwicklung von Strategien zur Isolierung von Mikroorganismen, die Schwermetalle effizient in weniger toxische Verbindungen^{umwandeln können 10} stellt weltweit ein Forschungsgebiet von wachsendem Interesse dar. Dieses Papier zielt darauf ab, einen optimierten Ansatz für das Screening und die Isolierung von Mikroben mit der Fähigkeit, toxischen Che...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ampicillin	Sigma Aldrich	A9393
Aura Mini	bio air s.c.r.l.		Biological hood
Bacitracin	Sigma Aldrich	B0125
Cadmium chloride	Sigma Aldrich	202908
Chloramphenicol	Sigma Aldrich	C0378
Ciprofloxacin	Sigma Aldrich	17850
Cobalt chloride	Sigma Aldrich	C8661
Copper chloride	Sigma Aldrich	224332
Erythromycin	Sigma Aldrich	E5389
Exernal Service	DSMZ		Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH
Genomic DNA Purification Kit	Thermo Scientific	#K0721
Kanamycin sulphate	Sigma Aldrich	60615
MaxQTM 4000 Benchtop Orbital Shaker	Thermo Scientific	SHKE4000
Mercury chloride	Sigma Aldrich	215465
NanoDrop 1000 Spectrophotometer	Thermo Scientific
Nickel chloride	Sigma Aldrich	654507
Orion Star A221 Portable pH Meter	Thermo Scientific	STARA2218
Sodium (meta) arsenite	Sigma Aldrich	S7400
Sodium arsenate dibasic heptahydrate	Sigma Aldrich	A6756
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S5886
Streptomycin	Sigma Aldrich	S6501
Tetracycline	Sigma Aldrich	87128
Tryptone BioChemica	Applichem Panreac	A1553
Vancomycin	Sigma Aldrich	PHR1732
Yeast extract for molecular biology	Applichem Panreac	A3732