JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Выделение устойчивых к тяжелым металлам микробов из геотермальных источников является актуальной темой для развития биоремедиации и биосистем мониторинга окружающей среды. Это исследование обеспечивает методологический подход к выделению и идентификации устойчивых к тяжелым металлам бактерий из горячих источников.

Аннотация

Геотермальные источники богаты различными ионами металлов из-за взаимодействия между породой и водой, которое происходит в глубоком водоносном горизонте. Кроме того, из-за сезонных колебаний рН и температуры в этих экстремальных средах периодически наблюдаются колебания в элементном составе, влияющие на экологические микробные сообщества. Экстремофильные микроорганизмы, которые процветают в вулканических тепловых жерлах, разработали механизмы сопротивления для обработки нескольких ионов металлов, присутствующих в окружающей среде, тем самым принимая участие в сложных биогеохимических циклах металлов. Более того, экстремофилы и их продукты нашли широкую точку опоры на рынке, и это особенно верно для их ферментов. В этом контексте их характеристика является функциональной для развития биосистем и биопроцессов для мониторинга окружающей среды и биоремедиации. На сегодняшний день выделение и культивирование в лабораторных условиях экстремофильных микроорганизмов по-прежнему представляют собой узкое место для полного использования их биотехнологического потенциала. В этой работе описывается упрощенный протокол выделения термофильных микроорганизмов из горячих источников, а также их генотипическая и фенотипическая идентификация посредством следующих этапов: 1) отбор проб микроорганизмов с геотермальных участков ("Пишарелли", вулканический район Кампи Флегрей в Неаполе, Италия); 2) выделение микроорганизмов, устойчивых к тяжелым металлам; 3) идентификация микробных изолятов; (4) Фенотипическая характеристика изолятов. Методологии, описанные в настоящей работе, могут в целом применяться также для выделения микроорганизмов из других экстремальных сред.

Введение

Экстремальные среды на нашей планете являются отличными источниками микроорганизмов, способных переносить суровые условия (т.е. температуру, рН, соленость, давление и тяжелые металлы)1,2, это Исландия, Италия, США, Новая Зеландия, Япония, Центральная Африка и Индия, наиболее признанные и изученные вулканические районы 3,4,5,6,7,8,9 . Термофилы эволюционировали в суровых условиях в диапазоне температур от 45 °C до 80 °C 10,11,12. Термофильные микроорганизмы, принадлежащие к архейному или бактериальному царству, являются резервуаром для изучения биоразнообразия, филогенеза и производства эксклюзивных биомолекул для промышленного применения 13,14,15,16. Действительно, в последние десятилетия постоянный промышленный спрос на мировом рынке способствовал использованию экстремофилов и термозимов для их диверсифицированного применения в нескольких биотехнологических областях 17,18,19.

Горячие источники, где организмы живут в консорциумах, являются богатыми источниками биоразнообразия, тем самым представляя собой привлекательную среду обитания для изучения микробной экологии20,21. Кроме того, эти богатые вулканическими металлами районы обычно колонизируются микроорганизмами, которые развили системы толерантности, чтобы выжить и адаптироваться к присутствию тяжелых металлов22,23 и поэтому активно участвуют в их биогеохимических циклах. В настоящее время тяжелые металлы считаются приоритетными загрязнителями для человека и окружающей среды. Устойчивые к тяжелым металлам микроорганизмы способны солюбилизировать и выбрасывать металлы, трансформируя их и реконструируя свои экосистемы24,25. Понимание молекулярных механизмов резистентности к тяжелым металлам является горячей темой для срочной разработки новых зеленых подходов 26,27,28. В этом контексте открытие новых толерантных бактерий представляет собой отправную точку для разработки новых стратегий биоремедиации окружающей среды24,29. В дополнение к усилиям по исследованию гидротермальной среды с помощью микробиологических процедур и расширению знаний о роли гена (генов), лежащего в основе толерантности к тяжелым металлам, микробный скрининг был проведен в районе горячих источников Кампи Флегрей в Италии. Эта богатая тяжелыми металлами среда демонстрирует мощную гидротермальную активность, фумароль и кипящие бассейны, переменные по рН и температуре в зависимости от сезонности, осадков и подземных геологических движений30. В этой перспективе мы описываем простой в применении и эффективный способ выделения бактерий, устойчивых к тяжелым металлам, например, Geobacillus stearothermophilus GF1631 (названный изолятом 1) и Alicyclobacillus mali FL1832 (названный изолятом 2) из района Пишиарелли Кампи Флегрей.

протокол

1. Отбор проб микроорганизмов с геотермальных объектов

  1. Выберите участок для отбора проб, используя в качестве критерия места с желаемой температурой и рН. Измерьте физические параметры с помощью цифрового термопарного зонда, вставив его в выбранные бассейны или грязи.
  2. Соберите 20 г образцов почв (в данном случае из грязи в гидротермальном участке Pisciarelli Solfatara), подбирая их стерилизованной ложкой. Возьмите не менее двух образцов для каждого выбранного участка.
  3. Поместите образцы в 50 мл стерильных полипропиленовых трубок и немедленно закройте.
  4. Измерьте pH и температуру с помощью цифрового термопарного зонда, непосредственно вставив его в место отбора проб. После использования тщательно промойте зонд деионизированной водой.

2. Выделение устойчивых к тяжелым металлам микроорганизмов

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги 2.1-2.7 под стерильным биологическим капотом.

  1. Инокулируют 2 г каждого собранного образца в 50 мл свежеприготовленной среды Лурия-Бертани (LB), в которой рН был скорректирован до 4 или 7 путем добавления HCl или NaOH.
  2. Инкубировать образцы при одинаковой температуре участка отбора проб и при ±5°С (55°С и 60°С для образцов Пишиарелли) в орбитальном шейкере с регулируемой температурой в течение 24 ч со скоростью встряхивания 180 об/мин.
  3. Пластину 200 мкл выращенных образцов на LB агаре (рН 4 или рН 7) инкубируют в статическом состоянии в течение 48 ч при 55 °С или 60 °С.
  4. Изолируйте одиночные колонии и повторите циклы покрытия полос (этапы 2.3 и 2.4) не менее трех раз.
  5. Для приготовления замороженных клеточных запасов при температуре -80 °C выращивают культуры в течение ночи (ON) и добавляют в выращенные клетки 20% глицерина (в конечном объеме 1 мл); используйте смесь ацетона и сухого льда для быстрой заморозки.
  6. Чтобы приготовить инокулят из глицерина, инокулируют 50 мкл в 50 мл LB (pH 4 или pH 6) и инкубируют при 55 °C или 60 °C в орбитальном шейкере при 180 об/мин ON.
  7. Для получения профиля роста разводят прекультуру (полученную со стадии 2.6) до 0,1 OD600 нм в 10 мл LB (рН 4 или рН 6), выращивают клетки при 55°С или 60°С в течение 16 ч в орбитальном шейкере и измеряют ОД600 нм с интервалом 30 мин.
  8. Постройте кривую роста на основе данных, полученных на шаге 2.7, со временем (min) по оси X и OD600 нм по оси Y.
  9. Реализовать ту же кривую роста, описанную на этапах 2,7 и 2,8, но варьируя рН (± 1 единицу) культуральной среды (например, рН 3 и 5 для образцов, выращенных при рН 4), чтобы определить оптимальный рН для лабораторных условий.

3. Идентификация микробных изолятов

  1. Получение геномной ДНК
    1. Инокулируют изолят, полученный из запаса глицерина, в 50 мл среды LB (рН 4 или рН 6) и растут в орбитальном шейкере при 55 °C или 60 °C при 180 об/мин ON.
    2. Собирают культуру ON центрифугированием в течение 10 мин при 5000 х г. Выбросьте супернатант.
    3. Непосредственно перед использованием подготовьте 10 мл буфера лизиса бактерий, состоящего из: 20 мМ Tris-HCl pH 8,0, 2 мМ ЭДТА, 1,2% тритона X-100 и лизоцима (20 мг/мл).
    4. Повторно суспендировать гранулу в 180 мкл буфера лизиса бактерий. Инкубировать в течение 30 мин при 37 °C.
    5. Следуйте рекомендациям, указанным в наборе для очистки геномной ДНК (Таблица материалов) для извлечения геномной ДНК.
    6. Количественная оценка извлеченной геномной ДНК и ее чистоты с помощью измерения UV-Vis. Для чистоты определяют соотношения - OD 260/280 нм и OD 260/230 нм.
    7. Оцените целостность геномной ДНК, загрузив 200 нг каждого образца на 0,8% агарозный гель и сравнив распределение по размерам с высоковажным молекулярным маркером.
    8. Поручение внешней службе подготовки фрагментов рРНК 16S, секвенирования и сравнительного анализа полученной последовательности (1000 bp) с присутствующими в нуклеотидной базе данных Национального центра биотехнологической информации США (NCBI)33.
  2. Для подтверждения данных секвенирования 16S рРНК также выполняют автоматизированное риботипирование на переваренной хромосомной ДНК ( внешний сервис, Таблица материалов).
  3. В случае, когда идентификация вида не может быть определена только с помощью данных риботипирования, закажите анализ MALDI-TOF MS для идентификации жирных кислот.
  4. Чтобы выполнить филогенетический анализ идентифицированного рода, проанализируйте последовательность 16S рРНК изолята с BLASTn34. Последовательности с идентификаторами от 99% до 97% должны использоваться для построения выравнивания нескольких последовательностей с использованием CLUSTAL Omega35. Постройте дерево соединения соседей, используя параметр по умолчанию ClustalW2 (Простая филогения).

4. Восприимчивость к тяжелым металлам и антибиотикам

  1. Инокулируют изолят из глицерина (см. этап 2.5) и выращивают его в 200 мл LB при оптимальных рН и температурных условиях, определенных ранее.
  2. Разбавляют каждую прекультуру при 0,1OD 600 нм в 5 мл LB среды (при соответствующем рН), содержащей повышенные концентрации тяжелых металлов. Концентрации варьируются от 0,01-120 мМ для тяжелых металлов [As(V), As(III), Cd(II), Co(III), Cr(VI), Cu(II), Hg(II), Ni(II), V(V)] или 0,5-1 мг/мл для антибиотиков [Ампициллин, Бацитрацин, Хлорамфеникол, Ципрофлоксацин, Эритромицин, Канамицин, Стрептомицин, Тетрациклин и Ванкомицин].
  3. Выполняйте лечение тяжелыми металлами и антибиотиками отдельно. Используйте полипропиленовую трубку объемом 50 мл и выращивайте ячейки в орбитальном шейкере с контролируемой температурой со скоростью встряхивания 180 об/мин при 55 °C или 60 °C в течение 16 ч для каждого состояния/обработки.
  4. Рассчитать минимальную ингибирующую концентрацию (MIC) либо для антибиотиков, либо для тяжелых металлов, определив значения концентрации в пробирках, где не происходит роста микробов, т.е. определив значения, которые полностью ингибируют рост клеток через 16 ч.
  5. Проверьте, что концентрация является ингибирующей и не смертельной для клеток, покрыв 200 мкл культуры, выращенной при значении, которое считается MIC на пластинах LB-агара (при соответствующем рН и температуре) и проверив наличие колоний после инкубации ON.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку культура на агаровой пластине LB жизнеспособна при 4 °C только в течение нескольких недель, чтобы сохранить изоляты в течение более длительного времени, запасы глицерина были приготовлены и сохранены при -80 °C. Для определения ВПК было проведено не менее трех независимых реплик с использованием независимых культур. Стандартное отклонение было рассчитано среди тройных экспериментов.

Результаты

Место отбора проб
Этот протокол иллюстрирует метод выделения устойчивых к тяжелым металлам бактерий из горячего источника. В этом исследовании в качестве участка отбора проб использовался район Пишиарелли, кислотно-сульфидная геотермальная среда (рисунок 1<...

Обсуждение

Горячие источники содержат неиспользованное разнообразие микробиомов с одинаково разнообразными метаболическими способностями12. Разработка стратегий выделения микроорганизмов, которые могут эффективно превращать тяжелые металлы в менее токсичные соединения

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана ERA-NET Cofund MarTERA: «FLAshMoB: Функциональная амилоидная химера для морского биозондирования», PRIN 2017-PANACEA CUP: E69E19000530001 и GoodbyWaste: GetGOOD products-exploit BY-products-reduce WASTE, MIUR 2017-JTNK78.006, Италия. Мы благодарим д-ра Монику Пиочи и д-ра Анджелу Мормоне (Национальный институт геофизики и вулканологии, Сеционе ди Неаполь Оссерваторио Везувиано, Италия) за идентификацию и характеристику геотермального участка.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
AmpicillinSigma AldrichA9393
Aura Minibio air s.c.r.l.Biological hood
BacitracinSigma AldrichB0125
Cadmium chlorideSigma Aldrich202908
ChloramphenicolSigma AldrichC0378
CiprofloxacinSigma Aldrich17850
Cobalt chlorideSigma AldrichC8661
Copper chlorideSigma Aldrich224332
ErythromycinSigma AldrichE5389
Exernal ServiceDSMZLeibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH
Genomic DNA Purification KitThermo Scientific#K0721
Kanamycin sulphateSigma Aldrich60615
MaxQTM 4000 Benchtop Orbital ShakerThermo ScientificSHKE4000
Mercury chlorideSigma Aldrich215465
NanoDrop 1000 SpectrophotometerThermo Scientific
Nickel chlorideSigma Aldrich654507
Orion Star A221 Portable pH MeterThermo ScientificSTARA2218
Sodium (meta) arseniteSigma AldrichS7400
Sodium arsenate dibasic heptahydrateSigma AldrichA6756
Sodium chlorideSigma AldrichS5886
StreptomycinSigma AldrichS6501
TetracyclineSigma Aldrich87128
Tryptone BioChemicaApplichem PanreacA1553
VancomycinSigma AldrichPHR1732
Yeast extract for molecular biologyApplichem Panreac A3732

Ссылки

  1. Arora, N. K., Panosyan, H. Extremophiles: applications and roles in environmental sustainability. Environmental Sustainability. 2, 217-218 (2019).
  2. Gallo, G., Puopolo, R., Carbonaro, M., Maresca, E., Fiorentino, G. Extremophiles, a nifty tool to face environmental pollution: From exploitation of metabolism to genome engineering. International Journal of Environmental Research and Public Health. 18 (10), 5228 (2021).
  3. Saxena, R., et al. Metagenomic analysis of hot springs in Central India reveals hydrocarbon degrading thermophiles and pathways essential for survival in extreme environments. Frontiers in Microbiology. 7, 2123 (2017).
  4. Papke, R. T., Ramsing, N. B., Bateson, M. M., Ward, D. M. Geographical isolation in hot spring cyanobacteria. Environmental Microbiology. 5 (8), 650-659 (2003).
  5. Zitelle, L., Lan Pe, N. I. al The role of photosynthesis and CO2 evasion in travertine formation: a quantitative investigation at an important travertine-depositing hot spring. Journal of the Geological Society. 164, 843-853 (2007).
  6. Kubo, K., Knittel, K., Amann, R., Fukui, M., Matsuura, K. Sulfur-metabolizing bacterial populations in microbial mats of the Nakabusa hot spring. Japan. Systematic and Applied Microbiology. 34 (4), 293-302 (2011).
  7. Siljeström, S., Li, X., Brinckerhoff, W., van Amerom, F., Cady, S. L. ExoMars mars organic molecule analyzer (MOMA) laser desorption/ionization mass spectrometry (LDI-MS) analysis of phototrophic communities from a silica-depositing hot spring in Yellowstone national park, USA. Astrobiology. , (2021).
  8. Aulitto, M., Tom, L. M., Ceja-Navarro, J. A., Simmons, B. A., Singer, S. W. Whole-genome sequence of Brevibacillus borstelensis SDM, isolated from a sorghum-adapted microbial community. Microbiology Resource Announcements. 9 (48), 8-9 (2020).
  9. Antranikian, G., et al. Diversity of bacteria and archaea from two shallow marine hydrothermal vents from Vulcano Island. Extremophiles. 21 (4), 733-742 (2017).
  10. Gallo, G., Puopolo, R., Limauro, D., Bartolucci, S., Fiorentino, G. Metal-tolerant thermophiles: from the analysis of resistance mechanisms to their biotechnological exploitation. The Open Biochemistry Journal. 12 (1), 149-160 (2018).
  11. Aulitto, M., et al. Draft genome sequence of Bacillus coagulans MA-13, a thermophilic lactic acid producer from lignocellulose. Microbiology Resource Announcements. 8 (23), 341-360 (2019).
  12. Mehta, D., Satyanarayana, T. Diversity of hot environments and thermophilic microbes. Thermophilic Microbes in Environmental and Industrial Biotechnology: Biotechnology of Thermophiles. , (2013).
  13. Fusco, S., et al. The interaction between the F55 virus-encoded transcription regulator and the RadA host recombinase reveals a common strategy in Archaea and Bacteria to sense the UV-induced damage to the host DNA. Biochimica et Biophysica Acta - Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), (2020).
  14. Puopolo, R., et al. Self-assembling thermostable chimeras as new platform for arsenic biosensing. Scientific Reports. 11 (1), (2021).
  15. Fiorentino, G., Contursi, P., Gallo, G., Bartolucci, S., Limauro, D. A peroxiredoxin of Thermus thermophilus HB27: Biochemical characterization of a new player in the antioxidant defence. International Journal of Biological Macromolecules. 153, 608-615 (2020).
  16. Fiorentino, G., Del Giudice, I., Bartolucci, S., Durante, L., Martino, L., Del Vecchio, P. Identification and physicochemical characterization of BldR2 from Sulfolobus solfataricus, a novel archaeal member of the MarR transcription factor family. Biochemistry. 50 (31), 6607-6621 (2011).
  17. Bhattacharya, A., Gupta, A. G. . Microbial Extremozymes. Current trends in applicability of thermophiles and thermozymes in bioremediation of environmental pollutants. , 161-176 (2022).
  18. Aulitto, M., et al. Prebiotic properties of Bacillus coagulans MA-13: Production of galactoside hydrolyzing enzymes and characterization of the transglycosylation properties of a GH42 β-galactosidase. Microbial Cell Factories. 20 (1), 1-18 (2021).
  19. Ing, N., et al. A multiplexed nanostructure-initiator mass spectrometry (NIMS) assay for simultaneously detecting glycosyl hydrolase and lignin modifying enzyme activities. Scientific Reports. 11 (1), 11803 (2021).
  20. Saw, J. H. W. Characterizing the uncultivated microbial minority: towards understanding the roles of the rare biosphere in microbial communities. mSystems. 6 (4), 0077321 (2021).
  21. He, Q., et al. Temperature and microbial interactions drive the deterministic assembly processes in sediments of hot springs. Science of the Total Environment. 772, 145465 (2021).
  22. Shakhatreh, M. A. K., et al. Microbiological analysis, antimicrobial activity, and heavy-metals content of Jordanian Ma'in hot-springs water. Journal of Infection and Public Health. 10 (6), 789-793 (2017).
  23. Antonucci, I., et al. An ArsR/SmtB family member regulates arsenic resistance genes unusually arranged in Thermus thermophilus HB27. Microbial Biotechnology. 10 (6), 1690-1701 (2017).
  24. Ozdemir, S., Kılınç, E., Poli, A., Nicolaus, B. Biosorption of Heavy Metals (Cd 2+, Cu 2+ , Co 2+ , and Mn 2+ ) by Thermophilic Bacteria, Geobacillus thermantarcticus and Anoxybacillus amylolyticus Equilibrium and Kinetic Studies. Bioremediation Journal. 17 (2), 86-96 (2013).
  25. Hlihor, R. -. M., Apostol, L. -. C., Gavrilescu, M. Environmental bioremediation by biosorption and bioaccumulation: Principles and applications. Enhancing Cleanup of Environmental Pollutants: Volume 1: Biological Approaches. , 289-315 (2017).
  26. Del Giudice, I., Limauro, D., Pedone, E., Bartolucci, S., Fiorentino, G. A novel arsenate reductase from the bacterium Thermus thermophilus HB27: its role in arsenic detoxification. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics. 1834 (10), 2071-2079 (2013).
  27. Politi, J., Spadavecchia, J., Fiorentino, G., Antonucci, I., Casale, S., De Stefano, L. Interaction of Thermus thermophilus ArsC enzyme and gold nanoparticles naked-eye assays speciation between As(III) and As(V). Nanotechnology. 26 (43), 435703 (2015).
  28. Antonucci, I., et al. Characterization of a promiscuous cadmium and arsenic resistance mechanism in Thermus thermophilus HB27 and potential application of a novel bioreporter system. Microbial Cell Factories. 17 (1), (2018).
  29. Ilyas, S., Lee, J. C., Kim, B. S. Bioremoval of heavy metals from recycling industry electronic waste by a consortium of moderate thermophiles: Process development and optimization. Journal of Cleaner Production. 70, 194-202 (2014).
  30. Piochi, M., Mormone, A., Strauss, H., Balassone, G. The acid-sulfate zone and the mineral alteration styles of the Roman Puteolis (Neapolitan area, Italy): clues on fluid fracturing progression at the Campi Flegrei volcano. Solid Earth. 10 (6), 1809-1831 (2019).
  31. Puopolo, R., et al. Identification of a new heavy-metal-resistant strain of Geobacillus stearothermophilus isolated from a hydrothermally active volcanic area in southern Italy. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (8), 2678 (2020).
  32. Aulitto, M., et al. Genomic insight of Alicyclobacillus mali FL18 isolated from an Arsenic-rich hot spring. Frontiers in Microbiology. 12, 639697 (2021).
  33. Agarwala, R., et al. Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Research. 46, 8-13 (2018).
  34. Altschul, S. F., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).
  35. Sievers, F., Higgins, D. G. Clustal Omega. Current Protocols in Bioinformatics. 2014, 1-16 (2014).
  36. Kliem, M., Sauer, S. The essence on mass spectrometry based microbial diagnostics. Current Opinion in Microbiology. 15 (3), 397-402 (2012).
  37. Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).
  38. Piochi, M., Mormone, A., Balassone, G., Strauss, H., Troise, C., De Natale, G. Native sulfur, sulfates and sulfides from the active Campi Flegrei volcano (southern Italy): Genetic environments and degassing dynamics revealed by. Journal of Volcanology and Geothermal Research. 301, 180-193 (2015).
  39. Hsu, H. -. C., et al. Assessment of temporal effects of a mud volcanic eruption on the bacterial community and their predicted metabolic functions in the mud volcanic sites of Niaosong, Southern Taiwan. Nicroorganisms. 9 (11), 2315 (2021).
  40. Ye, J., Rensing, C., Su, J., Zhu, Y. G. From chemical mixtures to antibiotic resistance. Journal of Environmental Sciences (China). 62, 138-144 (2017).
  41. Farias, P., et al. Natural hot spots for gain of multiple resistances: arsenic and antibiotic resistances in heterotrophic, aerobic bacteria from marine hydrothermal vent fields. Applied and Environmental Microbiology. 81 (7), 2534-2543 (2015).
  42. Aulitto, M., Fusco, S., Nickel, D. B., Bartolucci, S., Contursi, P., Franzén, C. J. Seed culture pre-adaptation of Bacillus coagulans MA-13 improves lactic acid production in simultaneous saccharification and fermentation. Biotechnology for Biofuels. 12 (1), 45 (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

178

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены