大鼠主动脉切除术治疗左心病肺动脉高压反向血管重塑模型

摘要

本方案描述了一种外科手术，用于去除左心病引起的肺动脉高压大鼠模型中的升主动脉束带。该技术研究肺循环和右心中反向重塑的内源性机制，从而为逆转肺动脉高压和/或右心室功能不全的策略提供信息。

摘要

左心病引起的肺动脉高压 （PH-LHD） 是最常见的 PH 形式，但其病理生理学特征不如肺动脉高压 （PAH）。因此，用于治疗或预防PH-LHD的批准治疗干预措施缺失。不推荐用于治疗 PAH 患者 PH 的药物治疗 PH-LHD，因为在左侧充盈压升高的情况下，肺血管阻力 （PVR） 降低和肺血流量增加可能导致左心失代偿和肺水肿。需要制定新的策略来逆转LHD患者的PH值。与PAH相反，PH-LHD是由于左心衰竭期间血液充血进入肺循环引起的机械负荷增加而发生的。临床上，主动脉瓣置换术对左心室 （LV） 进行机械卸载，或在终末期心力衰竭患者中植入左心室辅助装置，不仅使肺动脉和右心室 （RV） 压力正常化，也使 PVR 正常化，从而为肺血管系统反向重塑提供间接证据。利用已建立的PH-LHD大鼠模型，该模型由压力过载引发的左心衰竭引发，随后发展为PH，开发了一种模型来研究这种生理逆向重塑过程的分子和细胞机制。具体而言，进行了主动脉切除手术，导致左心室心肌的反向重塑及其卸载。同时，可检测到右心室收缩压完全正常化和右心室肥大的显著但不完全逆转。该模型可能是研究肺循环和RV中生理反向重塑机制的宝贵工具，旨在开发治疗PH-LHD和其他形式的PH的治疗策略。

引言

心力衰竭是发达国家的主要死因，预计未来十年将增加25%。肺动脉高压（PH） - 肺循环中血压的病理性升高 - 影响约70%的终末期心力衰竭患者;世界卫生组织将PH归类为左心病引起的肺动脉高压（PH-LHD）¹。PH-LHD 是由收缩压和/或舒张性左心室 （LV） 功能受损引起的，该功能导致充盈压升高和血液被动充血进入肺循环²。尽管最初是可逆的，但由于肺循环所有区室（即动脉、毛细血管和静脉）的肺血管重塑，PH-LHD 逐渐变得固定^3，4。可逆和固定 PH 均增加心房室后负荷，最初导致适应性心肌肥大，但最终导致心房扩张、运动功能减退、纤维化和失代偿，从而逐渐导致心房室衰竭^{1，2，5，6}。因此，PH加速心力衰竭患者的疾病进展并增加死亡率，特别是在通过植入左心室辅助装置（LVAD）和/或心脏移植进行手术治疗的患者中^7，8，9。目前，没有治愈性疗法可以逆转肺血管重塑的过程，因此需要在适当的模型系统中进行基本的机制研究。

重要的是，临床研究表明，PH-LHD作为主动脉瓣狭窄患者的常见并发症，在主动脉瓣置换术后的早期可以迅速改善¹⁰。类似地，在一项为期 5 年的随访研究中，高（>3 Wood 单位）的术前肺血管阻力 （PVR） 在硝普钠上是可逆的，但在心脏移植后可持续地正常化¹¹。同样，通过使用植入式脉动和非脉动性心室辅助装置^12，13，14，可以在几个月内完成LHD患者可逆和固定PVR的充分降低以及RV功能的改善。目前，驱动肺循环和RV心肌逆转重塑的细胞和分子机制尚不清楚。然而，他们的理解可能为生理途径提供重要的见解，这些途径可能在治疗上被利用来逆转PH-LHD和其他形式的PH中的肺血管和RV重塑。

充分复制PH-LHD病理生理学和分子特征的合适临床前模型可用于大鼠手术主动脉束带（AoB）引起的压力超负荷诱导的充血性心力衰竭的转化研究^4，15，16。与横主动脉收缩（TAC）¹⁷小鼠模型中由于压力超负荷引起的类似心力衰竭相比，AoB大鼠升主动脉高于主动脉根部的束带不会在左颈动脉中产生高血压，因为束带部位是左颈动脉从主动脉流出的近端。因此，AoB不会像TAC¹⁸的特征那样在皮层中引起左侧神经元损伤，并且可能会影响研究结果。与其他手术诱导的PH-LHD的啮齿动物模型相比，一般的大鼠模型，特别是AoB，被证明更健壮，可重复，并复制PH-LHD患者肺循环特征的重塑。同时，围手术期致死率低¹⁹。AoB大鼠左心室压力升高和左心室功能障碍诱导PH-LHD发展，导致RV压力升高和RV重塑。因此，AoB大鼠模型在包括我们自己在内的独立小组之前的一系列研究中被证明是非常有用的，以确定肺血管重塑的病理机制并测试PH-LHD^4，15，^{20，21，22，23，24，25}的潜在治疗策略。

本研究利用AoB大鼠模型建立了主动脉拆解外科手术，研究了肺血管系统和RV中反向重塑的机制。此前，已经开发了小鼠²⁶ 和大鼠²⁷ 的主动脉剥离等心肌反向重塑模型，以研究调节左心室肥厚消退的细胞和分子机制，并测试潜在的治疗方案以促进心肌 恢复。此外，数量有限的早期研究探索了主动脉拆带对大鼠PH-LHD的影响，并表明主动脉解除可以逆转肺小动脉内侧肥大，使前内皮素1的表达正常化并改善肺血流动力学^27，28，为心力衰竭大鼠PH的可逆性提供了证据。在这里，拆带手术的技术程序得到优化和标准化，例如，通过应用气管切开术代替气管插管，或者通过使用定义内径的钛夹进行主动脉束带而不是用钝针^26，27的聚丙烯缝合线，从而提供更好的手术程序控制，增加模型的可重复性和提高存活率。

从科学的角度来看，PH-LHD解除结合模型的意义不仅在于证明心力衰竭中心血管和肺部表型的可逆性，更重要的是，在识别触发和/或维持肺动脉反向重塑的分子驱动因素，作为未来治疗靶向的有希望的候选者。

研究方案

所有程序均按照"实验动物护理和使用指南"（实验动物资源研究所，2011年第8版）进行，并得到德国国家卫生和社会事务办公室（Landesamt für Gesundheit und Soziales，柏林）地方政府动物护理和使用委员会的批准;议定书编号为。G0030/18）。首先，通过在上主动脉（主动脉条带，AoB）上放置内径为0.8mm的钛夹（主动脉条带，AoB）来手术诱导充血性心力衰竭〜100g体重（bw）（见 材料表）。如前所述^29，30。在AoB（图1）后的第3周，进行去绑（Deb）手术以从主动脉中取出夹子。在AoB大鼠中进行的外科手术和PH逆转的验证在 图1中示意性地描述。

1. 手术准备

1. 通过高压灭菌对所需的手术器械进行灭菌（图2）。
2. 手术前30分钟腹膜内注射卡洛芬（5mg / kg体重）（见 材料表）镇痛。
3. 通过静脉注射氯胺酮（87毫克/千克体重）和甲苯噻嗪（13毫克/千克体重）麻醉大鼠。
4. 使用电动剃须刀去除动物领口和胸部的毛发。
5. 在手术过程中涂抹一滴眼药膏以保护眼睛。
6. 将大鼠置于无菌手术台上的仰卧位。用胶带小心地固定动物的腹部和四肢。
   注意:为了保持体温，在手术台下放置37°C的加热垫。避免加热头部区域，以防止眼睛干燥。
7. 用聚维酮碘/碘伏溶液消毒动物皮肤。注意原发性AoB手术的疤痕和缝合线，并覆盖手术区域。
8. 通过捏脚趾确保足够的麻醉深度。
   注意:手术期间需要定期控制麻醉深度。

2. 气管切开术和机械通气

注意:在整个手术过程中，在处理非无菌设备后更换手套。

1. 用细剪刀（图2A），做一个7-10毫米长的宫颈中线切口（图3A）。
2. 在一对钝镊子的帮助下（图2B'），解剖颈部软组织以暴露舌骨肌。在中线分割肌肉以可视化气管。从原发 AoB 手术中切下缝线并取下缝线。
3. 使用倾斜的Noyes弹簧剪刀在两个软骨环之间做约2毫米的气管切口（图2C，3B）。将外径为2mm的气管插管（图2D）插入气管中，并用4-0丝缝线固定（图2E，3C）。
4. 将气管插管连接到机械呼吸机（参见材料表），同时将死区保持在最小水平（图3D-E）。在潮气量 （Vt） 为 8.5 mL/kg bw 的情况下，保持围手术期肺通气，呼吸频率为 90 次/分钟。

3. 主动脉切除术

1. 使用细剪刀在第二和第三肋骨之间做一个约20毫米长的皮肤切口（图3F）。
2. 在较小的手术剪刀的帮助下（图2F），小心地扩散肌肉并逐层切割（图3G）。沿第二肋和第三肋骨之间的肋间间隙切开10毫米的侧切口。
   注意:胸骨中线需要小心接近以避免出血。
3. 使用肋骨扩张器（图2G）扩展第二和第三根肋骨之间的肋间空间以创建手术窗口（图3H）。
4. 在钝镊子的帮助下（图2B，B'），小心地将胸腺与心脏和导管动脉分开，以用夹子可视化主动脉（图4A）。
5. 在镊子的帮助下握住夹子，并小心地取下夹子周围的结缔组织以将其暴露。
   注意:避免用镊子握住或抬起主动脉，因为它可能会伤害主动脉，导致出血和致命的结果。
6. 在针架（图2H）的帮助下，打开夹子（图4B）并将其从胸腔中取出。
7. 在关闭胸部之前，打开肺肺不张，确保充分的肺活量而不会过度扩张，继续机械通气，Vt为9.5 mL/kg bw，再持续10分钟，然后恢复到8.5 mL/kg bw的Vt以招募肺部并解决可能的气胸。
8. 使用4-0丝通过简单的中断缝合线关闭深层肌肉。然后用简单的连续缝合线连接上部肌肉和皮肤（图5A，B）。

4. 气管拔管

1. 断开气管套管与通气机的连接。专心观察大鼠，直到重新建立自主呼吸。如果动物在断开连接时无法自主呼吸，请重新连接呼吸机并继续通气5分钟。然后重复该过程。
2. 重新建立自主呼吸后，从气管中取出套管，并用海绵点清洁气管周围的液体（图2I）（见 材料表）。
3. 使用6-0 prolene用简单的缝合线关闭气管（图2E'和 图5C）。然后使用4-0丝在简单的中断缝合线中关闭舌骨肌（图5D），并通过简单的连续缝合线连接皮肤（图5E）。在此过程中用聚维酮碘/碘伏溶液清洁和消毒肌肉和皮肤。

5. 术后护理

1. 完成外科手术后，小心地将动物移动到带有补充氧气和红外灯的恢复笼中，以使动物在恢复阶段保持温暖和足够的氧气。将氧气面罩靠近老鼠的鼻子。任何时候每个回收笼子只养一只动物。
2. 动物醒来后，小心地将其移动到有水和食物的普通笼子里。在接下来的12小时内，以2小时为间隔控制操作动物的健康状况。
3. 完成外科手术后，每天通过静脉注射卡洛芬（5毫克/千克体重）进行镇痛，持续一周。
4. 为避免细菌感染，术后在饮用水中施用阿莫西林（500mg / L）一周。

结果

首先，在AoB动物的拆解手术之前和之后，通过经胸超声心动图确认主动脉切除术的成功（图6）。为此，在胸骨旁长轴（PLAX）B模式视图中评估主动脉弓。可视化AoB动物中升主动脉上夹子的位置及其在Deb手术后不存在的位置（图6A，B）。接下来，通过脉冲波多普勒成像评估主动脉血流（图6C-F）。在剪辑之?...

讨论

在这里，报道了在大鼠AoB模型中用于主动脉切除的详细手术技术，该技术可用于研究PH-LHD的可逆性以及驱动肺血管系统和RV反向重塑的细胞和分子机制。幼年大鼠主动脉收缩三周导致PH-LHD明显表现为左心室压力增加，左心室肥大，伴随RV压力增加和RV肥大。AoB后第3周的主动脉瓣解除能够在Deb后两周内卸载左心室并完全逆转左心室肥大。同时，主动脉拆解也导致右心室压力完全正常化和右心室肥大部...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amoxicillin	Ratiopharm	PC: 04150075615985	Antibiotic
Anti-BNP antibody	Abcam	ab239510	Western Blotting
Aquasonic 100 Ultrasound gel	Parker Laboratories	BT-025-0037L	Echocardiography consumables
Bepanthen	Bayer	6029009.00.00	Eye ointment eye ointment
Carprosol (Carprofen)	CP-Pharma	401808.00.00	Analgesic
Clip holder	Weck stainless USA	523140S	Surgical instruments
Fine scissors Tungsten carbide	Fine Science Tools	14568-12	Surgical scissors
Fine scissors Tungsten carbide	Fine Science Tools	14568-09	Surgical scissors
High-resolution imaging system	FUJIFILM VisualSonics, Amsterdam, Netherlands	VeVo 3100	Echocardiography machine. Images were acquired with pulse-wave Doppler mode, M-mode and B-mode
Isoflurane	CP-Pharma	400806.00.00	Anesthetic
Ketamine	CP-Pharma	401650.00.00	Anesthetic
Mathieu needle holder	Fine Science Tools	12010-14	Surgical instruments
Mechanical ventilator (Rodent ventilator)	UGO Basile S.R.L.	7025	Volume controlled respirator
Metal clip	Hemoclip	523735	Surgical consumables
Microscope	Leica	M651	Manual surgical microscope for microsurgical procedures
Millar Mikro-Tip pressure catheters	ADInstruments	SPR-671	Hemodynamics assessment
Moria Iris forceps	Fine Science Tools	11373-12	Surgical forceps
Noyes spring scissors	Fine Science Tools	15013-12	Surgical scissors
Povidone iodine/iodophor solution	B/Braun	16332M01	Disinfection
PowerLab	ADInstruments	4_35	Hemodynamics assessment
Prolene Suture, 4-0	Ethicon	EH7830	Surgical consumables
Rib spreader (Alm selfretaining retractor blunt, 70 mm, 2 3/4″)	Austos	AE-BV010R	Surgical instruments
Serrated Graefe forceps	Fine Science Tools	11052-10	Surgical forceps
Silk Suture, 4-0	Ethicon	K871	Surgical consumables
Skin disinfiction solution (colored)	B/Braun	19412M07	Disinfection
Spectra 360 Elektrode gel	Parker Laboratories	TB-250-0241H	Echocardiography consumables
Sponge points tissue	Sugi	REF 30601	Surgical consumables
Sprague-Dawley rat	Janvier Labs, Le Genest-Saint-Isle, France		Study animals
Tracheal cannula			Outer diameter 2 mm
Xylazin	CP-Pharma	401510.00.00	Anesthetic