쥐의 대동맥 해산에 의한 좌심 질환으로 인한 폐고혈압의 역혈관 리모델링 모델

요약

본 프로토콜은 왼쪽 심장 질환으로 인한 폐 고혈압의 래트 모델에서 오름차순 대동맥 밴딩을 제거하기 위한 외과적 절차를 기술한다. 이 기술은 폐 순환과 오른쪽 심장에서 역리모델링의 내인성 메커니즘을 연구하여 폐 고혈압 및 / 또는 우심실 기능 장애를 역전시키는 전략을 알려줍니다.

초록

왼쪽 심장 질환 (PH-LHD)으로 인한 폐 고혈압은 PH의 가장 일반적인 형태이지만 병리 생리학은 폐 동맥 고혈압 (PAH)보다 잘 특성화되지 않습니다. 결과적으로, PH-LHD의 치료 또는 예방을 위해 승인 된 치료 중재가 누락되었습니다. PAH 환자의 PH를 치료하는 데 사용되는 약물은 왼쪽 심장 보상 상실 및 폐 부종을 유발할 수 있으므로 폐 혈관 저항 (PVR)이 감소하고 폐 혈류가 증가하므로 PH-LHD 치료에 권장되지 않습니다. LHD 환자의 PH를 역전시키기 위한 새로운 전략을 개발해야 합니다. PAH와는 달리, PH-LDD는 왼쪽 심부전 동안 폐 순환으로 혈액이 혼잡하여 발생하는 기계적 부하 증가로 인해 발생합니다. 임상적으로, 대동맥 협착증 환자에서 대동맥 판막 치환 또는 말기 심부전 환자에 LV 보조 장치의 이식에 의한 좌심실 (LV)의 기계적 하역은 폐 동맥 및 우심실 (RV) 압력뿐만 아니라 PVR을 정상화시켜 폐 혈관 구조에서 역 리모델링에 대한 간접적 인 증거를 제공합니다. PH의 후속 개발과 함께 압력 과부하에 의해 촉발된 좌측 심부전으로 인한 PH-LHD의 확립된 래트 모델을 사용하여, 이러한 생리학적 역리모델링 과정의 분자 및 세포 메카니즘을 연구하기 위한 모델이 개발된다. 특히, 대동맥 해체 수술이 수행되어 LV 심근의 역 리모델링과 하역이 이루어졌습니다. 병행하여, RV 수축기 압력의 완전한 정상화 및 RV 비대의 유의하지만 불완전한 반전이 검출가능하였다. 이 모델은 PH-LHD 및 다른 형태의 PH를 치료하기위한 치료 전략 개발을 목표로하는 폐 순환 및 RV에서의 생리적 역 리모델링 메커니즘을 연구하는 데 유용한 도구를 제공 할 수 있습니다.

서문

심부전은 선진국에서 사망의 주요 원인이며 향후 10 년 동안 25 % 증가 할 것으로 예상됩니다. 폐 고혈압 (PH) - 폐 순환에서 혈압의 병리학 적 증가 - 말기 심부전 환자의 약 70 %에 영향을 미칩니다. 세계 보건기구 (WHO)는 왼쪽 심장 질환 (PH-LHD)¹로 인한 PH를 폐 고혈압으로 분류합니다. PH-LHD는 수축기 및/또는 이완기 좌심실(LV) 기능 장애에 의해 개시되어 충전 압력이 상승하고 폐순환 내로의 혈액의 수동적 혼잡을 초래한다². 초기에 가역적이긴 하지만, PH-LHD는 폐 순환의 모든 구획, 즉 동맥, 모세혈관 및 정맥^(3,4)에서 활성 폐혈관 리모델링으로 인해 점차 고정된다. 가역적 및 고정 PH 모두 RV 애프터 로드를 증가시켜 처음에는 적응성 심근 비대를 유발하지만 궁극적으로 RV 팽창, 저동증, 섬유증 및 보상 상실을 유발하여 점진적으로 RV 실패 1,2,5,6을 초래합니다. 이와 같이, PH는 심부전 환자의 질병 진행을 가속화하고, 특히 좌심실 보조 장치(LVAD) 및/또는 심장 이식 7,8,9의 이식에 의한 외과적 치료를 받는 환자에서 사망률을 증가시킨다. 현재 폐혈관 리모델링 과정을 역전시킬 수 있는 치료법은 존재하지 않기 때문에 적절한 모델 시스템에 대한 근본적인 기계론적 연구가 필요하다.

중요하게도, 임상 연구에 따르면 대동맥 협착증 환자에서 빈번한 합병증인 PH-LHD는 대동맥 판막 치환¹⁰ 후 수술 후 초기 기간에 빠르게 개선될 수 있음을 보여줍니다. 유사하게, 니트로프러스사이드에서 가역적이었던 높은 (>3 우드 유닛) 수술 전 폐 혈관 저항성 (PVR)은 5 년간의 후속 연구¹¹에서 심장 이식 후 지속 가능하게 정상화되었다. 유사하게, LHD 환자에서 가역적 및 고정 PVR 둘 다의 적절한 감소 및 RV 기능의 개선은 이식가능한 박동성 및 비박동성 심실 보조 장치^(12,13,14)를 사용하여 좌심실을 하역함으로써 수개월 내에 실현될 수 있었다. 현재, 폐 순환 및 RV 심근에서 역리모델링을 유도하는 세포 및 분자 메커니즘은 불분명하다. 그러나, 이들의 이해는 PH-LHD 및 PH의 다른 형태에서 폐 혈관 및 RV 리모델링을 역전시키기 위해 치료적으로 이용될 수 있는 생리학적 경로에 대한 중요한 통찰력을 제공할 수 있다.

PH-LHD의 병리생리학적 및 분자적 특징을 적절히 복제하는 적합한 전임상 모델은 래트 ^4,15,16에서 외과적 대동맥 밴딩(AoB)으로 인한 압력 과부하 유발 울혈성 심부전에서의 번역 연구에 사용될 수 있다. 횡단 대동맥 수축 (TAC)¹⁷의 뮤린 모델에서 압력 과부하로 인한 유사한 심부전과 비교하여, AoB 래트에서 대동맥 뿌리 위의 오름차순 대동맥의 밴딩은 밴딩 부위가 대동맥으로부터 좌측 경동맥의 유출의 근위이기 때문에 왼쪽 경동맥에서 고혈압을 일으키지 않는다. 그 결과, AoB는 TAC¹⁸에 대한 특징인 바와 같이 피질에서 좌측 뉴런 손상을 일으키지 않으며, 이는 연구 결과에 영향을 미칠 수 있다. 외과적으로 유도된 PH-LHD의 다른 설치류 모델과 비교하여, 일반적으로 래트 모델, 및 특히 AoB는 PH-LHD 환자에 대한 폐 순환 특성의 리모델링을 보다 견고하고, 재현 가능하고, 복제하는 것으로 입증되었다. 동시에, 수술 전 치사율은 낮은¹⁹입니다. AoB 래트에서 증가된 LV 압력 및 LV 기능장애는 PH-LHD 발달을 유도하여, 상승된 RV 압력 및 RV 리모델링을 초래한다. 이와 같이, AoB 래트 모델은 폐혈관 리모델링의 병리메커니즘을 확인하고 PH-LHD 4,15,20,21,22,23,24,25에 대한 잠재적 치료 전략을 시험하기 위해 우리 자신을 포함한 독립적인 그룹에 의한 일련의 이전 연구에서 매우 유용하다는 것이 입증^되었다.

본 연구에서, AoB 래트 모델은 폐 혈관구조와 RV에서 역리모델링의 기작을 연구하기 위해 대동맥 해체의 외과적 절차를 확립하는데 활용되었다. 이전에는 마우스²⁶ 및 래트²⁷에서 대동맥 해체와 같은 심근 역리모델링 모델이 개발되어 좌심실 비대증의 퇴행을 조절하는 세포 및 분자 메커니즘을 조사하고 심근을 촉진하기 위한 잠재적인 치료 옵션을 시험하였다. 복구. 또한, 제한된 수의 초기 연구에서 대동맥 해산이 쥐의 PH-LHD에 미치는 영향을 탐구하고 대동맥 해체가 폐 동맥의 내측 비대를 역전시키고 사전 프로 엔도텔린 1의 발현을 정상화하며 폐 혈역학^27,28을 개선하여 심부전 쥐에서 PH의 가역성에 대한 증거를 제공한다는 것을 보여주었습니다. 여기서, 해산 수술의 기술적 절차는 예를 들어, 기관내 삽관 대신 기관 절제술을 적용하거나 둔한 바늘^26,27을 갖는 폴리프로필렌 봉합사 대신에 대동맥 밴딩을 위해 정의된 내경의 티타늄 클립을 사용함으로써^, 수술 절차의 더 나은 제어, 모델의 재현성 증가 및 향상된 생존율을 제공함으로써 최적화되고 표준화된다.

과학적 관점에서 볼 때, PH-LHD 해체 모델의 중요성은 심부전에서 심혈관 및 폐 표현형의 가역성을 입증하는 데에만 있는 것이 아니라, 더 중요한 것은 폐동맥에서 역리모델링을 유발 및/또는 유지하는 분자 동인의 확인에 있어 미래의 치료 표적화를 위한 유망한 후보로 자리매김하는 것이다.

프로토콜

모든 절차는 "실험실 동물의 관리 및 사용을위한 가이드"(실험실 동물 자원 연구소, 8th edition 2011)에 따라 수행되었으며 독일 보건 사회 사무국 (Landesamt für Gesundheit und Soziales (LaGeSO), Berlin)의 지방 정부 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. G0030/18). 먼저, 울혈성 심부전^{은 앞서 설명한} 바와 같이 오름차순 대동맥 (대동맥 밴딩, AoB) 상에 0.8 mm 내경을 갖는 티타늄 클립을 배치하여 소아 Sprague-Dawley 래트에서 ∼¹⁰⁰ g 체중(bw)(재료 표 참조)에서 외과적으로 유도하였다(대동맥 밴딩, AoB). AoB 후 3주째에(도 1), 대동맥으로부터 클립을 제거하기 위해 디브레이빙(Deb) 수술을 수행하였다. 수행된 AoB 래트에서 PH 역전의 수술 절차 및 검증은 도 1에 개략적으로 묘사되어 있다.

1. 외과 적 준비

1. 오토클레이빙을 통해 필요한 수술기구(그림 2)를 멸균합니다.
2. 쥐에게 카프로펜 (5 mg / kg bw) ( 재료 표 참조)을 복강 내 (i.p.) 주사하여 수술 30 분 전에 진통제를 위해 주사하십시오.
3. 케타민 (87 mg / kg bw)과 자일라진 (13 mg / kg bw)의 i.p. 주사로 쥐를 마취하십시오.
4. 전기 면도기를 사용하여 동물의 목선과 가슴에서 머리카락을 제거하십시오.
5. 수술 중 눈을 보호하기 위해 눈 연고 한 방울을 바르십시오.
6. 쥐를 멸균 된 수술 테이블의 수핀 위치에 놓습니다. 조심스럽게 접착 테이프로 동물의 복부와 팔다리를 고정하십시오.
   주: 체온을 유지하려면 수술대 아래에 37°C 가열 매트를 놓으십시오. 눈의 건조를 방지하기 위해 머리 부위의 가열을 피하십시오.
7. 포비돈-요오드/요오도포어 용액으로 동물 피부를 소독하십시오. 일차 AoB 수술에서 흉터와 봉합사를 기록하고 수술 현장을 드레이프하십시오.
8. 발가락을 꼬집음으로써 마취의 적절한 깊이를 보장하십시오.
   참고 : 마취의 깊이는 수술 중에 정기적으로 조절해야합니다.

2. 기관지 절제술 및 기계 환기

참고 : 수술 기간 동안 멸균되지 않은 장비를 취급 한 후 장갑을 교체하십시오.

1. 미세한 가위(그림 2A)로 7-10mm 길이의 자궁경부 중간선 절개를 만듭니다(그림 3A).
2. 한 쌍의 둔한 포셉 (그림 2B')의 도움으로 자궁 경부 연조직을 해부하여 적외선 근육을 노출시킵니다. 기관지를 시각화하기 위해 중간 선에서 근육을 분할하십시오. 일차 AoB 수술에서 봉합사를 자르고 제거하십시오.
3. 각진 Noyes 스프링 가위를 사용하여 두 연골 고리 사이에 ~2mm 기관 절개를 만듭니다(그림 2C,3B). 외부 직경 2mm (그림 2D)의 기관 캐뉼라를 기관에 넣고 4-0 실크 봉합사로 고정하십시오 (그림 2E, 3C).
4. 기관 캐뉼라를 기계식 인공 호흡기(재료 표 참조)에 연결하면서 데드 스페이스를 최소한으로 유지합니다(그림 3D-E). 수술 전 폐 환기를 8.5 mL/kg bw의 갯벌 부피(Vt)에서 90회 호흡/분의 호흡 속도로 유지하십시오.

3. 대동맥 해산

1. 미세한 가위를 사용하여 두 번째와 세 번째 갈비뼈 사이에 ~20mm 길이의 피부를 절개합니다(그림 3F).
2. 더 작은 수술용 가위(그림 2F)를 사용하여 근육을 조심스럽게 펼치고 층별로 잘라냅니다(그림 3G). 두 번째와 세 번째 늑골 사이의 늑간 공간을 따라 10mm 측면 절개를하십시오.
   참고 : 출혈을 피하기 위해 중흉골 라인을주의 깊게 접근해야합니다.
3. 늑골 스프레더(그림 2G)를 사용하여 두 번째 늑골과 세 번째 늑골 사이의 늑간 공간을 확장하여 수술 창을 만듭니다(그림 3H).
4. 무딘 포셉(그림 2B,B')의 도움으로 흉선을 심장과 도관 동맥에서 조심스럽게 분리하여 클립으로 대동맥을 시각화합니다(그림 4A).
5. 포셉의 도움으로 클립을 잡고 클립 주위의 결합 조직을 조심스럽게 제거하여 노출시킵니다.
   참고 : 대동맥을 포셉으로 잡거나 들어 올리면 대동맥이 손상되어 출혈과 치명적인 결과를 초래할 수 있으므로 피하십시오.
6. 바늘 홀더(그림 2H)를 사용하여 클립을 열고(그림 4B) 흉강에서 분리합니다.
7. 가슴을 닫기 전에 폐 atelectasis를 열고, 과도한 팽창없이 적절한 폐 모집을 보장하고, 9.5 mL / kg bw의 Ct로 10 분 동안 기계적 환기를 계속하고, 폐를 모집하고 가능한 기흉을 해결하기 위해 8.5 mL / kg bw의 Ct로 돌아갑니다.
8. 4-0 실크를 사용하여 간단한 중단 봉합사로 깊은 근육을 닫습니다. 그런 다음 상부 근육과 피부를 간단한 연속 봉합사로 연결하십시오 (그림 5A, B).

4. 기관 삽관

1. 환기 기계에서 기관 캐뉼라를 분리하십시오. 자발적인 호흡이 다시 확립 될 때까지 쥐를주의 깊게 관찰하십시오. 연결이 끊어졌을 때 동물이 자발적으로 숨을 쉬지 못하면 인공 호흡기를 다시 연결하고 추가 5 분 동안 환기를 계속하십시오. 그런 다음 절차를 반복하십시오.
2. 자발적인 호흡이 다시 확립 된 후, 기관지에서 캐뉼라를 제거하고 스폰지 포인트로 기관 주변의 액체를 청소하십시오 (그림 2I) ( 재료 표 참조).
3. 6-0 프롤렌을 사용하여 간단한 봉합사로 기관을 닫습니다(그림 2E' 및 그림 5C). 그런 다음 4-0 실크를 사용하여 간단한 중단 봉합사에서 적외선 근육을 닫고 (그림 5D), 간단한 연속 봉합사로 피부를 연결합니다 (그림 5E). 이 과정에서 포비돈-요오드/요오드포어 용액으로 근육과 피부를 청소하고 소독합니다.

5. 수술 후 관리

1. 외과 적 절차를 완료 한 후 동물을 보충 산소와 적외선 램프가있는 회복 케이지로 조심스럽게 옮겨 회복 단계에서 동물을 따뜻하고 충분히 산소를 공급하십시오. 산소 마스크를 쥐의 가까이에 두십시오. 언제든지 회복 케이지 당 하나의 동물 만 보관하십시오.
2. 동물이 깨어 난 후에는 조심스럽게 물과 음식이 들어있는 일반 새장으로 옮깁니다. 다음 12 시간 동안 2 시간 간격으로 조작 된 동물의 건강 상태를 제어하십시오.
3. 수술 절차를 완료 한 후 일주일 동안 카프로펜 (5 mg / kg bw)을 i.p. 주사하여 매일 진통제를 적용하십시오.
4. 박테리아 감염을 피하려면 수술 후 일주일 동안 식수에 아목시실린 (500 mg / L)을 투여하십시오.

결과

먼저, 성공적인 대동맥 해빙은 AoB 동물에서 해동 절차 전후에 수행된 흉부 경흉부 심초음파에 의해 확인되었다(도 6). 이를 위해, 대동맥 아치를 파라스테날 장축(PLAX) B 모드 뷰에서 평가하였다. AoB 동물에서 오름차순 대동맥 상의 클립의 위치와 뎁 수술 후 클립의 부재가 가시화되었다(도 6A,B). 다음으로, 대동맥 혈류를 맥파-웨이브 도플러 ...

토론

여기서, 래트 AoB 모델에서 대동맥 해체를 위한 상세한 수술 기술은 폐혈관구조 및 RV에서 역리모델링을 유도하는 PH-LHD와 세포 및 분자 메커니즘의 가역성을 조사하는데 활용될 수 있다고 보고되어 있다. 어린 쥐에서 대동맥 수축의 삼 주 동안 PH-LHD는 LV 압력 증가, LV 비대 및 RV 압력 및 RV 비대 증가와 동시에 증가로 분명합니다. AoB 이후 3 주째에 대동맥 해산은 Deb 후 2 주 이내에 LV를 언로드하고 LV ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amoxicillin	Ratiopharm	PC: 04150075615985	Antibiotic
Anti-BNP antibody	Abcam	ab239510	Western Blotting
Aquasonic 100 Ultrasound gel	Parker Laboratories	BT-025-0037L	Echocardiography consumables
Bepanthen	Bayer	6029009.00.00	Eye ointment eye ointment
Carprosol (Carprofen)	CP-Pharma	401808.00.00	Analgesic
Clip holder	Weck stainless USA	523140S	Surgical instruments
Fine scissors Tungsten carbide	Fine Science Tools	14568-12	Surgical scissors
Fine scissors Tungsten carbide	Fine Science Tools	14568-09	Surgical scissors
High-resolution imaging system	FUJIFILM VisualSonics, Amsterdam, Netherlands	VeVo 3100	Echocardiography machine. Images were acquired with pulse-wave Doppler mode, M-mode and B-mode
Isoflurane	CP-Pharma	400806.00.00	Anesthetic
Ketamine	CP-Pharma	401650.00.00	Anesthetic
Mathieu needle holder	Fine Science Tools	12010-14	Surgical instruments
Mechanical ventilator (Rodent ventilator)	UGO Basile S.R.L.	7025	Volume controlled respirator
Metal clip	Hemoclip	523735	Surgical consumables
Microscope	Leica	M651	Manual surgical microscope for microsurgical procedures
Millar Mikro-Tip pressure catheters	ADInstruments	SPR-671	Hemodynamics assessment
Moria Iris forceps	Fine Science Tools	11373-12	Surgical forceps
Noyes spring scissors	Fine Science Tools	15013-12	Surgical scissors
Povidone iodine/iodophor solution	B/Braun	16332M01	Disinfection
PowerLab	ADInstruments	4_35	Hemodynamics assessment
Prolene Suture, 4-0	Ethicon	EH7830	Surgical consumables
Rib spreader (Alm selfretaining retractor blunt, 70 mm, 2 3/4″)	Austos	AE-BV010R	Surgical instruments
Serrated Graefe forceps	Fine Science Tools	11052-10	Surgical forceps
Silk Suture, 4-0	Ethicon	K871	Surgical consumables
Skin disinfiction solution (colored)	B/Braun	19412M07	Disinfection
Spectra 360 Elektrode gel	Parker Laboratories	TB-250-0241H	Echocardiography consumables
Sponge points tissue	Sugi	REF 30601	Surgical consumables
Sprague-Dawley rat	Janvier Labs, Le Genest-Saint-Isle, France		Study animals
Tracheal cannula			Outer diameter 2 mm
Xylazin	CP-Pharma	401510.00.00	Anesthetic