ラットの大動脈剥離による左心疾患による肺高血圧症における逆血管リモデリングのモデル

要約

本プロトコールは、左心疾患に起因する肺高血圧症のラットモデルにおいて上行大動脈バンディングを除去するための外科的処置を記載する。この技術は、肺循環および右心臓における逆リモデリングの内因性メカニズムを研究し、したがって、肺高血圧症および/または右心室機能障害を逆転させるための戦略を知らせる。

要約

左心疾患による肺高血圧症(PH-LHD)はPHの最も一般的な形態であるが、その病態生理は肺動脈性高血圧症(PAH)よりも特徴付けが乏しい。その結果、PH-LHDの治療または予防のための承認された治療介入が欠落している。PAH患者のPHを治療するために使用される薬物は、左側充填圧力の増加の存在下で肺血管抵抗(PVR)の低下および肺血流の増加が左心代償不全および肺水腫を引き起こす可能性があるため、PH-LHDの治療には推奨されない。LHD患者のPHを逆転させるための新しい戦略を開発する必要があります。PAHとは対照的に、PH-LHDは、左心不全時の肺循環への血液の鬱血によって引き起こされる機械的負荷の増加のために発症する。臨床的には、大動脈狭窄症患者における大動脈弁置換術による左心室(LV)の機械的アンロード、または末期心不全患者におけるLVアシストデバイスの移植は、肺動脈および右心室(RV)圧力だけでなくPVRも正常化し、したがって肺血管系における逆リモデリングの間接的な証拠を提供する。圧力過負荷による左心不全によるPH-LHDの確立されたラットモデルを用いて、その後のPHの開発とともに、この生理学的逆リモデリングプロセスの分子および細胞メカニズムを研究するためのモデルを開発する。具体的には、大動脈剥離手術を行い、LV心筋のリモデリングとそのアンロードを実施した。並行して、RV収縮期圧の完全な正常化およびRV肥大の有意だが不完全な逆転が検出可能であった。このモデルは、PH-LHDおよび他の形態のPHを治療するための治療戦略を開発することを目的として、肺循環およびRVにおける生理学的逆リモデリングのメカニズムを研究するための貴重なツールを提示する可能性がある。

概要

心不全は先進国における主要な死因であり、今後10年間で25%増加すると予想されています。肺循環における血圧の病理学的上昇である肺高血圧症(PH)は、末期心不全患者の約70%に影響を及ぼす。世界保健機関(WHO)は、PHを左心疾患による肺高血圧症(PH-LHD)¹に分類しています。PH-LHDは、収縮期および/または拡張期左心室(LV)機能の障害によって開始され、肺循環²への血液の充填圧力の上昇および受動的な鬱血をもたらす。最初は可逆的であったが、PH−LHDは、肺循環のすべての区画、すなわち動脈、毛細血管、および静脈³、⁴における活発な肺血管リモデリングのために徐々に固定される。可逆的および固定されたPHの両方がRV後負荷を増加させ、最初は適応性心筋肥大を駆動するが、最終的にはRV拡張、運動低下、線維症、およびRV障害を漸進的に導く代償不全を引き起こす¹、^2、5、6。このように、PHは心不全患者の疾患進行を加速し、特に左心室補助装置(LVAD)の移植および/または心臓移植による外科的治療を受けている患者において死亡率を増加させる^7,8,9。現在、肺血管リモデリングのプロセスを逆転させる治療法は存在しないため、適切なモデル系における基礎的な機構的研究が必要である。

重要なことに、臨床研究は、大動脈狭窄症患者の頻繁な合併症としてのPH-LHDが、大動脈弁置換術後の術後早期に急速に改善し得ることを示している¹⁰。同様に、ニトロプルシドで可逆的であった高い(>3ウッドユニット)術前肺血管抵抗(PVR)は、5年間の追跡調査で心臓移植後に持続的に正常化された¹¹。同様に、LHD患者における可逆的および固定的PVRの両方の適切な減少およびRV機能の改善は、移植可能な拍動性および非拍動性補助心室装置12^、13、14を用いて左心室をアンロードすることによって数ヶ月以内に実現され得る。現在、肺循環およびRV心筋における逆リモデリングを駆動する細胞および分子機構は不明である。しかし、彼らの理解は、PH-LHDおよび他の形態のPHにおける肺血管およびRVリモデリングを逆転させるために治療的に利用され得る生理学的経路に関する重要な洞察を提供する可能性がある。

PH-LHDの病態生理学的および分子的特徴を適切に複製する適切な前臨床モデルは、ラットにおける外科的大動脈バンディング(AoB)による圧力過負荷誘発うっ血性心不全における翻訳研究に使用することができる⁴、^15、16。横大動脈狭窄(TAC)¹⁷のマウスモデルにおける圧力過負荷による同様の心不全と比較して、AoBラットにおける大動脈根の上の上の上行大動脈のバンディングは、バンディング部位が大動脈からの左頚動脈の流出の近位であるため、左頚動脈に高血圧を生じさせない。その結果、AoBはTAC¹⁸に特徴的であるように皮質に左側ニューロン損傷を引き起こさず、研究結果に影響を与える可能性がある。外科的に誘導されたPH-LHDの他のげっ歯類モデルと比較して、ラットモデル全般、特にAoBは、より堅牢で再現性があり、PH-LHD患者に対する肺循環特性のリモデリングを複製することが証明されている。同時に、周術期の致死率は低い¹⁹。AoBラットにおけるLV圧力の上昇およびLV機能不全は、PH−LHD発生を誘導し、RV圧力の上昇およびRVリモデリングをもたらす。このように、AoBラットモデルは、肺血管リモデリングの病態メカニズムを同定し、PH-LHD 4、15、20、21、22、²³、²⁴、²⁵の潜在的な治療戦略をテストするために^、私たちを含む独立したグループによる一連の先行研究において非常に有用であることが証明され^{ています。}

本研究では、AoBラットモデルを利用して、肺血管系およびRVにおける逆リモデリングのメカニズムを研究するために大動脈剥離の外科的手順を確立した。 回復。さらに、限られた数の以前の研究では、ラットのPH-LHDに対する大動脈デバンドの影響が調査され、大動脈デバンドが肺細動脈の内側肥大を逆転させ、プレプロエンドセリン1の発現を正常化し、肺血行動態を改善する可能性があることを示しており^27,28、心不全ラットにおけるPHの可逆性の証拠を提供している。ここで、デバンド手術の技術的手順は、例えば、気管内挿管の代わりに気管切開を適用することによって、または鈍針^26,27を有するポリプロピレン縫合糸の代わりに大動脈バンディングのために定義された内径のチタンクリップを使用することによって、最適化および標準化され、したがって、外科的処置のより良い制御、モデルの再現性の向上および生存率の改善を提供する。

科学的観点から、PH-LHDデバンドモデルの重要性は、心不全における心血管および肺表現型の可逆性を実証することにあるだけでなく、より重要なことに、将来の治療標的化の有望な候補として肺動脈における逆リモデリングを誘発および/または維持する分子ドライバーの同定にある。

プロトコル

すべての手順は、「実験動物の世話と使用のためのガイド」(実験動物資源研究所、第8版2011)に従って行われ、ドイツ国家保健社会問題局(Landesamt für Gesundheit undheit und Soziales (LaGeSO)、ベルリン、プロトコル番号)の地方政府の動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。G0030/18)。まず、うっ血性心不全は、前述のように上行大動脈上に内径0.8mmのチタンクリップ(大動脈バンディング、AoB)を配置することによって、若年性Sprague-Dawleyラット〜100g体重(bw)(材料表参照)において外科的に誘発された^29,30。AoB後の3週目に(図1)、大動脈からクリップを除去するためにデバンド(Deb)手術を行った。実施したAoBラットにおける外科的処置およびPH逆転の検証を図1に模式的に示している。

1.外科的準備

1. 必要な手術器具(図2)をオートクレーブで滅菌します。
2. ラットにカルプロフェン(5mg / kg bw)( 材料表を参照)を腹腔内(i.p.)注射し、手術の30分前に鎮痛を行う。
3. ケタミン(87mg/kg bw)およびキシラジン(13mg/kg bw)のi.p.注射によってラットを麻酔する。
4. 電気シェーバーを使用して動物の首筋と胸から髪を取り除きます。
5. 手術中に目を保護するために眼軟膏を一滴塗布する。
6. ラットを滅菌手術台の仰臥位に置く。動物の腹部と手足を粘着テープで慎重に固定します。
   注:体温を維持するには、手術台の下に37°Cの加熱マットを置きます。目の乾燥を防ぐために、頭部の加熱を避けてください。
7. 動物の皮膚をポビドンヨード/ヨードフォール溶液で消毒する。一次AoB手術の傷跡や縫合糸に注意し、手術野をドレープします。
8. つま先をつまむことによって麻酔の適切な深さを確保しなさい。
   注:麻酔の深さは、手術中に定期的に制御する必要があります。

2. 気管切開と機械換気

注:手術中は、非滅菌機器を扱った後に手袋を交換してください。

1. 細かいはさみ(図2A)で、長さ7〜10mmの子宮頸部正中線切開を行います(図3A)。
2. 一対の鈍い鉗子(図2B ')の助けを借りて、子宮頸部軟部組織を解剖して舌骨周囲筋を露出させる。正中線の筋肉を分割して気管を視覚化します。縫合糸を切断し、一次AoB手術から除去する。
3. 角度の付いたNoyesスプリングハサミを使用して、2つの軟骨リングの間に約2mmの気管切開を行います(図2C、3B)。外径2mmの気管カニューレ(図2D)を気管に挿入し、4-0シルク縫合糸で固定します(図2E、3C)。
4. 気管カニューレを機械式人工呼吸器(材料表を参照)に接続し、デッドスペースを最小限に抑えます(図3D-E)。周術期の肺換気は、8.5 mL/kg bwの一回換気量(Vt)で呼吸数90呼吸/分に保ちます。

3. 大動脈剥離

1. 細かいはさみを使用して、2番目と3番目の肋骨の間に約20mmの長さの皮膚切開を行います(図3F)。
2. 小型の外科用はさみ(図2F)の助けを借りて、筋肉を慎重に広げ、それらを層ごとに切断します(図3G)。第2および第3の肋骨の間の肋間腔に沿って10mmの側方切開を行う。
   注:出血を避けるために、胸骨中央のラインに慎重に近づく必要があります。
3. リブスプレッダー(図2G)を使用して、第2および第3のリブの間の肋間腔を拡大し、手術窓を作成する(図3H)。
4. 鈍い鉗子(図2B,B ')の助けを借りて、胸腺を心臓と導管動脈から慎重に分離し、クリップで大動脈を視覚化します(図4A)。
5. 鉗子の助けを借りてクリップを持ち、クリップの周りの結合組織を慎重に取り除いて露出させます。
   注:大動脈を鉗子で保持または持ち上げることは避けてください、それは出血と致命的な結果をもたらす大動脈を傷つけるかもしれないので。
6. ニードルホルダー(図2H)を使用して、クリップを開き(図4B)、胸腔から取り外します。
7. 胸を閉じる前に、肺無気肺を開き、過度の膨張なしに適切な肺動員を確保し、9.5mL / kg bwのVtでさらに10分間機械的換気を続け、8.5mL / kg bwのWtに戻って肺を募集し、気胸の可能性を解決する。
8. 4-0の絹を使用して単純な中断された縫合糸によって深部筋肉を閉じる。次に、上部の筋肉と皮膚を単純な連続縫合糸で接続します(図5A、B)。

4. 気管抜管

1. 気管カニューレを換気装置から外します。自発呼吸が再び確立されるまでラットを注意深く観察する。切断時に動物が自発的に呼吸できない場合は、人工呼吸器を再接続し、さらに5分間換気を続けます。その後、この手順を繰り返します。
2. 自発呼吸が再開されたら、気管からカニューレを取り出し、気管周辺の液体をスポンジポイントで洗浄します(図2I)( 材料表を参照)。
3. 6-0プロリーンを用いて簡単な縫合糸で気管を閉じる(図2E'および 図5C)。次に、4-0シルクを用いて単純な中断縫合糸で舌骨下筋を閉じ(図5D)、皮膚を単純な連続縫合糸で接続する(図5E)。プロセス中に筋肉と皮膚をポビドンヨード/ヨードフォール溶液できれいにし、消毒します。

5. 術後ケア

1. 外科的処置を完了した後、回復段階の間、動物を暖かく十分に酸素化しておくために、補助酸素と赤外線ランプを備えた回復ケージに動物を慎重に移動させる。酸素マスクをラットの鼻の近くに置きます。回復ケージごとに一度に1匹の動物だけを飼ってください。
2. 動物が目を覚ましたら、水と食べ物が供給された通常のケージに慎重に移動してください。次の12時間の間、2時間間隔で手術動物の健康状態を制御します。
3. 外科的処置を完了した後、カルプロフェン(5mg / kg bw)を1週間注射して毎日鎮痛を適用する。
4. 細菌感染を避けるために、アモキシシリン(500mg / L)を飲料水中に術後1週間投与する。

結果

まず、大動脈デバンドの成功は、AoB動物においてデバンド処置の前後に行われる経胸部心エコー検査によって確認された(図6)。この目的のために、大動脈弓を、胸骨傍長軸(PLAX)Bモード図で評価した。AoB動物における上行大動脈上のクリップの位置およびDeb手術後のその不在を視覚化した(図6A、B)。次に、大動脈血流をパルス波ドップ?...

ディスカッション

ここでは、ラットAoBモデルにおける大動脈剥離の詳細な外科的手法が、PH-LHDの可逆性や、肺血管系やRVにおけるリバースリモデリングを駆動する細胞・分子機構の調査に利用できることが報告されている。幼若ラットにおける3週間の大動脈狭窄は、LV圧の増加、LV肥大、および付随的に増加したRV圧およびRV肥大として明らかなPH−LHDをもたらす。AoB後3週目の大動脈剥離は、LVをアンロードし、...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amoxicillin	Ratiopharm	PC: 04150075615985	Antibiotic
Anti-BNP antibody	Abcam	ab239510	Western Blotting
Aquasonic 100 Ultrasound gel	Parker Laboratories	BT-025-0037L	Echocardiography consumables
Bepanthen	Bayer	6029009.00.00	Eye ointment eye ointment
Carprosol (Carprofen)	CP-Pharma	401808.00.00	Analgesic
Clip holder	Weck stainless USA	523140S	Surgical instruments
Fine scissors Tungsten carbide	Fine Science Tools	14568-12	Surgical scissors
Fine scissors Tungsten carbide	Fine Science Tools	14568-09	Surgical scissors
High-resolution imaging system	FUJIFILM VisualSonics, Amsterdam, Netherlands	VeVo 3100	Echocardiography machine. Images were acquired with pulse-wave Doppler mode, M-mode and B-mode
Isoflurane	CP-Pharma	400806.00.00	Anesthetic
Ketamine	CP-Pharma	401650.00.00	Anesthetic
Mathieu needle holder	Fine Science Tools	12010-14	Surgical instruments
Mechanical ventilator (Rodent ventilator)	UGO Basile S.R.L.	7025	Volume controlled respirator
Metal clip	Hemoclip	523735	Surgical consumables
Microscope	Leica	M651	Manual surgical microscope for microsurgical procedures
Millar Mikro-Tip pressure catheters	ADInstruments	SPR-671	Hemodynamics assessment
Moria Iris forceps	Fine Science Tools	11373-12	Surgical forceps
Noyes spring scissors	Fine Science Tools	15013-12	Surgical scissors
Povidone iodine/iodophor solution	B/Braun	16332M01	Disinfection
PowerLab	ADInstruments	4_35	Hemodynamics assessment
Prolene Suture, 4-0	Ethicon	EH7830	Surgical consumables
Rib spreader (Alm selfretaining retractor blunt, 70 mm, 2 3/4″)	Austos	AE-BV010R	Surgical instruments
Serrated Graefe forceps	Fine Science Tools	11052-10	Surgical forceps
Silk Suture, 4-0	Ethicon	K871	Surgical consumables
Skin disinfiction solution (colored)	B/Braun	19412M07	Disinfection
Spectra 360 Elektrode gel	Parker Laboratories	TB-250-0241H	Echocardiography consumables
Sponge points tissue	Sugi	REF 30601	Surgical consumables
Sprague-Dawley rat	Janvier Labs, Le Genest-Saint-Isle, France		Study animals
Tracheal cannula			Outer diameter 2 mm
Xylazin	CP-Pharma	401510.00.00	Anesthetic