Un modèle de remodelage vasculaire inverse dans l’hypertension pulmonaire due à une maladie cardiaque gauche par dégroupage aortique chez le rat

Résumé

Le présent protocole décrit une intervention chirurgicale visant à enlever les bandes aortiques ascendantes dans un modèle d’hypertension pulmonaire chez le rat due à une maladie cardiaque gauche. Cette technique étudie les mécanismes endogènes de remodelage inverse dans la circulation pulmonaire et le cœur droit, éclairant ainsi les stratégies pour inverser l’hypertension pulmonaire et / ou le dysfonctionnement ventriculaire droit.

Résumé

L’hypertension pulmonaire due à une maladie cardiaque gauche (PH-LHD) est la forme la plus courante d’HTP, mais sa physiopathologie est mal caractérisée que l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP). En conséquence, les interventions thérapeutiques approuvées pour le traitement ou la prévention de PH-LHD sont manquantes. Les médicaments utilisés pour traiter l’HTP chez les patients atteints d’HTAP ne sont pas recommandés pour le traitement de la HTP-LHD, car une résistance vasculaire pulmonaire (RVP) réduite et une augmentation du flux sanguin pulmonaire en présence d’une augmentation des pressions de remplissage du côté gauche peuvent provoquer une décompensation du cœur gauche et un œdème pulmonaire. De nouvelles stratégies doivent être développées pour inverser l’HTP chez les patients atteints de LHD. Contrairement à l’HTAP, le PH-LHD se développe en raison d’une charge mécanique accrue causée par la congestion du sang dans la circulation pulmonaire pendant l’insuffisance cardiaque gauche. Cliniquement, le déchargement mécanique du ventricule gauche (LV) par remplacement valvulaire aortique chez les patients atteints de sténose aortique ou par implantation de dispositifs d’assistance LV chez les patients atteints d’insuffisance cardiaque en phase terminale normalise non seulement les pressions artérielles pulmonaires et ventriculaires droites (RV), mais également la PVR, fournissant ainsi des preuves indirectes du remodelage inverse du système vasculaire pulmonaire. En utilisant un modèle établi de PH-LHD chez le rat en raison d’une insuffisance cardiaque gauche déclenchée par une surcharge de pression avec développement ultérieur de PH, un modèle est développé pour étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires de ce processus physiologique de remodelage inverse. Plus précisément, une chirurgie de débandage aortique a été effectuée, ce qui a entraîné un remodelage inverse du myocarde LV et son déchargement. En parallèle, une normalisation complète de la pression systolique RV et une inversion significative mais incomplète de l’hypertrophie RV étaient détectables. Ce modèle peut présenter un outil précieux pour étudier les mécanismes du remodelage physiologique inversé dans la circulation pulmonaire et le VR, visant à développer des stratégies thérapeutiques pour traiter le PH-LHD et d’autres formes d’HTP.

Introduction

L’insuffisance cardiaque est la principale cause de décès dans les pays développés et devrait augmenter de 25% au cours de la prochaine décennie. L’hypertension pulmonaire (HTP) - une augmentation pathologique de la pression artérielle dans la circulation pulmonaire - affecte environ 70% des patients atteints d’insuffisance cardiaque terminale; l’Organisation mondiale de la santé classe l’HTP comme hypertension pulmonaire due à une maladie cardiaque gauche (PH-LHD)¹. Ph-LHD est initié par une altération de la fonction ventriculaire gauche (LV) systolique et/ ou diastolique qui entraîne une pression de remplissage élevée et une congestion passive du sang dans la circulation pulmonaire². Bien qu’initialement réversible, le PH-LHD se fixe progressivement en raison du remodelage vasculaire pulmonaire actif dans tous les compartiments de la circulation pulmonaire, c’est-à-dire les artères, les capillaires et les veines ^3,4. L’HTP réversible et fixe augmente la post-charge du VR, entraînant initialement une hypertrophie myocardique adaptative, mais provoquant finalement une dilatation du VR, une hypokinésie, une fibrose et une décompensation qui conduisent progressivement à une défaillance du VR 1,2,5,6. En tant que tel, l’HTP accélère la progression de la maladie chez les patients atteints d’insuffisance cardiaque et augmente la mortalité, en particulier chez les patients subissant un traitement chirurgical par implantation de dispositifs d’assistance ventriculaire gauche (LVAD) et / ou transplantation cardiaque ^7,8,9. À l’heure actuelle, il n’existe aucune thérapie curative qui pourrait inverser le processus de remodelage vasculaire pulmonaire, de sorte qu’une recherche mécaniste fondamentale dans des systèmes modèles appropriés est nécessaire.

Il est important de noter que les études cliniques montrent que la PH-LHD en tant que complication fréquente chez les patients atteints de sténose aortique peut s’améliorer rapidement au début de la période postopératoire suivant le remplacement de la valve aortique¹⁰. De même, une résistance vasculaire pulmonaire (PVR) préopératoire élevée (>3 unités de bois) qui était toutefois réversible sur le nitroprusside a été durablement normalisée après une transplantation cardiaque dans une étude de suivi de 5 ans¹¹. De même, une réduction adéquate de la RV réversible et fixe et une amélioration de la fonction RV chez les patients atteints de LHD pourraient être réalisées en quelques mois en déchargeant le ventricule gauche à l’aide de dispositifs d’assistance ventriculaire pulsatile et non pulsatile implantables 12,13,14. Actuellement, les mécanismes cellulaires et moléculaires qui conduisent au remodelage inverse dans la circulation pulmonaire et le myocarde RV ne sont pas clairs. Pourtant, leur compréhension peut fournir des informations importantes sur les voies physiologiques qui peuvent être exploitées thérapeutiquement pour inverser le remodelage vasculaire pulmonaire et RV dans PH-LHD et d’autres formes de PH.

Un modèle préclinique approprié qui reproduit adéquatement les caractéristiques physiopathologiques et moléculaires de PH-LHD peut être utilisé pour des études translationnelles dans l’insuffisance cardiaque congestive induite par surcharge de pression due à des bandes aortiques chirurgicales (AoB) chez le rat ^4,15,16. Par rapport à une insuffisance cardiaque similaire due à une surcharge de pression dans le modèle murin de constriction aortique transversale (TAC)¹⁷, la bande de l’aorte ascendante au-dessus de la racine aortique chez les rats AoB ne produit pas d’hypertension dans l’artère carotide gauche car le site de bande est proximal de l’écoulement de l’artère carotide gauche de l’aorte. En conséquence, AoB ne provoque pas de lésion neuronale du côté gauche dans le cortex comme c’est caractéristique du TAC¹⁸, et qui peut affecter le résultat de l’étude. Comparés à d’autres modèles de rongeurs de PH-LHD induite chirurgicalement, les modèles de rats en général, et d’AoB en particulier, s’avèrent plus robustes, reproductibles et reproduisent le remodelage de la circulation pulmonaire caractéristique chez les patients atteints de PH-LHD. Dans le même temps, la létalité périopératoire est faible¹⁹. L’augmentation des pressions LV et le dysfonctionnement LV chez les rats AoB induisent le développement du PH-LHD, ce qui entraîne des pressions élevées du RV et un remodelage du RV. En tant que tel, le modèle de rat AoB s’est avéré extrêmement utile dans une série d’études antérieures menées par des groupes indépendants, y compris nous-mêmes, pour identifier les mécanismes pathologiques du remodelage vasculaire pulmonaire et tester les stratégies de traitement potentielles pour PH-LHD ^{4,15,20,21,22,23,24,25}.

Dans la présente étude, le modèle de rat AoB a été utilisé pour établir une procédure chirurgicale de dégroupage aortique afin d’étudier les mécanismes de remodelage inverse dans le système vasculaire pulmonaire et le RV. Auparavant, des modèles de remodelage inverse du myocarde tels que le dégroupage aortique chez les souris²⁶ et les rats²⁷ ont été développés pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant la régression de l’hypertrophie ventriculaire gauche et tester les options thérapeutiques potentielles pour promouvoir le myocarde récupération. De plus, un nombre limité d’études antérieures ont exploré les effets du dégroupage aortique sur le PH-LHD chez le rat et ont montré que le dégroupage aortique pourrait inverser l’hypertrophie médiale dans les artérioles pulmonaires, normaliser l’expression de la pré-pro-endothéline 1 et améliorer l’hémodynamique pulmonaire^27,28, fournissant des preuves de la réversibilité de l’HTP chez les rats atteints d’insuffisance cardiaque. Ici, les procédures techniques de la chirurgie de débandage sont optimisées et standardisées, par exemple en appliquant une trachéotomie au lieu d’une intubation endotrachéale ou en utilisant des clips en titane d’un diamètre intérieur défini pour le bandage aortique au lieu de sutures en polypropylène avec une aiguille émoussée^26,27, permettant ainsi un meilleur contrôle des procédures chirurgicales, une reproductibilité accrue du modèle et un taux de survie amélioré.

D’un point de vue scientifique, l’importance du modèle de dégroupage PH-LHD ne réside pas seulement dans la démonstration de la réversibilité du phénotype cardiovasculaire et pulmonaire dans l’insuffisance cardiaque, mais plus important encore, dans l’identification des facteurs moléculaires qui déclenchent et / ou maintiennent le remodelage inverse dans les artères pulmonaires en tant que candidats prometteurs pour un ciblage thérapeutique futur.

Protocole

Toutes les procédures ont été effectuées conformément au « Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire » (Institut des ressources des animaux de laboratoire, 8e édition 2011) et approuvées par le comité gouvernemental local de soins et d’utilisation des animaux de l’Office d’État allemand pour la santé et les affaires sociales (Landesamt für Gesundheit und Soziales (LaGeSO), Berlin; protocole no. G0030/18). Tout d’abord, l’insuffisance cardiaque congestive a été induite chirurgicalement chez les rats Sprague-Dawley juvéniles ~ 100 g de poids corporel (p.c.) (voir Tableau des matériaux) en plaçant un clip en titane d’un diamètre intérieur de 0,8 mm sur l’aorte ascendante (bandes aortiques, AoB) comme décrit précédemment^29,30. À la semaine 3 après AoB (Figure 1), une chirurgie de débandage (Deb) a été effectuée pour retirer le clip de l’aorte. Les interventions chirurgicales et la validation de l’inversion du pH chez les rats AoB effectuées sont représentées schématiquement à la figure 1.

1. Préparations chirurgicales

1. Stériliser les instruments chirurgicaux requis (Figure 2) par autoclavage.
2. Injecter au rat du carprofène (5 mg/kg p.c.) (voir le tableau des matériaux) par voie intrapéritonéale (i.p.) pour l’analgésie 30 min avant la chirurgie.
3. Anesthésier le rat par injection intraveineuse de kétamine (87 mg/kg p.c.) et de xylazine (13 mg/kg p.c.).
4. Retirez les poils de l’encolure et de la poitrine de l’animal à l’aide d’un rasoir électrique.
5. Appliquez une goutte de pommade pour les yeux pour protéger les yeux pendant la chirurgie.
6. Placez le rat en position couchée sur une table chirurgicale stérilisée. Fixez soigneusement l’abdomen et les membres de l’animal avec du ruban adhésif.
   REMARQUE: Pour maintenir la température corporelle, placez un tapis chauffant à 37 ° C sous la table chirurgicale. Évitez le chauffage de la région de la tête pour éviter le dessèchement des yeux.
7. Désinfecter la peau des animaux avec une solution de povidone-iode/iodophor. Notez les cicatrices et les sutures de la chirurgie AoB primaire et drapez le champ chirurgical.
8. Assurer une profondeur adéquate de l’anesthésie par pincement des orteils.
   REMARQUE: La profondeur de l’anesthésie doit être contrôlée régulièrement pendant la chirurgie.

2. Trachéotomie et ventilation mécanique

REMARQUE: Tout au long de la chirurgie, changez de gants après avoir manipulé de l’équipement non stérile.

1. À l’aide de ciseaux fins (figure 2A), faites une incision cervicale médiane de 7 à 10 mm de long (figure 3A).
2. À l’aide d’une paire de pinces contondantes (Figure 2B'), disséquez les tissus mous cervicaux pour exposer les muscles infrahyoïdes. Divisez les muscles dans la ligne médiane pour visualiser la trachée. Coupez et retirez la suture de la chirurgie AoB primaire.
3. Faites une incision de la trachée d’environ 2 mm entre deux anneaux cartilagineux à l’aide de ciseaux à ressort Noyes inclinés (Figure 2C,3B). Insérez la canule trachéale de diamètre extérieur de 2 mm (Figure 2D) dans la trachée et fixez-la avec une suture de soie 4-0 (Figure 2E,3C).
4. Raccordez la canule trachéale à un ventilateur mécanique (voir Tableau des matériaux) tout en réduisant au minimum l’espace mort (figure 3D-E). Maintenir la ventilation pulmonaire périopératoire à une fréquence respiratoire de 90 respirations/min à un volume courant (Vt) de 8,5 mL/kg p.c.

3. Débandage aortique

1. Faites une incision cutanée d’environ 20 mm de long entre la deuxième et la troisième côte à l’aide de ciseaux fins (Figure 3F).
2. À l’aide de ciseaux chirurgicaux plus petits (Figure 2F), étalez soigneusement les muscles et coupez-les couche par couche (Figure 3G). Faites une incision latérale de 10 mm le long de l’espace intercostal entre la deuxième et la troisième côte.
   REMARQUE: La ligne médiane doit être soigneusement approchée pour éviter les saignements.
3. Utilisez un épandeur de côtes (figure 2G) pour élargir l’espace intercostal entre la deuxième et la troisième côte afin de créer une fenêtre chirurgicale (figure 3H).
4. À l’aide de pinces contondantes (Figure 2B,B'), séparez soigneusement le thymus du cœur et conduisez les artères pour visualiser l’aorte avec le clip (Figure 4A).
5. Tenez le clip à l’aide de la pince et retirez soigneusement le tissu conjonctif autour du clip pour l’exposer.
   REMARQUE: Évitez de tenir ou de soulever l’aorte avec la pince, car cela pourrait blesser l’aorte entraînant des saignements et une issue mortelle.
6. À l’aide d’un porte-aiguille (Figure 2H), ouvrez le clip (Figure 4B) et retirez-le de la cavité thoracique.
7. Avant de fermer la poitrine, ouvrir l’atélectasie pulmonaire, assurer un recrutement pulmonaire adéquat sans surdistension, poursuivre la ventilation mécanique avec un Vt de 9,5 mL/kg p.c. pendant encore 10 min, et revenir à un Vt de 8,5 mL/kg p.c. pour recruter les poumons et résoudre un éventuel pneumothorax.
8. Fermez les muscles profonds par une simple suture interrompue à l’aide de soie 4-0. Reliez ensuite les muscles supérieurs et la peau avec une simple suture continue (Figure 5A,B).

4. Extubation trachéale

1. Débranchez la canule trachéale de la machine de ventilation. Observez attentivement le rat jusqu’à ce que la respiration spontanée soit rétablie. Si l’animal ne respire pas spontanément lors de la déconnexion, reconnectez le ventilateur et continuez à ventiler pendant 5 minutes supplémentaires. Répétez ensuite la procédure.
2. Une fois la respiration spontanée rétablie, retirez la canule de la trachée et nettoyez le liquide autour de la trachée avec des points d’éponge (Figure 2I) (voir tableau des matériaux).
3. Fermez la trachée avec une suture simple à l’aide de 6-0 prolène (Figure 2E' et Figure 5C). Ensuite, fermez les muscles infrahyoïdes dans une simple suture interrompue à l’aide de soie 4-0 (Figure 5D) et connectez la peau dans une suture continue simple (Figure 5E). Nettoyez et désinfectez les muscles et la peau pendant le processus avec une solution de povidone-iode / iodophor.

5. Soins postopératoires

1. Après avoir terminé l’intervention chirurgicale, déplacez soigneusement l’animal dans une cage de récupération avec de l’oxygène supplémentaire et une lampe infrarouge pour garder les animaux au chaud et suffisamment oxygénés pendant la phase de récupération. Placez le masque à oxygène près du museau du rat. Ne gardez qu’un seul animal par cage de récupération à tout moment.
2. Après le réveil de l’animal, déplacez-le soigneusement dans une cage ordinaire alimentée en eau et en nourriture. Pendant les 12 heures suivantes, contrôlez l’état de santé de l’animal opéré à des intervalles de 2 heures.
3. Après avoir terminé l’intervention chirurgicale, appliquer l’analgésie quotidiennement par injection intraveineuse de carprofène (5 mg/kg p.c.) pendant une semaine.
4. Pour éviter l’infection bactérienne, administrer l’amoxicilline (500 mg / L) dans l’eau potable pendant une semaine après l’opération.

Résultats

Tout d’abord, le succès du dégroupage aortique a été confirmé par une échocardiographie transthoracique réalisée avant et après la procédure de dégroupage chez les animaux AoB (Figure 6). À cette fin, l’arc aortique a été évalué en mode B à axe long parastéral (PLAX). La position du clip sur l’aorte ascendante chez les animaux AoB et son absence après la chirurgie de Deb ont été visualisées (Figure 6A,B). Ensuite, le ...

Discussion

Ici, une technique chirurgicale détaillée pour le débandage aortique dans un modèle AoB de rat est rapportée qui peut être utilisée pour étudier la réversibilité de PH-LHD et les mécanismes cellulaires et moléculaires qui conduisent au remodelage inverse dans le système vasculaire pulmonaire et le RV. Trois semaines de constriction aortique chez les rats juvéniles entraînent une augmentation de la PH-LHD sous forme d’augmentation de la pression de la VL, d’hypertrophie de la VL et d’augmentation conc...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amoxicillin	Ratiopharm	PC: 04150075615985	Antibiotic
Anti-BNP antibody	Abcam	ab239510	Western Blotting
Aquasonic 100 Ultrasound gel	Parker Laboratories	BT-025-0037L	Echocardiography consumables
Bepanthen	Bayer	6029009.00.00	Eye ointment eye ointment
Carprosol (Carprofen)	CP-Pharma	401808.00.00	Analgesic
Clip holder	Weck stainless USA	523140S	Surgical instruments
Fine scissors Tungsten carbide	Fine Science Tools	14568-12	Surgical scissors
Fine scissors Tungsten carbide	Fine Science Tools	14568-09	Surgical scissors
High-resolution imaging system	FUJIFILM VisualSonics, Amsterdam, Netherlands	VeVo 3100	Echocardiography machine. Images were acquired with pulse-wave Doppler mode, M-mode and B-mode
Isoflurane	CP-Pharma	400806.00.00	Anesthetic
Ketamine	CP-Pharma	401650.00.00	Anesthetic
Mathieu needle holder	Fine Science Tools	12010-14	Surgical instruments
Mechanical ventilator (Rodent ventilator)	UGO Basile S.R.L.	7025	Volume controlled respirator
Metal clip	Hemoclip	523735	Surgical consumables
Microscope	Leica	M651	Manual surgical microscope for microsurgical procedures
Millar Mikro-Tip pressure catheters	ADInstruments	SPR-671	Hemodynamics assessment
Moria Iris forceps	Fine Science Tools	11373-12	Surgical forceps
Noyes spring scissors	Fine Science Tools	15013-12	Surgical scissors
Povidone iodine/iodophor solution	B/Braun	16332M01	Disinfection
PowerLab	ADInstruments	4_35	Hemodynamics assessment
Prolene Suture, 4-0	Ethicon	EH7830	Surgical consumables
Rib spreader (Alm selfretaining retractor blunt, 70 mm, 2 3/4″)	Austos	AE-BV010R	Surgical instruments
Serrated Graefe forceps	Fine Science Tools	11052-10	Surgical forceps
Silk Suture, 4-0	Ethicon	K871	Surgical consumables
Skin disinfiction solution (colored)	B/Braun	19412M07	Disinfection
Spectra 360 Elektrode gel	Parker Laboratories	TB-250-0241H	Echocardiography consumables
Sponge points tissue	Sugi	REF 30601	Surgical consumables
Sprague-Dawley rat	Janvier Labs, Le Genest-Saint-Isle, France		Study animals
Tracheal cannula			Outer diameter 2 mm
Xylazin	CP-Pharma	401510.00.00	Anesthetic