Ein Modell des umgekehrten vaskulären Remodells bei pulmonaler Hypertonie aufgrund von Linksherzerkrankungen durch Aortendebandation bei Ratten

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt einen chirurgischen Eingriff zur Entfernung von aufsteigender Aortenbande in einem Rattenmodell der pulmonalen Hypertonie aufgrund einer Erkrankung des linken Herzens. Diese Technik untersucht endogene Mechanismen des umgekehrten Remodells im Lungenkreislauf und im rechten Herzen und informiert so über Strategien zur Umkehrung der pulmonalen Hypertonie und / oder der rechtsventrikulären Dysfunktion.

Zusammenfassung

Pulmonale Hypertonie aufgrund von Linksherzerkrankungen (PH-LHD) ist die häufigste Form von PH, aber ihre Pathophysiologie ist schlecht charakterisiert als die pulmonale arterielle Hypertonie (PAH). Dadurch fehlen zugelassene therapeutische Interventionen zur Behandlung oder Prävention von PH-LHD. Medikamente zur Behandlung von PH bei PAH-Patienten werden für die Behandlung von PH-LHD nicht empfohlen, da ein verminderter pulmonaler Gefäßwiderstand (PVR) und ein erhöhter pulmonaler Blutfluss bei erhöhtem linksseitigen Fülldruck zu einer Dekompensation des linken Herzens und einem Lungenödem führen können. Neue Strategien müssen entwickelt werden, um die PH bei LHD-Patienten umzukehren. Im Gegensatz zu PAH entwickelt sich die PH-LHD aufgrund einer erhöhten mechanischen Belastung, die durch die Verstopfung des Blutes in den Lungenkreislauf während der Linksherzinsuffizienz verursacht wird. Klinisch normalisiert die mechanische Entlastung des linken Ventrikels (LV) durch Aortenklappenersatz bei Patienten mit Aortenstenose oder durch Implantation von LV-Hilfsmitteln bei Patienten mit Herzinsuffizienz im Endstadium nicht nur den pulmonalen arteriellen und rechtsventrikulären (RV) Druck, sondern auch die PVR und liefert somit indirekte Hinweise auf einen umgekehrten Umbau im Lungengefäßsystem. Unter Verwendung eines etablierten Rattenmodells von PH-LHD aufgrund von Linksherzinsuffizienz, ausgelöst durch Drucküberlastung mit anschließender Entwicklung von PH, wird ein Modell entwickelt, um die molekularen und zellulären Mechanismen dieses physiologischen Reverse-Remodeling-Prozesses zu untersuchen. Insbesondere wurde eine Aortenentzündungsoperation durchgeführt, die zu einer umgekehrten Umgestaltung des LV-Myokards und seiner Entladung führte. Parallel dazu war eine vollständige Normalisierung des systolischen RV-Drucks und eine signifikante, aber unvollständige Umkehrung der RV-Hypertrophie nachweisbar. Dieses Modell könnte ein wertvolles Werkzeug darstellen, um die Mechanismen des physiologischen Reverse-Remodellings im Lungenkreislauf und im RV zu untersuchen, um therapeutische Strategien zur Behandlung von PH-LHD und anderen Formen von PH zu entwickeln.

Einleitung

Herzinsuffizienz ist die häufigste Todesursache in den Industrieländern und wird in den nächsten zehn Jahren voraussichtlich um 25% zunehmen. Pulmonale Hypertonie (PH) - ein pathologischer Anstieg des Blutdrucks im Lungenkreislauf - betrifft etwa 70% der Patienten mit Herzinsuffizienz im Endstadium; Die Weltgesundheitsorganisation klassifiziert PH als pulmonale Hypertonie aufgrund einer Linksherzerkrankung (PH-LHD)¹. PH-LHD wird durch eine beeinträchtigte systolische und/oder diastolische linksventrikuläre (LV) Funktion ausgelöst, die zu einem erhöhten Fülldruck und einer passiven Verstopfung des Blutes in den Lungenkreislauf führt². Obwohl zunächst reversibel, wird PH-LHD aufgrund des aktiven pulmonalen Gefäßumbaus in allen Kompartimenten des Lungenkreislaufs, d.h. Arterien, Kapillaren und Venen^allmählich fixiert ^3,4. Sowohl der reversible als auch der feste pH-Wert erhöhen die RV-Nachlast, was zunächst zu einer adaptiven myokardialen Hypertrophie führt, aber letztendlich zu RV-Dilatation, Hypokinese, Fibrose und Dekompensation führt, die progressiv zum RV-Ausfall^führen 1,2,5,6. Als solches beschleunigt PH das Fortschreiten der Erkrankung bei Patienten mit Herzinsuffizienz und erhöht die Mortalität, insbesondere bei Patienten, die sich einer chirurgischen Behandlung durch Implantation von linksventrikulären Unterstützungsgeräten (LVAD) und/oder Herztransplantation unterziehen ^7,8,9. Derzeit gibt es keine kurativen Therapien, die den Prozess des pulmonalen Gefäßumbaus umkehren könnten, so dass grundlegende mechanistische Forschung in geeigneten Modellsystemen erforderlich ist.

Wichtig ist, dass klinische Studien zeigen, dass sich PH-LHD als häufige Komplikation bei Patienten mit Aortenstenose in der frühen postoperativen Phase nach dem Aortenklappenersatz^{schnell verbessern kann 10}. Analog dazu wurde der hohe (>3 Wood Units) präoperative pulmonale Gefäßwiderstand (PVR), der jedoch auf Nitroprussid reversibel war, nach einer Herztransplantation in einer 5-jährigen Follow-up-Studie nachhaltig normalisiert¹¹. In ähnlicher Weise konnte eine adäquate Reduzierung sowohl der reversiblen als auch der stationären PVR und eine Verbesserung der RV-Funktion bei LHD-Patienten innerhalb weniger Monate erreicht werden, indem der linke Ventrikel mit implantierbaren pulsierenden und nicht-pulsierenden ventrikulären Unterstützungsgeräten^{entladen wurde 12,13,14}. Derzeit sind die zellulären und molekularen Mechanismen, die den umgekehrten Umbau im Lungenkreislauf und im RV-Myokard vorantreiben, unklar. Ihr Verständnis kann jedoch wichtige Einblicke in physiologische Signalwege liefern, die therapeutisch genutzt werden können, um den Lungengefäß- und RV-Remodeling bei PH-LHD und anderen Formen von PH umzukehren.

Ein geeignetes präklinisches Modell, das die pathophysiologischen und molekularen Merkmale von PH-LHD adäquat repliziert, kann für translationale Studien bei drucküberlastinduzierter kongestiver Herzinsuffizienz aufgrund von chirurgischem Aortenbanding (AoB) bei Ratten^{verwendet werden} 4,15,16. Im Vergleich zu einer ähnlichen Herzinsuffizienz aufgrund von Drucküberlastung im murinen Modell der transversalen Aortenverengung (TAC)¹⁷ führt die Bandenbildung der aufsteigenden Aorta über der Aortenwurzel bei AoB-Ratten nicht zu Bluthochdruck in der linken Halsschlagader, da die Bandingstelle proximal des Abflusses der linken Halsschlagader aus der Aorta ist. Infolgedessen verursacht AoB keine linksseitige neuronale Verletzung im Kortex, wie es für TAC¹⁸ charakteristisch ist und die das Studienergebnis beeinflussen kann. Im Vergleich zu anderen Nagetiermodellen von chirurgisch induziertem PH-LHD erweisen sich Rattenmodelle im Allgemeinen und AoB im Besonderen als robuster, reproduzierbarer und replizieren den für PH-LHD-Patienten charakteristischen Umbau des Lungenkreislaufs. Gleichzeitig ist die perioperative Letalität niedrig¹⁹. Erhöhte LV-Drücke und LV-Dysfunktion bei AoB-Ratten induzieren die PH-LHD-Entwicklung, was zu erhöhten RV-Drücken und RV-Umbau führt. Daher hat sich das AoB-Rattenmodell in einer Reihe früherer Studien unabhängiger Gruppen, einschließlich uns, als äußerst nützlich erwiesen, um Pathomechanismen des pulmonalen vaskulären Remodells zu identifizieren und mögliche Behandlungsstrategien für PH-LHD 4,15,20,21,22,23,24,25 zu testen.

In der vorliegenden Studie wurde das AoB-Rattenmodell verwendet, um ein chirurgisches Verfahren der Aortendebandierung zu etablieren, um Mechanismen des umgekehrten Remodells in der Lungenvaskulatur und im RV zu untersuchen. Zuvor wurden myokardiale Reverse-Remodeling-Modelle wie die Aortendebandierung bei Mäusen²⁶ und Ratten²⁷ entwickelt, um die zellulären und molekularen Mechanismen zu untersuchen, die die Regression der linksventrikulären Hypertrophie regulieren, und mögliche therapeutische Optionen zur Förderung der myokardialen Hypertrophie zu testen. Genesung. Darüber hinaus hat eine begrenzte Anzahl früherer Studien die Auswirkungen der Aortendebandierung auf PH-LHD bei Ratten untersucht und gezeigt, dass die Aortendebandierung die mediale Hypertrophie in pulmonalen Arteriolen umkehren, die Expression von Prä-Pro-Endothelin 1 normalisieren und die pulmonale Hämodynamik verbessern^{kann 27,28,} was Hinweise auf die Reversibilität von PH bei Ratten mit Herzinsuffizienz liefert. Hier werden die technischen Abläufe der Banderolierchirurgie optimiert und standardisiert, z.B. durch Anwendung einer Tracheotomie anstelle einer Endotrachealintubation oder durch die Verwendung von Titanclips eines definierten Innendurchmessers für die Aortenbandage anstelle von Polypropylennähten mit einer stumpfen Nadel^26,27 und sorgen so für eine bessere Kontrolle der chirurgischen Eingriffe^, eine erhöhte Reproduzierbarkeit des Modells und eine verbesserte Überlebensrate.

Aus wissenschaftlicher Sicht liegt die Bedeutung des PH-LHD-Debandierungsmodells nicht nur in der Demonstration der Reversibilität des kardiovaskulären und pulmonalen Phänotyps bei Herzinsuffizienz, sondern vor allem in der Identifizierung molekularer Treiber, die einen umgekehrten Remodeling in Lungenarterien auslösen und/oder aufrechterhalten, als vielversprechende Kandidaten für zukünftiges therapeutisches Targeting.

Protokoll

Alle Verfahren wurden nach dem "Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren" (Institut für Versuchstierressourcen, 8. Auflage 2011) durchgeführt und vom Landesamt für Gesundheit und Soziales (LaGeSO), Berlin; Protokoll-Nr. G0030/18). Erstens wurde eine kongestive Herzinsuffizienz bei juvenilen Sprague-Dawley-Ratten ~100 g Körpergewicht (KG) (siehe Materialtabelle) chirurgisch induziert, indem ein Titanclip mit einem Innendurchmesser von 0,8 mm auf die aufsteigende Aorta (Aortenbandbildung, AoB) gelegt wurde, wie zuvor^{beschrieben 29,30}. In Woche 3 nach AoB (Abbildung 1) wurde eine Debandierungsoperation (Deb) durchgeführt, um den Clip von der Aorta zu entfernen. Die chirurgischen Eingriffe und die Validierung der PH-Umkehrung bei AoB-Ratten sind in Abbildung 1 schematisch dargestellt.

1. Chirurgische Präparate

1. Sterilisieren Sie die erforderlichen chirurgischen Instrumente (Abbildung 2) durch Autoklavieren.
2. Injizieren Sie der Ratte Carprofen (5 mg/kg KG) (siehe Materialtabelle) intraperitoneal (i.p.) zur Analgesie 30 Minuten vor der Operation.
3. Betäubung der Ratte durch i.p. Injektion von Ketamin (87 mg/kg KG) und Xylazin (13 mg/kg KG).
4. Entfernen Sie die Haare mit einem elektrischen Rasierer vom Ausschnitt und der Brust des Tieres.
5. Tragen Sie einen Tropfen Augensalbe auf, um die Augen während der Operation zu schützen.
6. Stellen Sie die Ratte in Rückenlage auf einen sterilisierten Operationstisch. Befestigen Sie vorsichtig den Bauch und die Gliedmaßen des Tieres mit Klebeband.
   HINWEIS: Um die Körpertemperatur zu halten, legen Sie eine 37 °C heiße Heizmatte unter den OP-Tisch. Vermeiden Sie die Erwärmung der Kopfregion, um ein Austrocknen der Augen zu verhindern.
7. Desinfizieren Sie die Tierhaut mit Povidon-Jod/Jodphör-Lösung. Beachten Sie Narben und Nähte aus der primären AoB-Operation und drapieren Sie das Operationsfeld.
8. Stellen Sie eine ausreichende Tiefe der Anästhesie durch Zehenkneifen sicher.
   HINWEIS: Die Tiefe der Anästhesie muss während der Operation regelmäßig kontrolliert werden.

2. Tracheotomie und mechanische Beatmung

HINWEIS: Wechseln Sie während der gesamten Operation die Handschuhe nach dem Umgang mit nicht sterilen Geräten.

1. Machen Sie mit einer feinen Schere (Abbildung 2A) einen 7-10 mm langen zervikalen Mittellinienschnitt (Abbildung 3A).
2. Sezieren Sie mit Hilfe einer stumpfen Pinzette (Abbildung 2B') das zervikale Weichgewebe, um die infrahyoidalen Muskeln freizulegen. Spalten Sie die Muskeln in der Mittellinie, um die Luftröhre zu visualisieren. Schneiden und entfernen Sie die Naht aus der primären AoB-Operation.
3. Machen Sie ~ 2 mm Luftröhrenschnitt zwischen zwei Knorpelringen mit abgewinkelten Noyes-Federscheren (Abbildung 2C, 3B). Führen Sie die Trachealkanüle mit einem Außendurchmesser von 2 mm (Abbildung 2D) in die Luftröhre ein und befestigen Sie sie mit einer 4:0-Seidennaht (Abbildung 2E,3C).
4. Schließen Sie die Trachealkanüle an ein mechanisches Beatmungsgerät an (siehe Materialtabelle), während der Totraum auf ein Minimum reduziert wird (Abbildung 3D-E). Halten Sie die perioperative Lungenbeatmung bei einer Atemfrequenz von 90 Atemzügen/min bei einem Tidalvolumen (Vt) von 8,5 ml/kg KG aufrecht.

3. Aortenauflösung

1. Machen Sie einen ~ 20 mm langen Hautschnitt zwischen der zweiten und dritten Rippe mit einer feinen Schere (Abbildung 3F).
2. Mit Hilfe einer kleineren chirurgischen Schere (Abbildung 2F) die Muskeln vorsichtig verteilen und Schicht für Schicht schneiden (Abbildung 3G). Machen Sie einen 10 mm seitlichen Schnitt entlang des Interkostalraums zwischen der zweiten und dritten Rippe.
   HINWEIS: Die Mittelsternallinie muss vorsichtig angegangen werden, um Blutungen zu vermeiden.
3. Verwenden Sie einen Rippenspreizer (Abbildung 2G), um den Interkostalraum zwischen der zweiten und dritten Rippe zu erweitern und ein chirurgisches Fenster zu erstellen (Abbildung 3H).
4. Trennen Sie mit Hilfe einer stumpfen Pinzette (Abbildung 2B,B') den Thymus vorsichtig von den Herz- und Rohrarterien, um die Aorta mit dem Clip sichtbar zu machen (Abbildung 4A).
5. Halten Sie den Clip mit Hilfe der Pinzette fest und entfernen Sie vorsichtig das Bindegewebe um den Clip, um ihn freizulegen.
   HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Aorta mit der Pinzette zu halten oder anzuheben, da dies die Aorta verletzen kann, was zu Blutungen und einem tödlichen Ausgang führen kann.
6. Öffnen Sie mit Hilfe eines Nadelhalters (Abbildung 2H) den Clip (Abbildung 4B) und entfernen Sie ihn aus der Brusthöhle.
7. Bevor Sie die Brust schließen, öffnen Sie die Lungenatlektase, sorgen Sie für eine ausreichende Lungenrekrutierung ohne Überdehnung, setzen Sie die mechanische Beatmung mit einem Vt von 9,5 ml / kg KG für weitere 10 Minuten fort und kehren Sie zu einem Vt von 8,5 ml / kg KG zurück, um die Lunge zu rekrutieren und einen möglichen Pneumothorax aufzulösen.
8. Schließen Sie die tiefen Muskeln durch eine einfache unterbrochene Naht mit 4-0-Seide. Verbinden Sie dann die oberen Muskeln und die Haut mit einer einfachen kontinuierlichen Naht (Abbildung 5A, B).

4. Trachealextubation

1. Trennen Sie die Trachealkanüle von der Beatmungsmaschine. Beobachten Sie aufmerksam die Ratte, bis die Spontanatmung wiederhergestellt ist. Wenn das Tier beim Trennen nicht spontan atmet, schließen Sie das Beatmungsgerät wieder an und fahren Sie für weitere 5 Minuten fort. Wiederholen Sie dann den Vorgang.
2. Nachdem die Spontanatmung wieder hergestellt ist, entfernen Sie die Kanüle aus der Luftröhre und reinigen Sie die Flüssigkeit um die Luftröhre mit Schwammpunkten (Abbildung 2I) (siehe Materialtabelle).
3. Schließen Sie die Luftröhre mit einer einfachen Naht mit 6-0 Prolene (Abbildung 2E' und Abbildung 5C). Schließen Sie dann die Infrahyoidmuskeln in einer einfachen unterbrochenen Naht mit 4-0-Seide (Abbildung 5D) und verbinden Sie die Haut in einer einfachen kontinuierlichen Naht (Abbildung 5E). Reinigen und desinfizieren Sie die Muskeln und die Haut während des Prozesses mit Povidon-Jod / Jodphor Lösung.

5. Nachsorge

1. Bringen Sie das Tier nach Abschluss des chirurgischen Eingriffs vorsichtig in einen Erholungskäfig mit zusätzlichem Sauerstoff und einer Infrarotlampe, um die Tiere während der Erholungsphase warm und ausreichend mit Sauerstoff zu versorgen. Legen Sie die Sauerstoffmaske nahe an die Schnauze der Ratte. Halten Sie zu jeder Zeit nur ein Tier pro Auffangkäfig.
2. Nachdem das Tier aufgewacht ist, bringen Sie es vorsichtig in einen normalen Käfig, der mit Wasser und Nahrung versorgt wird. Für die nächsten 12 h den Gesundheitszustand des operierten Tieres in 2 h Intervallen kontrollieren.
3. Nach Abschluss des chirurgischen Eingriffs eine Woche lang täglich Analgesie durch i.p. Injektion von Carprofen (5 mg/kg KG) anwenden.
4. Um bakterielle Infektionen zu vermeiden, verabreichen Sie Amoxicillin (500 mg / L) postoperativ für eine Woche im Trinkwasser.

Ergebnisse

Zunächst wurde eine erfolgreiche Aortendebandation durch eine transthorakale Echokardiographie bestätigt, die vor und nach dem Debandierungsverfahren bei AoB-Tieren durchgeführt wurde (Abbildung 6). Zu diesem Zweck wurde der Aortenbogen in der B-Mode-Ansicht der parasternalen Langachse (PLAX) bewertet. Die Position des Clips auf der aufsteigenden Aorta bei AoB-Tieren und ihre Abwesenheit nach der Deb-Operation wurde visualisiert (Abbildung 6A,B

Diskussion

Hier wird eine detaillierte Operationstechnik zur Aortendebandation in einem Ratten-AoB-Modell berichtet, die verwendet werden kann, um die Reversibilität von PH-LHD und die zellulären und molekularen Mechanismen zu untersuchen, die den umgekehrten Umbau im Lungengefäßsystem und im RV vorantreiben. Drei Wochen Aortenverengung bei juvenilen Ratten führen zu PH-LHD, die sich als erhöhter LV-Druck, LV-Hypertrophie und gleichzeitig erhöhter RV-Drücke und RV-Hypertrophie zeigt. Die Aortendebandation in Woche 3 nach Ao...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amoxicillin	Ratiopharm	PC: 04150075615985	Antibiotic
Anti-BNP antibody	Abcam	ab239510	Western Blotting
Aquasonic 100 Ultrasound gel	Parker Laboratories	BT-025-0037L	Echocardiography consumables
Bepanthen	Bayer	6029009.00.00	Eye ointment eye ointment
Carprosol (Carprofen)	CP-Pharma	401808.00.00	Analgesic
Clip holder	Weck stainless USA	523140S	Surgical instruments
Fine scissors Tungsten carbide	Fine Science Tools	14568-12	Surgical scissors
Fine scissors Tungsten carbide	Fine Science Tools	14568-09	Surgical scissors
High-resolution imaging system	FUJIFILM VisualSonics, Amsterdam, Netherlands	VeVo 3100	Echocardiography machine. Images were acquired with pulse-wave Doppler mode, M-mode and B-mode
Isoflurane	CP-Pharma	400806.00.00	Anesthetic
Ketamine	CP-Pharma	401650.00.00	Anesthetic
Mathieu needle holder	Fine Science Tools	12010-14	Surgical instruments
Mechanical ventilator (Rodent ventilator)	UGO Basile S.R.L.	7025	Volume controlled respirator
Metal clip	Hemoclip	523735	Surgical consumables
Microscope	Leica	M651	Manual surgical microscope for microsurgical procedures
Millar Mikro-Tip pressure catheters	ADInstruments	SPR-671	Hemodynamics assessment
Moria Iris forceps	Fine Science Tools	11373-12	Surgical forceps
Noyes spring scissors	Fine Science Tools	15013-12	Surgical scissors
Povidone iodine/iodophor solution	B/Braun	16332M01	Disinfection
PowerLab	ADInstruments	4_35	Hemodynamics assessment
Prolene Suture, 4-0	Ethicon	EH7830	Surgical consumables
Rib spreader (Alm selfretaining retractor blunt, 70 mm, 2 3/4″)	Austos	AE-BV010R	Surgical instruments
Serrated Graefe forceps	Fine Science Tools	11052-10	Surgical forceps
Silk Suture, 4-0	Ethicon	K871	Surgical consumables
Skin disinfiction solution (colored)	B/Braun	19412M07	Disinfection
Spectra 360 Elektrode gel	Parker Laboratories	TB-250-0241H	Echocardiography consumables
Sponge points tissue	Sugi	REF 30601	Surgical consumables
Sprague-Dawley rat	Janvier Labs, Le Genest-Saint-Isle, France		Study animals
Tracheal cannula			Outer diameter 2 mm
Xylazin	CP-Pharma	401510.00.00	Anesthetic