Un modelo de remodelación vascular inversa en la hipertensión pulmonar debido a la enfermedad cardíaca izquierda por desbandamiento aórtico en ratas

Resumen

El presente protocolo describe un procedimiento quirúrgico para eliminar las bandas aórticas ascendentes en un modelo de rata de hipertensión pulmonar debido a una enfermedad cardíaca izquierda. Esta técnica estudia los mecanismos endógenos de remodelación inversa en la circulación pulmonar y el corazón derecho, informando así estrategias para revertir la hipertensión pulmonar y/o la disfunción ventricular derecha.

Resumen

La hipertensión pulmonar debida a la enfermedad cardíaca izquierda (PH-LHD) es la forma más común de PH, sin embargo, su fisiopatología está mal caracterizada que la hipertensión arterial pulmonar (HAP). Como resultado, faltan intervenciones terapéuticas aprobadas para el tratamiento o la prevención de la PH-LHD. Los medicamentos utilizados para tratar la HP en pacientes con HAP no se recomiendan para el tratamiento de la PH-LHD, ya que la reducción de la resistencia vascular pulmonar (PVR) y el aumento del flujo sanguíneo pulmonar en presencia de un aumento de las presiones de llenado del lado izquierdo pueden causar descompensación del corazón izquierdo y edema pulmonar. Es necesario desarrollar nuevas estrategias para revertir la HP en pacientes con LHD. A diferencia de la HAP, la PH-LHD se desarrolla debido al aumento de la carga mecánica causada por la congestión de la sangre en la circulación pulmonar durante la insuficiencia cardíaca izquierda. Clínicamente, la descarga mecánica del ventrículo izquierdo (VI) por reemplazo de la válvula aórtica en pacientes con estenosis aórtica o por implantación de dispositivos de asistencia del VI en pacientes con insuficiencia cardíaca en etapa terminal normaliza no solo las presiones arterial pulmonar y ventricular derecha (RV) sino también la PVR, proporcionando así evidencia indirecta de remodelación inversa en la vasculatura pulmonar. Utilizando un modelo de rata establecido de PH-LHD debido a la insuficiencia cardíaca izquierda desencadenada por la sobrecarga de presión con el posterior desarrollo de PH, se desarrolla un modelo para estudiar los mecanismos moleculares y celulares de este proceso fisiológico de remodelación inversa. En concreto, se realizó una cirugía de desbandado aórtico, que dio lugar a la remodelación inversa del miocardio del VI y su descarga. Paralelamente, se detectó la normalización completa de la presión sistólica de RV y la reversión significativa pero incompleta de la hipertrofia de RV. Este modelo puede presentar una herramienta valiosa para estudiar los mecanismos de remodelación inversa fisiológica en la circulación pulmonar y el RV, con el objetivo de desarrollar estrategias terapéuticas para el tratamiento de ph-LHD y otras formas de PH.

Introducción

La insuficiencia cardíaca es la principal causa de muerte en los países desarrollados y se espera que aumente en un 25% en la próxima década. La hipertensión pulmonar (HP), un aumento patológico de la presión arterial en la circulación pulmonar, afecta aproximadamente al 70% de los pacientes con insuficiencia cardíaca en etapa terminal; la Organización Mundial de la Salud clasifica la HP como hipertensión pulmonar debida a cardiopatía izquierda (PH-LHD)¹. La PH-LHD se inicia por una función sistólica y/o diastólica del ventrículo izquierdo (VI) deteriorada que resulta en una presión de llenado elevada y una congestión pasiva de la sangre en la circulación pulmonar². Aunque inicialmente reversible, la PH-LHD se fija gradualmente debido a la remodelación vascular pulmonar activa en todos los compartimentos de la circulación pulmonar, es decir, arterias, capilares y venas ^3,4. Tanto el pH reversible como el fijo aumentan la poscarga del RV, lo que inicialmente impulsa la hipertrofia miocárdica adaptativa, pero en última instancia causa dilatación del RV, hipocinesis, fibrosis y descompensación que conducen progresivamente a la falla del RV 1,2,5,6. Como tal, la HP acelera la progresión de la enfermedad en pacientes con insuficiencia cardíaca y aumenta la mortalidad, particularmente en pacientes sometidos a tratamiento quirúrgico mediante la implantación de dispositivos de asistencia ventricular izquierda (DAVI) y / o trasplante de corazón ^7,8,9. Actualmente, no existen terapias curativas que puedan revertir el proceso de remodelación vascular pulmonar, por lo que se necesita una investigación mecanicista fundamental en sistemas modelo apropiados.

Es importante destacar que los estudios clínicos muestran que la PH-LHD como complicación frecuente en pacientes con estenosis aórtica puede mejorar rápidamente en el período postoperatorio temprano después del reemplazo de la válvula aórtica¹⁰. Análogamente, la resistencia vascular pulmonar (PVR) preoperatoria alta (>3 unidades de madera) que, sin embargo, era reversible con nitroprusiato se normalizó de manera sostenible después del trasplante de corazón en un estudio de seguimiento de 5 años¹¹. Del mismo modo, una reducción adecuada de la PVR reversible y fija y la mejora de la función de RV en pacientes con LHD podrían realizarse en varios meses mediante la descarga del ventrículo izquierdo mediante dispositivos de asistencia ventricular pulsátiles y no pulsátiles implantables 12,13,14. Actualmente, los mecanismos celulares y moleculares que impulsan la remodelación inversa en la circulación pulmonar y el miocardio RV no están claros. Sin embargo, su comprensión puede proporcionar información importante sobre las vías fisiológicas que pueden explotarse terapéuticamente para revertir la remodelación vascular pulmonar y de RV en PH-LHD y otras formas de PH.

Se puede utilizar un modelo preclínico adecuado que replique adecuadamente las características fisiopatológicas y moleculares de PH-LHD para estudios traslacionales en insuficiencia cardíaca congestiva inducida por sobrecarga de presión debido a bandas aórticas quirúrgicas (AoB) en ratas ^4,15,16. En comparación con una insuficiencia cardíaca similar debido a la sobrecarga de presión en el modelo murino de constricción aórtica transversa (TAC)¹⁷, la banda de la aorta ascendente por encima de la raíz aórtica en ratas AoB no produce hipertensión en la arteria carótida izquierda ya que el sitio de banda es proximal de la salida de la arteria carótida izquierda de la aorta. Como resultado, AoB no causa lesión neuronal del lado izquierdo en la corteza como es característico de TAC¹⁸, y que puede afectar el resultado del estudio. En comparación con otros modelos de roedores de PH-LHD inducida quirúrgicamente, los modelos de rata en general, y AoB en particular, demuestran ser más robustos, reproducibles y replican la remodelación de la circulación pulmonar característica para los pacientes con PH-LHD. Al mismo tiempo, la letalidad perioperatoria es baja¹⁹. El aumento de las presiones del VI y la disfunción del VI en ratas AoB inducen el desarrollo de PH-LHD, lo que resulta en presiones elevadas de RV y remodelación de RV. Como tal, el modelo de rata AoB ha demostrado ser extremadamente útil en una serie de estudios previos realizados por grupos independientes, incluyéndonos a nosotros mismos, para identificar mecanismos de remodelación vascular pulmonar y probar posibles estrategias de tratamiento para PH-LHD ^{4,15,20,21,22,23,24,25}.

En el presente estudio, el modelo de rata AoB se utilizó para establecer un procedimiento quirúrgico de desbandado aórtico para estudiar los mecanismos de remodelación inversa en la vasculatura pulmonar y el RV. Anteriormente, se han desarrollado modelos de remodelación inversa miocárdica como la desbanda aórtica en ratones²⁶ y ratas²⁷ para investigar los mecanismos celulares y moleculares que regulan la regresión de la hipertrofia ventricular izquierda y probar posibles opciones terapéuticas para promover el miocardio. recuperación. Además, un número limitado de estudios anteriores han explorado los efectos de la desbandación aórtica sobre la HP-LHD en ratas y mostraron que la desbandación aórtica podría revertir la hipertrofia medial en las arteriolas pulmonares, normalizar la expresión de pre-pro-endotelina 1 y mejorar la hemodinámica pulmonar^27,28, proporcionando evidencia de la reversibilidad de la HP en ratas con insuficiencia cardíaca. Aquí, los procedimientos técnicos de la cirugía de desbandado se optimizan y estandarizan, por ejemplo, mediante la aplicación de una traqueotomía en lugar de la intubación endotraqueal o mediante el uso de clips de titanio de un diámetro interno definido para bandas aórticas en lugar de suturas de polipropileno con una aguja roma^26,27, proporcionando así un mejor control de los procedimientos quirúrgicos, una mayor reproducibilidad del modelo y una mejor tasa de supervivencia.

Desde una perspectiva científica, la importancia del modelo de desbandado PH-LHD no radica únicamente en demostrar la reversibilidad del fenotipo cardiovascular y pulmonar en la insuficiencia cardíaca, sino más importante aún, en la identificación de impulsores moleculares que desencadenan y / o sostienen la remodelación inversa en las arterias pulmonares como candidatos prometedores para la futura orientación terapéutica.

Protocolo

Todos los procedimientos se realizaron siguiendo la "Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio" (Instituto de Recursos de Animales de Laboratorio, 8ª edición 2011) y aprobados por el comité gubernamental local de cuidado y uso de animales de la Oficina Estatal Alemana de Salud y Asuntos Sociales (Landesamt für Gesundheit und Soziales (LaGeSO), Berlín; protocolo no. G0030/18). En primer lugar, la insuficiencia cardíaca congestiva se indujo quirúrgicamente en ratas Sprague-Dawley juveniles ~ 100 g de peso corporal (bw) (ver Tabla de Materiales) mediante la colocación de un clip de titanio con un diámetro interno de 0,8 mm en la aorta ascendente (banda aórtica, AoB) como se describió anteriormente^29,30. En la semana 3 después de AoB (Figura 1), se realizó una cirugía de desbandado (Deb) para extraer el clip de la aorta. Los procedimientos quirúrgicos y la validación de la reversión del pH en ratas AoB realizados se representan esquemáticamente en la Figura 1.

1. Preparaciones quirúrgicas

1. Esterilizar los instrumentos quirúrgicos requeridos (Figura 2) en autoclave.
2. Inyecte carprofeno a la rata (5 mg/kg de peso corporal) (ver Tabla de materiales) por vía intraperitoneal (i.p.) para analgesia 30 min antes de la cirugía.
3. Anestesiar a la rata mediante inyección i.p. de ketamina (87 mg/kg de peso corporal) y xilazina (13 mg/kg de peso corporal).
4. Retire el pelo del escote y el pecho del animal con una afeitadora eléctrica.
5. Aplique una gota de ungüento para los ojos para proteger los ojos durante la cirugía.
6. Coloque la rata en posición supina sobre una mesa quirúrgica esterilizada. Fije cuidadosamente el abdomen y las extremidades del animal con cinta adhesiva.
   NOTA: Para mantener la temperatura corporal, coloque una estera calefactora de 37 °C debajo de la mesa quirúrgica. Evite el calentamiento de la región de la cabeza para evitar la sequedad de los ojos.
7. Desinfecte la piel de los animales con solución de povidona-yodo/yodóforo. Tenga en cuenta las cicatrices y suturas de la cirugía primaria de AoB y cubra el campo quirúrgico.
8. Asegurar la profundidad adecuada de la anestesia mediante el pellizco de los dedos de los pies.
   NOTA: La profundidad de la anestesia debe controlarse regularmente durante la cirugía.

2. Traqueotomía y ventilación mecánica

NOTA: Durante toda la cirugía, cámbiese los guantes después de manipular equipos no estériles.

1. Con tijeras finas (Figura 2A), haga una incisión en la línea media cervical de 7-10 mm de largo (Figura 3A).
2. Con la ayuda de un par de fórceps contundentes (Figura 2B'), diseccionar el tejido blando cervical para exponer los músculos infrahioides. Divida los músculos en la línea media para visualizar la tráquea. Cortar y retirar la sutura de la cirugía primaria de AoB.
3. Haga una incisión de tráquea de ~ 2 mm entre dos anillos cartilaginosos usando tijeras de resorte Noyes en ángulo (Figura 2C, 3B). Inserte la cánula traqueal de diámetro exterior de 2 mm (Figura 2D) en la tráquea y asegúrela con una sutura de seda 4-0 (Figura 2E, 3C).
4. Conecte la cánula traqueal a un ventilador mecánico (consulte la Tabla de materiales) manteniendo el espacio muerto al mínimo (Figura 3D-E). Mantenga la ventilación pulmonar perioperatoria a una frecuencia respiratoria de 90 respiraciones/min a un volumen corriente (Vt) de 8,5 ml/kg de peso corporal.

3. Desbandado aórtico

1. Haga una incisión en la piel de ~ 20 mm de largo entre la segunda y la tercera costilla con tijeras finas (Figura 3F).
2. Con la ayuda de tijeras quirúrgicas más pequeñas (Figura 2F), extienda cuidadosamente los músculos y córtelos capa por capa (Figura 3G). Haga una incisión lateral de 10 mm a lo largo del espacio intercostal entre la segunda y la tercera costilla.
   NOTA: La línea media debe abordarse cuidadosamente para evitar el sangrado.
3. Utilice un esparcidor de costillas (Figura 2G) para expandir el espacio intercostal entre la segunda y la tercera costilla para crear una ventana quirúrgica (Figura 3H).
4. Con la ayuda de fórceps contundentes (Figura 2B, B'), separe cuidadosamente el timo del corazón y las arterias del conducto para visualizar la aorta con el clip (Figura 4A).
5. Sostenga el clip con la ayuda de las pinzas y retire cuidadosamente el tejido conectivo alrededor del clip para exponerlo.
   NOTA: Evite sostener o levantar la aorta con las fórceps, ya que puede lesionar la aorta, lo que resulta en sangrado y un resultado letal.
6. Con la ayuda de un soporte de aguja (Figura 2H), abra el clip (Figura 4B) y retírelo de la cavidad torácica.
7. Antes de cerrar el tórax, abra la atelectasia pulmonar, asegure un reclutamiento pulmonar adecuado sin sobredistensión, continúe la ventilación mecánica con una Vt de 9,5 mL/kg de peso corporal durante otros 10 min, y vuelva a una Vt de 8,5 mL/kg de peso corporal para reclutar los pulmones y resolver un posible neumotórax.
8. Cierre los músculos profundos con una simple sutura interrumpida con seda 4-0. Luego conecte los músculos superiores y la piel con una sutura continua simple (Figura 5A, B).

4. Extubación traqueal

1. Desconecte la cánula traqueal de la máquina de ventilación. Observe atentamente a la rata hasta que se restablezca la respiración espontánea. Si el animal no respira espontáneamente al desconectarse, vuelva a conectar el ventilador y continúe ventilando durante 5 minutos adicionales. A continuación, repita el procedimiento.
2. Después de restablecer la respiración espontánea, retire la cánula de la tráquea y limpie el líquido alrededor de la tráquea con puntos de esponja (Figura 2I) (ver Tabla de Materiales).
3. Cierre la tráquea con una sutura simple usando proleno 6-0 (Figura 2E' y Figura 5C). Luego cierre los músculos infrahioides en una sutura interrumpida simple usando seda 4-0 (Figura 5D), y conecte la piel en una sutura continua simple (Figura 5E). Limpie y desinfecte los músculos y la piel durante el proceso con la solución de povidona-yodo/yodóforo.

5. Cuidados postoperatorios

1. Después de completar el procedimiento quirúrgico, mueva cuidadosamente al animal a una jaula de recuperación con oxígeno suplementario y una lámpara infrarroja para mantener a los animales calientes y suficientemente oxigenados durante la fase de recuperación. Coloque la máscara de oxígeno cerca del hocico de la rata. Solo mantenga un animal por jaula de recuperación en cualquier momento.
2. Después de que el animal se despierte, muévalo con cuidado a una jaula regular provista de agua y comida. Durante las siguientes 12 h, controle el estado sanitario del animal operado en intervalos de 2 h.
3. Después de completar el procedimiento quirúrgico, aplique analgesia diariamente mediante inyección i.p. de carprofeno (5 mg/kg de peso corporal) durante una semana.
4. Para evitar la infección bacteriana, administre amoxicilina (500 mg/L) en el agua potable durante una semana después de la operación.

Resultados

En primer lugar, se confirmó el éxito de la desbandación aórtica mediante ecocardiografía transtorácica realizada antes y después del procedimiento de desbandado en animales AoB (Figura 6). Con este fin, se evaluó el arco aórtico en la vista de modo B del eje largo paraesternal (PLAX). Se visualizó la posición del clip en la aorta ascendente en animales AoB y su ausencia después de la cirugía Deb (Figura 6A,B). A continuación, se e...

Discusión

Aquí, se informa una técnica quirúrgica detallada para la desbandación aórtica en un modelo AoB de rata que se puede utilizar para investigar la reversibilidad de PH-LHD y los mecanismos celulares y moleculares que impulsan la remodelación inversa en la vasculatura pulmonar y el RV. Tres semanas de constricción aórtica en ratas juveniles dan como resultado ph-LHD evidente como aumento de las presiones del VI, hipertrofia del VI y concomitantemente aumento de las presiones de RV e hipertrofia de RV. La desbandaci?...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amoxicillin	Ratiopharm	PC: 04150075615985	Antibiotic
Anti-BNP antibody	Abcam	ab239510	Western Blotting
Aquasonic 100 Ultrasound gel	Parker Laboratories	BT-025-0037L	Echocardiography consumables
Bepanthen	Bayer	6029009.00.00	Eye ointment eye ointment
Carprosol (Carprofen)	CP-Pharma	401808.00.00	Analgesic
Clip holder	Weck stainless USA	523140S	Surgical instruments
Fine scissors Tungsten carbide	Fine Science Tools	14568-12	Surgical scissors
Fine scissors Tungsten carbide	Fine Science Tools	14568-09	Surgical scissors
High-resolution imaging system	FUJIFILM VisualSonics, Amsterdam, Netherlands	VeVo 3100	Echocardiography machine. Images were acquired with pulse-wave Doppler mode, M-mode and B-mode
Isoflurane	CP-Pharma	400806.00.00	Anesthetic
Ketamine	CP-Pharma	401650.00.00	Anesthetic
Mathieu needle holder	Fine Science Tools	12010-14	Surgical instruments
Mechanical ventilator (Rodent ventilator)	UGO Basile S.R.L.	7025	Volume controlled respirator
Metal clip	Hemoclip	523735	Surgical consumables
Microscope	Leica	M651	Manual surgical microscope for microsurgical procedures
Millar Mikro-Tip pressure catheters	ADInstruments	SPR-671	Hemodynamics assessment
Moria Iris forceps	Fine Science Tools	11373-12	Surgical forceps
Noyes spring scissors	Fine Science Tools	15013-12	Surgical scissors
Povidone iodine/iodophor solution	B/Braun	16332M01	Disinfection
PowerLab	ADInstruments	4_35	Hemodynamics assessment
Prolene Suture, 4-0	Ethicon	EH7830	Surgical consumables
Rib spreader (Alm selfretaining retractor blunt, 70 mm, 2 3/4″)	Austos	AE-BV010R	Surgical instruments
Serrated Graefe forceps	Fine Science Tools	11052-10	Surgical forceps
Silk Suture, 4-0	Ethicon	K871	Surgical consumables
Skin disinfiction solution (colored)	B/Braun	19412M07	Disinfection
Spectra 360 Elektrode gel	Parker Laboratories	TB-250-0241H	Echocardiography consumables
Sponge points tissue	Sugi	REF 30601	Surgical consumables
Sprague-Dawley rat	Janvier Labs, Le Genest-Saint-Isle, France		Study animals
Tracheal cannula			Outer diameter 2 mm
Xylazin	CP-Pharma	401510.00.00	Anesthetic