藏族小型猪射血分数保留的心力衰竭手术模型

摘要

本方案描述了使用降主动脉收缩建立射血分数保留的心力衰竭迷你猪模型的分步程序。还介绍了评估该疾病模型的心脏形态学、组织学和功能的方法。

摘要

全球超过一半的心力衰竭 （HF） 病例被归类为射血分数保留心力衰竭 （HFpEF）。大型动物模型在研究HFpEF的基本机制和确定潜在的治疗靶点方面受到限制。本工作详细介绍了藏族小型猪降主动脉收缩（DAC）的外科手术过程，以建立HFpEF的大型动物模型。该模型使用精确控制的降主动脉收缩来诱导左心室的慢性压力超负荷。超声心动图用于评估心脏的形态学和功能变化。DAC应激12周后，室间隔肥厚，但后壁厚度明显减少，伴有左心室扩张。然而，在 12 周期间，模型心脏的左心室射血分数保持在 >50%。此外，DAC模型显示心脏损伤，包括纤维化、炎症和心肌细胞肥大。DAC组的心力衰竭标志物水平显著升高。这种 DAC 诱导的小型猪 HFpEF 是研究这种疾病的分子机制和临床前测试的有力工具。

引言

射血分数保留的心力衰竭 （HFpEF） 占心力衰竭病例的一半以上，并已成为全球公共卫生问题¹。临床观察表明 HFpEF 的几个关键特征:（1） 心室舒张功能障碍，伴有收缩刚度增加，（2） 静息时射血分数正常，运动表现受损，以及 （3） 心脏重塑².提出的机制包括激素失调、全身性微血管炎症、代谢紊乱以及肌节和细胞外基质蛋白的异常³。然而，实验研究表明，射血分数降低的心力衰竭 （HFrEF） 会导致这些改变。临床研究探讨了血管紧张素受体抑制剂和药物治疗 HFpEF^{中 HFrEF 的}治疗效果 ^4,5。然而，需要独特的HFpEF治疗方法。与了解临床症状相比，HFpEF在病理学、生物化学和分子生物学方面的改变仍然不明确。

已经开发了 HFpEF 的动物模型来探索其机制、诊断标志物和治疗方法。实验动物，包括猪、狗、大鼠和小鼠，可发生HFpEF，并选择高血压、糖尿病和衰老等多种危险因素作为诱导因素^6,7。例如，单独使用醋酸脱氧皮质酮或与高脂肪/高糖饮食联合使用可诱导猪的 HFpEF ^8,9。心室压力超负荷是另一种用于在大型和小型动物模型中开发 HFpEF^{的技术 10}。此外，近年来，各大洲都采用了特定的EF临界值来定义HFpEF，如欧洲心脏病学会指南、美国心脏病学会基金会/美国心脏协会¹¹、日本循环学会/日本心力衰竭学会¹²所示。因此，如果采用临床标准，许多先前建立的模型可能适用于 HFpEF 研究。例如，Youselfi等人声称转基因小鼠品系Col4a3-/-是一种有效的HFpEF模型。该菌株出现典型的 HFpEF 心脏症状，例如舒张功能障碍、线粒体功能障碍和心脏重塑¹³。之前的一项研究使用高能量饮食在老年猴子¹⁴ 中诱导具有中等 EF 的心脏重塑，其特征是代谢紊乱、纤维化和心肌中肌动球蛋白 MgATP 酶减少。小鼠横主动脉收缩 （TAC） 是模拟高血压诱导的室性心肌病最广泛使用的模型之一。左心室从向心性肥大（EF升高）进展为扩张性重塑（EF^降低15.16）。这两个典型阶段之间的过渡表型表明，主动脉收缩技术可用于研究 HFpEF。

猪 HFpEF 模型的病理特征、细胞信号转导和 mRNA 谱之前已发表¹⁷。在这里，提出了建立该模型的分步方案以及评估该模型表型的方法。该过程如 图 1 所示。简而言之，手术计划由主要研究者、外科医生、实验室技术人员和动物护理人员共同制定。这些迷你猪接受了健康检查，包括生化测试和超声心动图检查。手术后，进行了抗炎和镇痛手术。超声心动图、组织学检查和生物标志物用于评估表型。

研究方案

所有动物研究均获得广东省实验动物监测所机构动物护理和使用委员会的批准（批准号。IACUC2017009）。所有动物实验均按照《实验动物护理和使用指南》（第 8 版，2011 年，美国国家科学院）进行。这些动物被安置在广东省实验动物监测研究所（许可证号）AAALAC认可的设施中。SYXK （YUE） 2016-0122， 中国）。使用6只雄性藏族迷你猪（假猪组和DAC组各n=3头，体重25-30公斤）开发HFpEF模型。

1. 动物和器械准备

1. 手术前使动物适应设施 14 天。
2. 手术前进行健康检查，包括生化检查和超声心动图检查。根据T/CALAS85-2020《实验动物-大型实验动物心脏、肝脏、肾脏和大脑等主要器官健康评估指南》（中国实验动物科学协会），排除心脏结构（心室扩张或肥大）和功能（EF<50%）异常的动物。
3. 在麻醉前禁食动物超过12小时，在手术当天不要喂食。
4. 准备手术室和设备（图2）。检查麻醉呼吸机站、兽医和患者监护仪、兽医超声系统、吸气器和其他手术设备。高压灭菌剪刀、镊子、牵开器、手术刀柄、吸头、手术针等（见 材料表）。

2.镇静、气管插管、静脉插管

1. 称量动物的重量并计算麻醉药物。用1mg / kg佐利地尔注射液（注射用替利他明和唑拉西泮）和0.5mg / kg盐酸甲苯噻嗪注射液镇静小型猪（见 材料表）。
2. 约束并将迷你猪放在手术台上的右侧侧卧位置。打开加热系统以保持动物的体温。
3. 进行超声心动图检查（第 5 步）并收集 2 mL 血样。
4. 用连接到兽医麻醉呼吸机站的气管插管插管微型猪（图3A）（见 材料表）。
5. 以 8 mL/kg 潮气量和 30 次/分钟呼吸开始通气。在外科手术过程中，用1.5%-2.5%的异氟烷维持动物。
6. 使用来自耳静脉（通常是边缘耳静脉，图3B）的外周静脉导管（26G）（参见材料表）建立静脉插管。
7. 将动物连接到兽医监视器。

3. 外科手术

1. 剃掉左胸区域。施用0.7%的碘和75%的酒精，无菌地准备从肩胛骨到隔膜的皮肤（图3C）。
2. 将无菌窗帘放在手术区域。
3. 通过静脉注射给予丙泊酚（5mg / kg）（见 材料表）以维持全身麻醉。
4. 在用电烙术切开皮肤之前，沿着第 4 肋间隙标记切口（~15 厘米长）。
5. 使用烧灼术和肌肉和结缔组织的钝性解剖相结合打开胸部。手术过程中使用抽吸器排出血液。
6. 使用肋骨牵开器展开肋骨（图3D）。
7. 定位胸降主动脉段并确定收缩部位（图3E）。使用两个 3-0 手术缝合线绕该节段两次（图 3F）。在缝合线和主动脉之间放置三层医用纱布，以避免缝合线对组织造成损伤。
8. 设置压力测量单位以确定收缩程度（图3F-H）。
   注意: 该装置包括一根刺穿血管壁的导管、连接管、压力传感器和患者监护仪。
9. 逐渐收紧降主动脉段周围的手术缝合线，以达到所需的收缩程度。让压力读数稳定 20 分钟并永久收紧手术结。
10. 使用胸腔引流管排出胸腔内的空气和多余的液体。
11. 分层闭合胸壁，用可吸收缝合线近似肋骨和分割的肌肉。
12. 检查是否有出血，确保止血良好。
13. 术后将一瓶苄基青霉素（800,000单位）（见 材料表）涂抹在手术区域。
14. 监测动物是否存在眨眼和肢体运动。断开呼吸机，但离开气管插管。监测自主呼吸的存在。
15. 将动物放回饲养室，让它自动唤醒。

4. 术后护理

1. 每天施用苄基青霉素 1 周 （20,000 U/kg）。
2. 每天施用 1 mg/kg 氟尼辛葡甲胺（见 材料表），持续 1 周。
   注意:阿片类药物和非甾体抗炎药镇痛药应在术中和术后给药。

5. 经胸超声心动图

1. 用 1 mg/kg zoletil 镇静动物。
2. 将动物放在带有帆布盖的移动约束装置中。
   注意:移动约束装置（见 材料表）有四个孔，旨在伸展动物的前肢和后肢。
3. 剃掉动物的左胸。
4. 将手指放在胸部的左中央，感受心尖脉搏。将超声波凝胶涂抹在周围区域。
5. 将超声系统的相控阵换能器 （3-8 Hz） 放置在第三个肋间隙。将换能器向前或向后移动并调整缺口角度。
6. 识别心房、心室和主动脉。记录 B 模式和 M 模式胸骨旁长轴图像。
   注意:B 模式图像表示左心室在肌水平的横截面，M 模式图像显示左心室随时间的运动。
7. 将换能器头顺时针旋转 90° 以获得胸骨旁短轴视图。识别左心室、右心室和肌。记录 B 模式和 M 模式图像。
8. 使用超声系统制造商提供的工作站来评估心脏结构和功能。

结果

超声心动图
在第 0、2、4、6、8、10 和 12 周评估心脏结构和功能。胸骨旁短轴视图的 B 模式和 M 模式记录显示在图 4A 中。超声心动图测量包括室间隔厚度（VST）、后壁厚度（PWT）和左心室内部尺寸（LVID）。在观察期间，DAC心脏中舒张末期的VST增加，而舒张末期的PWT增加然后减少，这表明DAC迷你猪的左心室中存在肥厚重塑（图4B，C?...

讨论

本研究利用DAC技术建立了藏小型猪的HFpEF模型。本文介绍了动物和器械的分步制备方案，包括镇静、气管插管、静脉插管、外科手术和术后护理。此外，还介绍了超声心动图B型和M型心脏图像的记录技术。DAC 后，心脏在第 4 周和第 6 周出现左心室肥厚，第 8 周后出现扩张。LVEF 在 12 周期间得以保存。在DAC心脏中观察到纤维化和炎症。

开胸手术和主动脉收缩的结合已被用于开?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbable surgical suture	Putong Jinhua Medical Co. Ltd, China	4-0
Aesthesia ventilator station	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd, China	WATO EX-35vet
Aspirator	Shanghai Baojia Medical Apparatus Co., Ltd, China	YX930D
Benzylpenicillin	Sichuan Pharmaceutical. INC, China	H5021738
Disposal endotracheal tube with cuff	Shenzhen Verybio Co., Ltd, China	20 cm, ID 0.9
Disposal transducer	Guangdong Baihe Medical Technology Co., Ltd, China
Dissection blade	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd, China
Electrocautery	Shanghai Hutong Medical Instruments (Group) Co., Ltd, China	GD350-B
Enzyme-linked immunosorbent assay ELISA kit	Cusabio Biotech Co., Ltd, China	CSB-E08594r
Eosin	Sigma-Aldrich Corp.	E4009
Flunixin meglumine	Shanghai Tongren Pharmaceutical Co., Ltd., China	Shouyaozi(2012)-090242103
Forceps	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China
Hematoxylin	Sigma-Aldrich Corp.	H3136
Isoflurane	RWD Life Science Co., Ltd, China	Veteasy for animals
Laryngoscope	Taixing Simeite Medical Apparatus and Instruments Limited Co., Ltd, China	For adults
LED surgical lights	Mingtai Medical Group, China	ZF700
Microplate reader	Thermo Fisher Scientific, USA	Multiskan FC
Microscope	Leica, Germany	DM2500
Mobile restraint unit	Customized	N/A	A mobile restraint unit, made by metal frame and wheels, with a canvas cover
Oxygen	Local suppliers, Guangzhou, China
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich Corp.	V900894
Patient monitor	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Company, China	Beneview T5
Peripheral Intravenous (IV) Catheter	Shenzhen Yima Pet Industry Development Co., Ltd., China	26G X 16 mm
Propofol	Guangdong Jiabo Phamaceutical Co., Ltd.	H20051842
Rib retractor	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China
Ruler	Deli Manufacturing Company, China
Scalpel handles	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China
Scissors (g)	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China
Suture	Medtronic-Coviden Corp.	3-0, 4-0
Ultrasonic gel	Tianjin Xiyuansi Production Institute, China	TM-100
Veterinary monitor	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Company, China	ePM12M Vet
Veterinary ultrasound system	Esatoe, Italy	MyLab30	Equiped with phased array transducer (3-8 Hz)
Xylazine hydrochloride injection	Shenda Animal Phamarceutical Co., Ltd., China	Shouyaozi(2016)-07003
Zoletil injection	Virbac, France	Zoletil 50	Tiletamine and zolazepam for injection