Хирургическая модель сердечной недостаточности с сохраненной фракцией выброса у тибетских минипигов

Резюме

В настоящем протоколе описана пошаговая процедура создания минипиговой модели сердечной недостаточности с сохраненной фракцией выброса с использованием сужения нисходящей аорты. Также представлены методы оценки морфологии, гистологии и функции данной модели заболевания.

Аннотация

Более половины случаев сердечной недостаточности (СН) во всем мире классифицируются как сердечная недостаточность с сохраненной фракцией выброса (СНпФВ). Модели крупных животных ограничены для изучения фундаментальных механизмов СНпФВ и определения потенциальных терапевтических мишеней. В данной работе представлено подробное описание хирургической процедуры сужения нисходящей аорты (DAC) у тибетских минипигов для создания модели HFpEF крупного животного. В этой модели использовалось точно контролируемое сужение нисходящей аорты, чтобы вызвать хроническую перегрузку давлением в левом желудочке. Эхокардиография использовалась для оценки морфологических и функциональных изменений в сердце. После 12 недель нагрузки DAC межжелудочковая перегородка была гипертрофирована, но толщина задней стенки значительно уменьшилась, что сопровождалось расширением левого желудочка. Тем не менее, фракция выброса ЛЖ у модельных сердец поддерживалась на уровне >50% в течение 12-недельного периода. Кроме того, модель DAC показала повреждение сердца, включая фиброз, воспаление и гипертрофию кардиомиоцитов. Уровни маркеров сердечной недостаточности были значительно повышены в группе DAC. Этот ДАК-индуцированный HFpEF у минипигов является мощным инструментом для изучения молекулярных механизмов этого заболевания и для доклинических испытаний.

Введение

Сердечная недостаточность с сохраненной фракцией выброса (HFpEF) составляет более половины случаев сердечной недостаточности и стала проблемой общественного здравоохранения^во всем мире1. Клинические наблюдения выявили несколько критических особенностей СНпФВ: (1) желудочковую диастолическую дисфункцию, сопровождающуюся повышением систолической ригидности, (2) нормальную фракцию выброса в покое с нарушением физической активности и (3) ремоделирование сердца². Предложенные механизмы включают гормональную дисрегуляцию, системное микрососудистое воспаление, метаболические нарушения и аномалии в белках саркомерного и внеклеточного матрикса³. Однако экспериментальные исследования показали, что сердечная недостаточность со сниженной фракцией выброса (HFrEF) вызывает эти изменения. В клинических исследованиях изучены терапевтические эффекты ингибиторов рецепторов ангиотензина и препаратов для лечения СНрФВ при СНпФВ ^4,5. Тем не менее, необходимы уникальные терапевтические подходы к лечению СНпФВ. По сравнению с пониманием клинических симптомов, изменения в патологии, биохимии и молекулярной биологии СНпФВ остаются плохо определенными.

Для изучения механизмов, диагностических маркеров и терапевтических подходов были разработаны животные модели СНпФВ. Лабораторные животные, включая свиней, собак, крыс и мышей, могут развиться СНпФВ, и в ^{качестве факторов} индукции были выбраны различные факторы риска, включая артериальную гипертензию, сахарный диабет и старение. Например, дезоксикортикостерона ацетат в отдельности или в сочетании с диетой с высоким содержанием жиров/сахара индуцирует СНпФВ у свиней ^8,9. Перегрузка желудочковым давлением является еще одним методом, используемым для развития СНпФВ на моделях крупных и мелких животных¹⁰. Кроме того, в последние годы на разных континентах были приняты конкретные пороговые значения ФВ для определения СНпФВ, как видно из рекомендаций Европейского общества кардиологов, Фонда Американского колледжа кардиологов/Американской кардиологической ассоциации¹¹, Японского общества кровообращения/Японского общества сердечной недостаточности¹². Таким образом, многие ранее созданные модели могут стать подходящими для исследований СНпФВ, если будут приняты клинические критерии. Например, Youselfi et al. утверждали, что генетически модифицированная линия мышей Col4a3-/-, является эффективной моделью HFpEF. У этого штамма развились типичные сердечные симптомы HFpEF, такие как диастолическая дисфункция, митохондриальная дисфункция и ремоделирование сердца¹³. В предыдущем исследовании использовалась высокоэнергетическая диета для индуцирования сердечного ремоделирования со средним диапазоном ФВ у пожилых обезьян¹⁴, характеризующегося нарушением обмена веществ, фиброзом и снижением актомиозина MgATPase в миокарде. Поперечное сужение аорты у мышей (TAC) является одной из наиболее широко используемых моделей для имитации гипертоничевидной кардиомиопатии. Левый желудочек прогрессирует от концентрической гипертрофии с повышением ФВ до расширенного ремоделирования со снижением ФВ^15,16. Переходные фенотипы между этими двумя типичными стадиями позволяют предположить, что техника сужения аорты может быть использована для изучения СНпФВ.

Патологические особенности, клеточная сигнализация и профили мРНК модели HFpEF свиньи были опубликованы ранее¹⁷. Здесь представлен пошаговый протокол создания этой модели и подходы к оценке фенотипов этой модели. Процедура проиллюстрирована на рисунке 1. Вкратце, план операции был составлен совместно главным исследователем, хирургами, лаборантами и персоналом по уходу за животными. Минипиги прошли медицинское обследование, включая биохимические анализы и эхокардиографию. После операции были проведены противовоспалительные и обезболивающие процедуры. Для оценки фенотипов использовали эхокардиографию, гистологическое исследование и биомаркеры.

протокол

Все исследования на животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Гуандунского института мониторинга лабораторных животных (разрешение No 1). IACUC2017009). Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Руководством по уходу за лабораторными животными и их использованию (8-е изд., 2011 г., Национальные академии, США). Животные содержались в учреждении, аккредитованном AAALAC, в Гуандунском институте мониторинга лабораторных животных (лицензия No 1). SYXK (YUE) 2016-0122, Китай). Для разработки модели HFpEF были использованы шесть тибетцев-минипигов (n = 3 для бутафорской группы и DAC-группы, весом 25-30 кг).

1. Подготовка животных и инструментов

1. Акклиматизируйте животных в учреждении за 14 дней до операции.
2. Перед операцией проведите медицинское обследование, включая биохимические анализы и эхокардиографию. Исключить животных с нарушениями структуры сердца (дилатация желудочков или гипертрофия) и функции (ФВ <50%) в соответствии с T/CALAS85-2020 Лабораторные животные - Рекомендации по оценке здоровья основных органов, таких как сердце, печень, почки и мозг крупных лабораторных животных (Китайская ассоциация лабораторных животных, Китай).
3. Голодайте животных более 12 часов до анестезии, не кормя их в день операции.
4. Подготовьте операционную комнату и приборы (рис. 2). Проверьте аппарат искусственной вентиляции легких, ветеринарные мониторы и мониторы пациента, ветеринарную ультразвуковую систему, аспиратор и другие хирургические устройства. Автоклавируйте ножницы, щипцы, ретракторы, ручки скальпеля, головку аспиратора, хирургические иглы и т.д. (см. Таблицу материалов).

2. Седация, интубация трахеи и канюляция вен

1. Взвесьте животных и рассчитайте обезболивающие препараты. Вводите минипигам 1 мг/кг золетила для инъекций (тилетамин и золазепам для инъекций) и 0,5 мг/кг ксилазина гидрохлорида для инъекций (см. таблицу материалов).
2. Пристегните и поместите минипиги в правое боковое лежачее положение на операционном столе. Включите систему отопления для поддержания температуры тела животных.
3. Выполните эхокардиографию (шаг 5) и соберите 2 мл образцов крови.
4. Интубируйте минипигов с помощью эндотрахеальной трубки, подключенной к ветеринарному наркозному аппарату искусственной вентиляции легких (Рисунок 3A) (см. Таблицу материалов).
5. Начните вентиляцию легких при объеме 8 мл/кг дыхательного пространства и 30 вдохов/мин. Поддерживайте животных 1,5%-2,5% изофлурана во время хирургического вмешательства.
6. Установите внутривенную канюляцию с помощью периферического внутривенного катетера (26 G) (см. таблицу материалов) из ушной вены (обычно краевой ушной вены, рисунок 3B).
7. Подключите животное к ветеринарному монитору.

3. Хирургическое вмешательство

1. Побрейте левую грудную область. Нанесите 0,7% йода и 75% спирта, чтобы асептически подготовить кожу от лопатки до диафрагмы (рисунок 3C).
2. Наложите стерильные простыни на операционную область.
3. Вводят пропофол (5 мг/кг) (см. таблицу материалов) внутривенно для поддержания общей анестезии.
4. Отметьте разрез (длиной ~15 см) вдоль 4-го межреберья перед разрезом кожи с помощью электрокоагуляции.
5. Вскрывают грудную клетку, используя комбинацию прижигания и тупого рассечения мышцы и соединительной ткани. Используйте аспиратор для удаления крови во время операции.
6. Используйте втягивающее ребро, чтобы раздвинуть ребра (рис. 3D).
7. Найдите грудной нисходящий сегмент аорты и определите место сужения (рис. 3E). Используйте два хирургических шва 3-0, чтобы дважды обхватить сегмент (Рисунок 3F). Поместите три слоя медицинской марли между швом и аортой, чтобы избежать повреждения тканей швами.
8. Настройте единицы измерения давления для определения степени сужения (рис. 3F-H).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Устройство включает в себя катетер, который прокалывает стенку сосуда, соединительную трубку, датчик давления и монитор пациента.
9. Постепенно затягивайте хирургический шов, окружающий нисходящий сегмент аорты, чтобы достичь желаемой степени сужения. Подождите, пока показания давления стабилизируются в течение 20 минут, и надолго затяните хирургические узлы.
10. Используйте дренажную плевральную дренажную трубку для удаления воздуха и лишней жидкости из грудной полости.
11. Послойно закрывают грудную стенку, ребра и разделенные мышцы рассасывающимися швами.
12. Проверьте, нет ли кровотечений и обеспечьте хороший гемостаз.
13. Нанесите флакон бензилпенициллина (800 000 единиц) (см. Таблицу материалов) на операционную область после операции.
14. Следите за наличием моргания глаз и движения конечностей животного. Отключите аппарат искусственной вентиляции легких, но оставьте эндотрахеальную трубку. Следите за наличием спонтанного дыхания.
15. Верните животное в комнату для содержания и дайте ему автоматически проснуться.

4. Послеоперационный уход

1. Применяйте бензилпенициллин ежедневно в течение 1 недели (20 000 ЕД/кг).
2. Применяют 1 мг/кг флуниксина меглумина (см. таблицу материалов) ежедневно в течение 1 недели.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Опиоидные и НПВП-анальгетики следует назначать во время и после операции.

5. Трансторакальная эхокардиография

1. Успокойте животное 1 мг/кг золетила.
2. Поместите животное в передвижную удерживающую установку с брезентовым чехлом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Передвижной удерживающий блок (см. Таблицу материалов) имеет четыре отверстия, предназначенные для выдвижения передних и задних конечностей животного.
3. Побрейте левую грудь животного.
4. Положите пальцы на левый центр грудной клетки, чтобы прощупать апикальный пульс. Нанесите ультразвуковой гель на окружающий участок.
5. Поместите фазированный решетчатый преобразователь ультразвуковой системы (3-8 Гц) в третье межреберье. Переместите датчик в переднем или заднем направлении и отрегулируйте угол надреза.
6. Определите предсердия, желудочки и аорту. Запишите изображения парастернальных осей B-mode и M-mode.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Изображение в В-режиме представляет собой поперечное сечение левого желудочка на уровне папиллярной мышцы, а изображение в М-режиме показывает движение левого желудочка с течением времени.
7. Поверните головку датчика на 90° по часовой стрелке, чтобы получить парастернальный обзор с короткой осью. Определите левый желудочек, правый желудочек и папиллярную мышцу. Запись изображений в B-режиме и M-режиме.
8. Используйте рабочую станцию, предоставленную производителем ультразвуковой системы, для оценки структуры и функции сердца.

Результаты

Эхокардиография
Структуру и функцию сердца оценивали на 0, 2, 4, 6, 8, 10 и 12 неделях. Записи в В-и М-режимах парастернального изображения с короткой осью показаны на рисунке 4А. Эхокардиографическое измерение включало толщину межжелудочковой перегородки (VST), толщи?...

Обсуждение

В этом исследовании использовались методы DAC для разработки модели HFpEF для тибетских минипигов. Здесь представлен пошаговый протокол подготовки животных и инструментов, включая седацию, интубацию трахеи, канюляцию вен, хирургическое вмешательство и послеоперационный уход. Также пред?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbable surgical suture	Putong Jinhua Medical Co. Ltd, China	4-0
Aesthesia ventilator station	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd, China	WATO EX-35vet
Aspirator	Shanghai Baojia Medical Apparatus Co., Ltd, China	YX930D
Benzylpenicillin	Sichuan Pharmaceutical. INC, China	H5021738
Disposal endotracheal tube with cuff	Shenzhen Verybio Co., Ltd, China	20 cm, ID 0.9
Disposal transducer	Guangdong Baihe Medical Technology Co., Ltd, China
Dissection blade	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd, China
Electrocautery	Shanghai Hutong Medical Instruments (Group) Co., Ltd, China	GD350-B
Enzyme-linked immunosorbent assay ELISA kit	Cusabio Biotech Co., Ltd, China	CSB-E08594r
Eosin	Sigma-Aldrich Corp.	E4009
Flunixin meglumine	Shanghai Tongren Pharmaceutical Co., Ltd., China	Shouyaozi(2012)-090242103
Forceps	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China
Hematoxylin	Sigma-Aldrich Corp.	H3136
Isoflurane	RWD Life Science Co., Ltd, China	Veteasy for animals
Laryngoscope	Taixing Simeite Medical Apparatus and Instruments Limited Co., Ltd, China	For adults
LED surgical lights	Mingtai Medical Group, China	ZF700
Microplate reader	Thermo Fisher Scientific, USA	Multiskan FC
Microscope	Leica, Germany	DM2500
Mobile restraint unit	Customized	N/A	A mobile restraint unit, made by metal frame and wheels, with a canvas cover
Oxygen	Local suppliers, Guangzhou, China
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich Corp.	V900894
Patient monitor	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Company, China	Beneview T5
Peripheral Intravenous (IV) Catheter	Shenzhen Yima Pet Industry Development Co., Ltd., China	26G X 16 mm
Propofol	Guangdong Jiabo Phamaceutical Co., Ltd.	H20051842
Rib retractor	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China
Ruler	Deli Manufacturing Company, China
Scalpel handles	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China
Scissors (g)	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China
Suture	Medtronic-Coviden Corp.	3-0, 4-0
Ultrasonic gel	Tianjin Xiyuansi Production Institute, China	TM-100
Veterinary monitor	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Company, China	ePM12M Vet
Veterinary ultrasound system	Esatoe, Italy	MyLab30	Equiped with phased array transducer (3-8 Hz)
Xylazine hydrochloride injection	Shenda Animal Phamarceutical Co., Ltd., China	Shouyaozi(2016)-07003
Zoletil injection	Virbac, France	Zoletil 50	Tiletamine and zolazepam for injection