Un modello chirurgico di insufficienza cardiaca con frazione di eiezione conservata nei maialini tibetani

Riepilogo

Il presente protocollo descrive una procedura passo-passo per stabilire un modello minipig di insufficienza cardiaca con frazione di eiezione conservata utilizzando la costrizione aortica discendente. Vengono inoltre presentati i metodi per valutare la morfologia cardiaca, l'istologia e la funzione di questo modello di malattia.

Abstract

Più della metà dei casi di insufficienza cardiaca (HF) sono classificati come insufficienza cardiaca con frazione di eiezione conservata (HFpEF) in tutto il mondo. I modelli animali di grandi dimensioni sono limitati per studiare i meccanismi fondamentali dell'HFpEF e identificare potenziali bersagli terapeutici. Questo lavoro fornisce una descrizione dettagliata della procedura chirurgica di costrizione aortica discendente (DAC) nei minipig tibetani per stabilire un modello animale di grandi dimensioni di HFpEF. Questo modello ha utilizzato una costrizione controllata con precisione dell'aorta discendente per indurre un sovraccarico di pressione cronica nel ventricolo sinistro. L'ecocardiografia è stata utilizzata per valutare i cambiamenti morfologici e funzionali nel cuore. Dopo 12 settimane di stress DAC, il setto ventricolare era ipertrofico, ma lo spessore della parete posteriore era significativamente ridotto, accompagnato da dilatazione del ventricolo sinistro. Tuttavia, la frazione di eiezione ventricolare sinistra dei cuori modello è stata mantenuta al >50% durante il periodo di 12 settimane. Inoltre, il modello DAC ha mostrato danni cardiaci, tra cui fibrosi, infiammazione e ipertrofia dei cardiomiociti. I livelli dei marcatori di insufficienza cardiaca erano significativamente elevati nel gruppo DAC. Questo HFpEF indotto da DAC nei minipig è un potente strumento per lo studio dei meccanismi molecolari di questa malattia e per i test preclinici.

Introduzione

L'insufficienza cardiaca con frazione di eiezione conservata (HFpEF) rappresenta più della metà dei casi di insufficienza cardiaca ed è diventata un problema di salute pubblica in tutto il mondo¹. Le osservazioni cliniche hanno indicato diverse caratteristiche critiche dell'HFpEF: (1) disfunzione diastolica ventricolare, accompagnata da aumento della rigidità sistolica, (2) frazione di eiezione normale a riposo con prestazioni fisiche compromesse e (3) rimodellamento cardiaco². I meccanismi proposti includono la disregolazione ormonale, l'infiammazione microvascolare sistemica, i disturbi metabolici e le anomalie nelle proteine sarcomeriche ed extracellulari^{della matrice 3}. Tuttavia, studi sperimentali hanno dimostrato che l'insufficienza cardiaca con frazione di eiezione ridotta (HFrEF) provoca queste alterazioni. Studi clinici hanno esplorato gli effetti terapeutici degli inibitori del recettore dell'angiotensina e dei farmaci per il trattamento dell'HFrEF nell'HFpEF ^4,5. Tuttavia, sono necessari approcci terapeutici unici per l'HFpEF. Rispetto alla comprensione dei sintomi clinici, le alterazioni nella patologia, nella biochimica e nella biologia molecolare dell'HFpEF rimangono poco definite.

Sono stati sviluppati modelli animali di HFpEF per esplorare i meccanismi, i marcatori diagnostici e gli approcci terapeutici. Gli animali da laboratorio, tra cui maiali, cani, ratti e topi, possono sviluppare HFpEF e diversi fattori di rischio, tra cui ipertensione, diabete mellito e invecchiamento, sono stati selezionati come fattori di induzione ^6,7. Ad esempio, il desossicorticosterone acetato da solo o in combinazione con una dieta ricca di grassi/zuccheri induce HFpEF nei suini ^8,9. Il sovraccarico di pressione ventricolare è un'altra tecnica utilizzata per sviluppare HFpEF in modelli animali di grandi e piccole dimensioni¹⁰. Inoltre, negli ultimi anni sono stati adottati in tutti i continenti valori di cut-off specifici per definire l'HFpEF, come si vede nelle linee guida della Società Europea di Cardiologia, nell'American College of Cardiology Foundation/American Heart Association¹¹, nella Japanese Circulation Society/Japanese Heart Failure Society¹². Pertanto, molti modelli precedentemente stabiliti possono diventare appropriati per gli studi sull'HFpEF se vengono adottati i criteri clinici. Ad esempio, Youselfi et al. hanno affermato che un ceppo di topo geneticamente modificato, Col4a3-/-, era un modello efficace di HFpEF. Questo ceppo ha sviluppato i sintomi cardiaci tipici dell'HFpEF, come la disfunzione diastolica, la disfunzione mitocondriale e il rimodellamento cardiaco¹³. Uno studio precedente ha utilizzato una dieta ad alto contenuto energetico per indurre il rimodellamento cardiaco con una gamma media di EF nelle scimmie di età¹⁴, caratterizzata da un disturbo metabolico, fibrosi e riduzione dell'actomiosina MgATPasi nel miocardio. La costrizione aortica trasversa (TAC) del topo è uno dei modelli più utilizzati per imitare la cardiomiopatia ventricolare indotta dall'ipertensione. Il ventricolo sinistro progredisce dall'ipertrofia concentrica con aumento della FE al rimodellamento dilatativo con riduzione della FE^15,16. I fenotipi di transizione tra questi due stadi tipici suggeriscono che la tecnica di costrizione aortica può essere utilizzata per studiare l'HFpEF.

Le caratteristiche patologiche, la segnalazione cellulare e i profili di mRNA di un modello di HFpEF suino sono stati precedentemente pubblicati¹⁷. Qui, viene presentato un protocollo passo-passo per stabilire questo modello e gli approcci per valutare i fenotipi di questo modello. La procedura è illustrata nella Figura 1. In breve, il piano chirurgico è stato realizzato congiuntamente dal ricercatore principale, dai chirurghi, dai tecnici di laboratorio e dal personale addetto alla cura degli animali. I maialini sono stati sottoposti a esami sanitari, tra cui test biochimici ed ecocardiografia. Dopo l'intervento chirurgico, sono state eseguite procedure antinfiammatorie e analgesiche. L'ecocardiografia, l'esame istologico e i biomarcatori sono stati utilizzati per valutare i fenotipi.

Protocollo

Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Istituto di Monitoraggio degli Animali da Laboratorio del Guangdong (approvazione n. IACUC2017009). Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti seguendo la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (8a ed., 2011, The National Academies, USA). Gli animali sono stati ospitati in una struttura accreditata AAALAC presso il Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute (licenza n. SYXK (YUE) 2016-0122, Cina). Per sviluppare il modello HFpEF sono stati utilizzati sei maialini tibetani maschi (n = 3 ciascuno per il gruppo sham e il gruppo DAC, 25-30 kg di peso).

1. Preparazione degli animali e degli strumenti

1. Acclimatare gli animali alla struttura per 14 giorni prima dell'intervento.
2. Eseguire esami sanitari, inclusi test biochimici ed ecocardiografia, prima dell'intervento chirurgico. Escludere gli animali con anomalie cardiache nella struttura (dilatazione ventricolare o ipertrofia) e nella funzione (EF <50%) secondo il T/CALAS85-2020 Animali da laboratorio - Linee guida per la valutazione della salute dei principali organi, come cuore, fegato, reni e cervello di grandi animali da laboratorio (Associazione cinese per le scienze degli animali da laboratorio, Cina).
3. Digiunare gli animali per più di 12 ore prima dell'anestesia non alimentandoli il giorno dell'intervento.
4. Preparare la sala operatoria e i dispositivi (Figura 2). Controllare la stazione di ventilazione per estesia, i monitor veterinari e paziente, l'ecografo veterinario, l'aspiratore e altri dispositivi chirurgici. Autoclavare le forbici, le pinze, i divaricatori, i manici del bisturi, la testa dell'aspiratore, gli aghi chirurgici, ecc. (vedi Tabella dei Materiali).

2. Sedazione, intubazione tracheale e incannulamento venoso

1. Pesare gli animali e calcolare i farmaci anestetici. Sedare i minipig con 1 mg/kg di zoletil iniettabile (tiletamina e zolazepam iniettabile) e 0,5 mg/kg di xilazina cloridrato iniettabile (vedere Tabella dei materiali).
2. Trattenere e posizionare i minipig nella posizione sdraiata laterale destra sul tavolo operatorio. Accendere il sistema di riscaldamento per mantenere la temperatura corporea degli animali.
3. Eseguire l'ecocardiografia (fase 5) e raccogliere 2 mL di campioni di sangue.
4. Intubare i minipig con un tubo endotracheale collegato a una stazione di ventilazione per anestesia veterinaria (Figura 3A) (vedere la tabella dei materiali).
5. Iniziare la ventilazione a 8 ml/kg di volume corrente e 30 respiri/min. Mantenere gli animali con l'1,5%-2,5% di isoflurano durante la procedura chirurgica.
6. Stabilire l'incannulamento endovenoso utilizzando un catetere endovenoso periferico (26 G) (vedere Tabella dei materiali) da una vena dell'orecchio (di solito la vena marginale dell'orecchio, Figura 3B).
7. Collegare l'animale a un monitor veterinario.

3. Procedura chirurgica

1. Radere l'area toracica sinistra. Applicare lo 0,7% di iodio e il 75% di alcol per preparare in modo asettico la pelle dalla scapola al diaframma (Figura 3C).
2. Posizionare teli sterili sull'area chirurgica.
3. Somministrare propofol (5 mg/kg) (vedere Tabella dei materiali) per iniezione endovenosa per mantenere l'anestesia generale.
4. Segnare l'incisione (~15 cm di lunghezza) lungo il 4° spazio intercostale prima dell'incisione cutanea con l'elettrocauterizzazione.
5. Aprire il torace usando una combinazione di cauterizzazione e dissezione contundente del muscolo e del tessuto connettivo. Utilizzare un aspiratore per rimuovere il sangue durante l'operazione.
6. Utilizzare un divaricatore per le costole per allargare le costole (Figura 3D).
7. Individuare il segmento dell'aorta discendente toracica e determinare il sito di costrizione (Figura 3E). Utilizzare due punti di sutura chirurgici 3-0 per avvolgere due volte il segmento (Figura 3F). Posizionare tre strati di garza medica tra la sutura e l'aorta per evitare danni ai tessuti causati dalle suture.
8. Impostare le unità di misura della pressione per determinare il grado di costrizione (Figura 3F-H).
   NOTA: L'unità include un catetere che perfora la parete del vaso, un tubo di collegamento, un trasduttore di pressione e un monitor paziente.
9. Stringere gradualmente la sutura chirurgica che circonda il segmento discendente dell'aorta per ottenere il grado di costrizione desiderato. Lasciare che le letture della pressione si stabilizzino per 20 minuti e stringere in modo permanente i nodi chirurgici.
10. Utilizzare un tubo toracico di drenaggio per evacuare l'aria e i liquidi in eccesso nella cavità toracica.
11. Chiudere la parete toracica a strati, riapprossimare le costole e dividere i muscoli con punti di sutura riassorbibili.
12. Verificare la presenza di eventuali emorragie e assicurarsi che l'emostasi sia corretta.
13. Applicare un flacone di benzilpenicillina (800.000 unità) (vedere Tabella dei materiali) sull'area operatoria dopo l'intervento.
14. Monitorare la presenza di battito delle palpebre e il movimento degli arti dell'animale. Scollegare il ventilatore ma lasciare il tubo endotracheale. Monitorare la presenza di respirazione spontanea.
15. Riporta l'animale nella sua stanza di stabulazione e lascialo svegliare automaticamente.

4. Cure post-operatorie

1. Applicare la benzilpenicillina ogni giorno per 1 settimana (20.000 U/kg).
2. Applicare 1 mg/kg di flunixin meglumina (vedere Tabella dei materiali) ogni giorno per 1 settimana.
   NOTA: Gli analgesici oppioidi e FANS devono essere somministrati intra e post-operatoriamente.

5. Ecocardiografia transtoracica

1. Sedare l'animale con 1 mg/kg di zoletil.
2. Collocare l'animale in un'unità di ritenuta mobile con una copertura in tela.
   NOTA: L'unità di ritenuta mobile (vedi Tabella dei materiali) ha quattro aperture progettate per estendere gli arti anteriori e posteriori dell'animale.
3. Radere il torace sinistro dell'animale.
4. Posiziona le dita al centro sinistro del torace per sentire il polso apicale. Applicare il gel ad ultrasuoni sull'area circostante.
5. Posizionare il trasduttore phased array (3-8 Hz) del sistema a ultrasuoni nel terzo spazio intercostale. Spostare il trasduttore verso una direzione anteriore o posteriore e regolare l'angolo di tacca.
6. Identifica gli atri, i ventricoli e l'aorta. Registrare le immagini parasternali dell'asse lungo in modalità B e M.
   NOTA: L'immagine in modalità B rappresenta la sezione trasversale del ventricolo sinistro a livello del muscolo papillare e l'immagine in modalità M mostra il movimento del ventricolo sinistro nel tempo.
7. Ruotare la testa del trasduttore di 90° in senso orario per ottenere la vista parasternale sull'asse corto. Identifica il ventricolo sinistro, il ventricolo destro e il muscolo papillare. Registrare le immagini in modalità B e M.
8. Utilizzare la workstation fornita dal produttore dell'ecografo per valutare la struttura e la funzione cardiaca.

Risultati

Ecocardiografia
La struttura e la funzione cardiaca sono state valutate alle settimane 0, 2, 4, 6, 8, 10 e 12. Le registrazioni in modalità B e M della vista parasternale sull'asse corto sono mostrate nella Figura 4A. La misurazione ecocardiografica includeva lo spessore del setto ventricolare (VST), lo spessore della parete posteriore (PWT) e la dimensione interna del ventricolo sinistro (LVID). Il VST all'end-diastole è aumentato nei cuori DAC, mentre il PWT all'end-d...

Discussione

Questo studio ha utilizzato tecniche DAC per sviluppare un modello HFpEF per i maialini tibetani. Qui viene presentato un protocollo di preparazione passo-passo dell'animale e dello strumento, tra cui sedazione, intubazione tracheale, incannulamento venoso, procedura chirurgica e assistenza post-chirurgica. Vengono inoltre presentate le tecniche di registrazione per le immagini cardiache ecocardiografiche B-mode e M-mode. Dopo la DAC, il cuore ha subito ipertrofia ventricolare sinistra durante le settimane 4 e 6 e dilata...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbable surgical suture	Putong Jinhua Medical Co. Ltd, China	4-0
Aesthesia ventilator station	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd, China	WATO EX-35vet
Aspirator	Shanghai Baojia Medical Apparatus Co., Ltd, China	YX930D
Benzylpenicillin	Sichuan Pharmaceutical. INC, China	H5021738
Disposal endotracheal tube with cuff	Shenzhen Verybio Co., Ltd, China	20 cm, ID 0.9
Disposal transducer	Guangdong Baihe Medical Technology Co., Ltd, China
Dissection blade	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd, China
Electrocautery	Shanghai Hutong Medical Instruments (Group) Co., Ltd, China	GD350-B
Enzyme-linked immunosorbent assay ELISA kit	Cusabio Biotech Co., Ltd, China	CSB-E08594r
Eosin	Sigma-Aldrich Corp.	E4009
Flunixin meglumine	Shanghai Tongren Pharmaceutical Co., Ltd., China	Shouyaozi(2012)-090242103
Forceps	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China
Hematoxylin	Sigma-Aldrich Corp.	H3136
Isoflurane	RWD Life Science Co., Ltd, China	Veteasy for animals
Laryngoscope	Taixing Simeite Medical Apparatus and Instruments Limited Co., Ltd, China	For adults
LED surgical lights	Mingtai Medical Group, China	ZF700
Microplate reader	Thermo Fisher Scientific, USA	Multiskan FC
Microscope	Leica, Germany	DM2500
Mobile restraint unit	Customized	N/A	A mobile restraint unit, made by metal frame and wheels, with a canvas cover
Oxygen	Local suppliers, Guangzhou, China
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich Corp.	V900894
Patient monitor	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Company, China	Beneview T5
Peripheral Intravenous (IV) Catheter	Shenzhen Yima Pet Industry Development Co., Ltd., China	26G X 16 mm
Propofol	Guangdong Jiabo Phamaceutical Co., Ltd.	H20051842
Rib retractor	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China
Ruler	Deli Manufacturing Company, China
Scalpel handles	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China
Scissors (g)	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China
Suture	Medtronic-Coviden Corp.	3-0, 4-0
Ultrasonic gel	Tianjin Xiyuansi Production Institute, China	TM-100
Veterinary monitor	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Company, China	ePM12M Vet
Veterinary ultrasound system	Esatoe, Italy	MyLab30	Equiped with phased array transducer (3-8 Hz)
Xylazine hydrochloride injection	Shenda Animal Phamarceutical Co., Ltd., China	Shouyaozi(2016)-07003
Zoletil injection	Virbac, France	Zoletil 50	Tiletamine and zolazepam for injection