Un modelo quirúrgico de insuficiencia cardíaca con fracción de eyección preservada en minicerdos tibetanos

Resumen

El presente protocolo describe un procedimiento paso a paso para establecer un modelo minipig de insuficiencia cardíaca con fracción de eyección preservada utilizando constricción aórtica descendente. También se presentan los métodos para evaluar la morfología, la histología y la función cardíaca de este modelo de enfermedad.

Resumen

Más de la mitad de los casos de insuficiencia cardíaca (IC) se clasifican como insuficiencia cardíaca con fracción de eyección preservada (ICFEP) en todo el mundo. Los modelos animales de gran tamaño son limitados para investigar los mecanismos fundamentales de la ICFEP e identificar posibles dianas terapéuticas. Este trabajo proporciona una descripción detallada del procedimiento quirúrgico de constricción aórtica descendente (DAC) en minicerdos tibetanos para establecer un modelo animal grande de ICFEP. Este modelo utilizó una constricción controlada con precisión de la aorta descendente para inducir una sobrecarga crónica de presión en el ventrículo izquierdo. Se utilizó la ecocardiografía para evaluar los cambios morfológicos y funcionales en el corazón. Después de 12 semanas de estrés DAC, el tabique ventricular estaba hipertrófico, pero el grosor de la pared posterior se redujo significativamente, acompañado de dilatación del ventrículo izquierdo. Sin embargo, la fracción de eyección del VI de los corazones modelo se mantuvo en >50% durante el período de 12 semanas. Además, el modelo DAC mostró daño cardíaco, incluyendo fibrosis, inflamación e hipertrofia de cardiomiocitos. Los niveles de marcadores de insuficiencia cardíaca se elevaron significativamente en el grupo DAC. Esta HFpEF inducida por DAC en minicerdos es una poderosa herramienta para investigar los mecanismos moleculares de esta enfermedad y para las pruebas preclínicas.

Introducción

La insuficiencia cardíaca con fracción de eyección preservada (ICFEP) representa más de la mitad de los casos de insuficiencia cardíaca y se ha convertido en un problema de salud pública mundial¹. Las observaciones clínicas han indicado varias características críticas de la ICFEP: (1) disfunción diastólica ventricular, acompañada de aumento de la rigidez sistólica, (2) fracción de eyección normal en reposo con deterioro del rendimiento del ejercicio, y (3) remodelación cardíaca². Los mecanismos propuestos incluyen la desregulación hormonal, la inflamación microvascular sistémica, los trastornos metabólicos y las anomalías en las proteínas de la matriz sarcomérica y extracelular³. Sin embargo, estudios experimentales han demostrado que la insuficiencia cardíaca con fracción de eyección reducida (ICFEr) causa estas alteraciones. Los estudios clínicos han explorado los efectos terapéuticos de los inhibidores de los receptores de angiotensina y los fármacos para el tratamiento de la ICFErEF en la ICFEP ^4,5. Sin embargo, se necesitan enfoques terapéuticos únicos para la ICFEP. En comparación con la comprensión de los síntomas clínicos, las alteraciones en la patología, la bioquímica y la biología molecular de la ICFEP siguen estando mal definidas.

Se han desarrollado modelos animales de ICFEP para explorar los mecanismos, los marcadores diagnósticos y los enfoques terapéuticos. Los animales de laboratorio, incluyendo cerdos, perros, ratas y ratones, pueden desarrollar ICFEP, y diversos factores de riesgo, incluyendo hipertensión, diabetes mellitus y envejecimiento, fueron seleccionados como factores de inducción ^6,7. Por ejemplo, el acetato de desoxicorticosterona solo o combinado con una dieta alta en grasas/azúcares induce ICFEP en cerdos ^8,9. La sobrecarga de presión ventricular es otra técnica utilizada para desarrollar ICFEP en modelos animales grandes y pequeños¹⁰. Además, en los últimos años se han adoptado valores de corte específicos de FE para definir la ICFEP en todos los continentes, como se ve en las guías de la Sociedad Europea de Cardiología, la Fundación del Colegio Americano de Cardiología/Asociación Americana del Corazón¹¹, la Sociedad Japonesa de Circulación/Sociedad Japonesa de Insuficiencia Cardíaca¹². Por lo tanto, muchos modelos previamente establecidos pueden llegar a ser apropiados para los estudios de ICFEP si se adoptan los criterios clínicos. Por ejemplo, Youselfi et al. afirmaron que una cepa de ratón modificada genéticamente, Col4a3-/-, era un modelo eficaz de HFpEF. Esta cepa desarrolló síntomas cardíacos típicos de la ICFEP, como disfunción diastólica, disfunción mitocondrial y remodelación cardíaca¹³. Un estudio previo utilizó una dieta alta en energía para inducir la remodelación cardíaca con un rango medio de FE en monos de edad¹⁴, caracterizada por un trastorno metabólico, fibrosis y reducción de la actomiosina MgATPasa en el miocardio. La constricción aórtica transversa (TAC) de ratón es uno de los modelos más utilizados para imitar la miocardiopatía ventricular inducida por hipertensión. El ventrículo izquierdo evoluciona de hipertrofia concéntrica con aumento de FE a remodelación dilatada con FE reducida^15,16. Los fenotipos transicionales entre estos dos estadios típicos sugieren que la técnica de constricción aórtica puede utilizarse para estudiar la ICFEP.

Las características patológicas, la señalización celular y los perfiles de ARNm de un modelo de ICFEP porcino fueron publicados previamente¹⁷. Aquí, se presenta un protocolo paso a paso para establecer este modelo y los enfoques para evaluar los fenotipos de este modelo. El procedimiento se ilustra en la Figura 1. Brevemente, el plan quirúrgico fue realizado conjuntamente por el investigador principal, los cirujanos, los técnicos de laboratorio y el personal de cuidado de los animales. Los minicerdos se sometieron a exámenes de salud, incluyendo pruebas bioquímicas y ecocardiografías. Después de la cirugía, se realizaron procedimientos antiinflamatorios y analgésicos. Para evaluar los fenotipos se utilizó ecocardiografía, examen histológico y biomarcadores.

Protocolo

Todos los estudios en animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Instituto de Monitoreo de Animales de Laboratorio de Guangdong (aprobación no. IACUC2017009). Todos los experimentos con animales se realizaron siguiendo la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (8ª Ed., 2011, The National Academies, USA). Los animales fueron alojados en una instalación acreditada por la AAALAC en el Instituto de Monitoreo de Animales de Laboratorio de Guangdong (licencia no. SYXK (YUE) 2016-0122, China). Se utilizaron seis minicerdos tibetanos machos (n = 3 para el grupo simulado y el grupo DAC, de 25-30 kg de peso) para desarrollar el modelo HFpEF.

1. Preparación de animales e instrumentos

1. Aclimatar a los animales a las instalaciones durante 14 días antes de la cirugía.
2. Realizar exámenes de salud, incluyendo pruebas bioquímicas y ecocardiografías, antes de la cirugía. Excluir a los animales con anomalías cardíacas en la estructura (dilatación ventricular o hipertrofia) y la función (FE <50%) de acuerdo con el T/CALAS85-2020 Animales de laboratorio - Directrices para la evaluación de la salud de los órganos principales, como el corazón, el hígado, el riñón y el cerebro de grandes animales de laboratorio (Asociación China de Ciencias de los Animales de Laboratorio, China).
3. Ayunar a los animales durante más de 12 h antes de la anestesia no alimentándolos el día de la cirugía.
4. Prepare el quirófano y los dispositivos (Figura 2). Revise la estación de ventilación de estesia, los monitores veterinarios y de pacientes, el sistema de ultrasonido veterinario, el aspirador y otros dispositivos quirúrgicos. Autoclave las tijeras, pinzas, retractores, mangos de bisturí, cabezal aspirador, agujas quirúrgicas, etc. (ver Tabla de Materiales).

2. Sedación, intubación traqueal y canulación venosa

1. Pesar a los animales y calcular los fármacos anestésicos. Sedar a los minicerdos con 1 mg/kg de zoletil inyectable (tiletamina y zolazepam inyectables) y 0,5 mg/kg de inyección de clorhidrato de xilacina (ver Tabla de materiales).
2. Sujete y coloque los minicerdos en la posición lateral derecha reclinada sobre la mesa de quirófano. Encienda el sistema de calefacción para mantener la temperatura corporal de los animales.
3. Realice la ecocardiografía (paso 5) y recoja 2 mL de muestras de sangre.
4. Intuble a los minicerdos con un tubo endotraqueal conectado a una estación de ventilación de anestesia veterinaria (Figura 3A) (ver Tabla de Materiales).
5. Iniciar la ventilación a un volumen corriente de 8 mL/kg y 30 respiraciones/min. Mantener a los animales con 1,5%-2,5% de isoflurano durante el procedimiento quirúrgico.
6. Establecer la canulación intravenosa utilizando un catéter intravenoso periférico (26 G) (ver Tabla de materiales) de una vena del oído (generalmente la vena marginal del oído, Figura 3B).
7. Conecta al animal a un monitor veterinario.

3. Procedimiento quirúrgico

1. Afeita la zona torácica izquierda. Aplicar 0,7% de yodo y 75% de alcohol para preparar asépticamente la piel desde la escápula hasta el diafragma (Figura 3C).
2. Coloque paños estériles sobre el área quirúrgica.
3. Administrar propofol (5 mg/kg) (ver Tabla de Materiales) por inyección intravenosa para mantener la anestesia general.
4. Marque la incisión (~15 cm de largo) a lo largo del 4º espacio intercostal antes de la incisión en la piel con electrocauterización.
5. Abra el tórax usando una combinación de cauterización y disección roma del músculo y el tejido conectivo. Use un aspirador para extraer sangre durante la operación.
6. Use un retractor de costillas para separar las costillas (Figura 3D).
7. Localice el segmento de la aorta descendente torácica y determine el sitio de constricción (Figura 3E). Use dos suturas quirúrgicas 3-0 para enrollar el segmento dos veces (Figura 3F). Coloque tres capas de gasa médica entre la sutura y la aorta para evitar daños en los tejidos por las suturas.
8. Configure unidades de medición de presión para determinar el grado de constricción (Figura 3F-H).
   NOTA: La unidad incluye un catéter que perfora la pared del vaso, un tubo de conexión, un transductor de presión y un monitor de paciente.
9. Apriete gradualmente la sutura quirúrgica que rodea el segmento descendente de la aorta para lograr el grado de constricción deseado. Deje que las lecturas de presión se estabilicen durante 20 minutos y apriete permanentemente los nudos quirúrgicos.
10. Use un tubo torácico de drenaje para evacuar el aire y el exceso de líquidos en la cavidad torácica.
11. Cerrar la pared torácica en capas, reaproximar las costillas y los músculos divididos con suturas reabsorbibles.
12. Compruebe si hay sangrado y asegúrese de tener una buena hemostasia.
13. Aplicar un frasco de bencilpenicilina (800.000 unidades) (ver Tabla de Materiales) en el área de operación después de la cirugía.
14. Controle la presencia de parpadeo de los ojos y el movimiento de las extremidades del animal. Desconecte el ventilador, pero deje el tubo endotraqueal. Vigilar la presencia de respiración espontánea.
15. Devuelve al animal a su habitación y deja que se despierte automáticamente.

4. Cuidados postoperatorios

1. Aplicar bencilpenicilina diariamente durante 1 semana (20.000 U/kg).
2. Aplicar 1 mg/kg de flunixina meglumina (ver Tabla de Materiales) diariamente durante 1 semana.
   NOTA: Los analgésicos opioides y AINE deben administrarse intra y postoperatoriamente.

5. Ecocardiografía transtorácica

1. Sedar al animal con 1 mg/kg de zoletil.
2. Coloque al animal en una unidad de retención móvil con una cubierta de lona.
   NOTA: La unidad móvil de sujeción (ver Tabla de Materiales) tiene cuatro aberturas diseñadas para extender las extremidades delanteras y traseras del animal.
3. Afeita el lado izquierdo del pecho del animal.
4. Coloque los dedos en el centro izquierdo del pecho para sentir el pulso apical. Aplique el gel ultrasónico en el área circundante.
5. Coloque el transductor de ultrasonido (3-8 Hz) en el tercer espacio intercostal. Mueva el transductor hacia una dirección anterior o posterior y ajuste el ángulo de la muesca.
6. Identificar las aurículas, los ventrículos y la aorta. Grabe las imágenes del eje largo paraesternal en modo B y M.
   NOTA: La imagen en modo B representa la sección transversal del ventrículo izquierdo a nivel del músculo papilar, y la imagen en modo M muestra el movimiento del ventrículo izquierdo a lo largo del tiempo.
7. Gire el cabezal del transductor 90° en el sentido de las agujas del reloj para obtener la vista del eje corto paraesternal. Identificar el ventrículo izquierdo, el ventrículo derecho y el músculo papilar. Grabe las imágenes en modo B y modo M.
8. Utilice la estación de trabajo proporcionada por el fabricante del sistema de ultrasonido para evaluar la estructura y función cardíacas.

Resultados

Ecocardiografía
Se evaluó la estructura y función cardíaca en las semanas 0, 2, 4, 6, 8, 10 y 12. En la Figura 4A se muestran los registros en modo B y modo M de la vista paraesternal del eje corto. La medición ecocardiográfica incluyó el grosor del septo ventricular (VST), el grosor de la pared posterior (PWT) y la dimensión interna del ventrículo izquierdo (VIVI). La VST al final de la diástole aumentó en los corazones de la DAC, mientras que la PWT al final ...

Discusión

Este estudio utilizó técnicas DAC para desarrollar un modelo de HFpEF para minicerdos tibetanos. Aquí se presenta un protocolo de preparación paso a paso de animales e instrumentos, que incluye sedación, intubación traqueal, canulación venosa, procedimiento quirúrgico y atención posquirúrgica. También se presentan las técnicas de registro de imágenes cardíacas ecocardiográficas en modo B y modo M. Después de la DAC, el corazón sufrió hipertrofia ventricular izquierda durante las semanas 4 y 6 y dilataci...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbable surgical suture	Putong Jinhua Medical Co. Ltd, China	4-0
Aesthesia ventilator station	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd, China	WATO EX-35vet
Aspirator	Shanghai Baojia Medical Apparatus Co., Ltd, China	YX930D
Benzylpenicillin	Sichuan Pharmaceutical. INC, China	H5021738
Disposal endotracheal tube with cuff	Shenzhen Verybio Co., Ltd, China	20 cm, ID 0.9
Disposal transducer	Guangdong Baihe Medical Technology Co., Ltd, China
Dissection blade	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd, China
Electrocautery	Shanghai Hutong Medical Instruments (Group) Co., Ltd, China	GD350-B
Enzyme-linked immunosorbent assay ELISA kit	Cusabio Biotech Co., Ltd, China	CSB-E08594r
Eosin	Sigma-Aldrich Corp.	E4009
Flunixin meglumine	Shanghai Tongren Pharmaceutical Co., Ltd., China	Shouyaozi(2012)-090242103
Forceps	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China
Hematoxylin	Sigma-Aldrich Corp.	H3136
Isoflurane	RWD Life Science Co., Ltd, China	Veteasy for animals
Laryngoscope	Taixing Simeite Medical Apparatus and Instruments Limited Co., Ltd, China	For adults
LED surgical lights	Mingtai Medical Group, China	ZF700
Microplate reader	Thermo Fisher Scientific, USA	Multiskan FC
Microscope	Leica, Germany	DM2500
Mobile restraint unit	Customized	N/A	A mobile restraint unit, made by metal frame and wheels, with a canvas cover
Oxygen	Local suppliers, Guangzhou, China
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich Corp.	V900894
Patient monitor	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Company, China	Beneview T5
Peripheral Intravenous (IV) Catheter	Shenzhen Yima Pet Industry Development Co., Ltd., China	26G X 16 mm
Propofol	Guangdong Jiabo Phamaceutical Co., Ltd.	H20051842
Rib retractor	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China
Ruler	Deli Manufacturing Company, China
Scalpel handles	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China
Scissors (g)	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China
Suture	Medtronic-Coviden Corp.	3-0, 4-0
Ultrasonic gel	Tianjin Xiyuansi Production Institute, China	TM-100
Veterinary monitor	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Company, China	ePM12M Vet
Veterinary ultrasound system	Esatoe, Italy	MyLab30	Equiped with phased array transducer (3-8 Hz)
Xylazine hydrochloride injection	Shenda Animal Phamarceutical Co., Ltd., China	Shouyaozi(2016)-07003
Zoletil injection	Virbac, France	Zoletil 50	Tiletamine and zolazepam for injection