Tibet Minipiglerinde Korunmuş Ejeksiyon Fraksiyonlu Kalp Yetmezliğinin Cerrahi Modeli

Özet

Mevcut protokol, inen aort daralması kullanılarak korunmuş ejeksiyon fraksiyonu ile kalp yetmezliğinin minipig modelini oluşturmak için adım adım bir prosedürü açıklamaktadır. Bu hastalık modelinin kardiyak morfolojisini, histolojisini ve fonksiyonunu değerlendirme yöntemleri de sunulmaktadır.

Özet

Dünya çapında kalp yetmezliği (KY) vakalarının yarısından fazlası korunmuş ejeksiyon fraksiyonu (HFpEF) olan kalp yetmezliği olarak sınıflandırılmaktadır. HFpEF'in temel mekanizmalarını araştırmak ve potansiyel terapötik hedefleri belirlemek için büyük hayvan modelleri sınırlıdır. Bu çalışma, HFpEF'in büyük bir hayvan modelini oluşturmak için Tibet minipiglerinde inen aort daralmasının (DAC) cerrahi prosedürünün ayrıntılı bir tanımını sağlar. Bu model, sol ventrikülde kronik basınç yüklenmesini indüklemek için inen aortun hassas bir şekilde kontrollü bir daralmasını kullandı. Kalpteki morfolojik ve fonksiyonel değişiklikleri değerlendirmek için ekokardiyografi kullanıldı. 12 haftalık DAC stresinden sonra, ventriküler septum hipertrofikti, ancak sol ventrikülün genişlemesi ile birlikte arka duvarın kalınlığı önemli ölçüde azaldı. Bununla birlikte, model kalplerinin LV ejeksiyon fraksiyonu, 12 haftalık süre boyunca %>50'de tutuldu. Ayrıca, DAC modeli fibroz, inflamasyon ve kardiyomiyosit hipertrofisi dahil olmak üzere kardiyak hasar gösterdi. Kalp yetersizliği belirteç düzeyleri DAC grubunda anlamlı olarak yüksekti. Minipiglerde DAC'nin neden olduğu bu HFpEF, bu hastalığın moleküler mekanizmalarını araştırmak ve klinik öncesi testler için güçlü bir araçtır.

Giriş

Korunmuş ejeksiyon fraksiyonlu kalp yetmezliği (HFpEF), kalp yetmezliği vakalarının yarısından fazlasını oluşturur ve dünya çapında bir halk sağlığı sorunu haline gelmiştir¹. Klinik gözlemler, HFpEF'in birkaç kritik özelliğini göstermiştir: (1) artmış sistolik sertliğin eşlik ettiği ventriküler diyastolik disfonksiyon, (2) bozulmuş egzersiz performansı ile istirahatte normal ejeksiyon fraksiyonu ve (3) kardiyak yeniden şekillenme². Önerilen mekanizmalar arasında hormonal düzensizlik, sistemik mikrovasküler inflamasyon, metabolik bozukluklar ve sarkomerik ve hücre dışı matriks proteinlerindeki anormallikler^{yer almaktadır 3}. Bununla birlikte, deneysel çalışmalar, azaltılmış ejeksiyon fraksiyonu (HFrEF) ile kalp yetmezliğinin bu değişikliklere neden olduğunu göstermiştir. Klinik çalışmalar, HFpEF ^4,5'te HFrEF tedavisi için anjiyotensin reseptör inhibitörlerinin ve ilaçlarının terapötik etkilerini araştırmıştır. Bununla birlikte, HFpEF için benzersiz terapötik yaklaşımlara ihtiyaç vardır. Klinik semptomların anlaşılmasıyla karşılaştırıldığında, HFpEF'in patolojisi, biyokimyası ve moleküler biyolojisindeki değişiklikler tam olarak tanımlanmamıştır.

HFpEF'in hayvan modelleri, mekanizmaları, tanısal belirteçleri ve terapötik yaklaşımları keşfetmek için geliştirilmiştir. Domuzlar, köpekler, sıçanlar ve fareler dahil olmak üzere laboratuvar hayvanları HFpEF geliştirebilir ve hipertansiyon, diabetes mellitus ve yaşlanma gibi çeşitli risk faktörleri indüksiyon faktörleri olarak seçilmiştir ^6,7. Örneğin, deoksikortikosteron asetat tek başına veya yüksek yağ/şeker diyeti ile birlikte domuzlarda HFpEF'i indükler ^8,9. Ventriküler basınç aşırı yüklenmesi, büyük ve küçük hayvan modellerinde HFpEF geliştirmek için kullanılan başka bir tekniktir¹⁰. Ek olarak, Avrupa Kardiyoloji Derneği kılavuzlarında, Amerikan Kardiyoloji Koleji Vakfı / Amerikan Kalp Derneği¹¹, Japon Dolaşım Derneği / Japon Kalp Yetmezliği Derneği^12'de görüldüğü gibi, HFpEF'i tanımlamak için spesifik EF kesme değerleri son yıllarda kıtalar arasında benimsenmiştir. Bu nedenle, daha önce oluşturulmuş birçok model, klinik kriterlerin benimsenmesi durumunda HFpEF çalışmaları için uygun hale gelebilir. Örneğin, Youselfi ve ark. genetiği değiştirilmiş bir fare suşu olan Col4a3-/-'nin etkili bir HFpEF modeli olduğunu iddia etti. Bu suş, diyastolik disfonksiyon, mitokondriyal disfonksiyon ve kardiyak yeniden şekillenme gibi tipik HFpEF kardiyak semptomları geliştirdi¹³. Önceki bir çalışma, metabolik bir bozukluk, fibroz ve miyokardda azalmış aktomiyosin MgATPaz ile karakterize edilen yaşlı maymunlarda¹⁴ orta aralıkta bir EF ile kardiyak yeniden şekillenmeyi indüklemek için yüksek enerjili bir diyet kullandı. Fare transvers aort daralması (TAK), hipertansiyona bağlı ventriküler kardiyomiyopatiyi taklit etmek için en yaygın kullanılan modellerden biridir. Sol ventrikül, artmış EF ile konsantrik hipertrofiden azalmış EF^15,16 ile dilate yeniden şekillenmeye ilerler. Bu iki tipik aşama arasındaki geçiş fenotipleri, aort daralma tekniğinin HFpEF'i incelemek için kullanılabileceğini düşündürmektedir.

Bir domuz HFpEF modelinin patolojik özellikleri, hücresel sinyalizasyonu ve mRNA profilleri daha önce yayınlanmıştı¹⁷. Burada, bu modeli kurmak için adım adım bir protokol ve bu modelin fenotiplerini değerlendirmek için yaklaşımlar sunulmaktadır. Prosedür Şekil 1'de gösterilmiştir. Kısaca cerrahi plan, baş araştırmacı, cerrahlar, laboratuvar teknisyenleri ve hayvan bakım personeli tarafından ortaklaşa yapılmıştır. Minipigler, biyokimyasal testler ve ekokardiyografi dahil olmak üzere sağlık muayenelerine tabi tutuldu. Ameliyat sonrası antiinflamatuar ve analjezik işlemler uygulandı. Fenotiplerin değerlendirilmesinde ekokardiyografi, histolojik inceleme ve biyobelirteçler kullanıldı.

Protokol

Tüm hayvan çalışmaları, Guangdong Laboratuvar Hayvanları İzleme Enstitüsü'nün Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır (onay no. IACUC2017009). Tüm hayvan deneyleri, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na (8th Ed., 2011, The National Academies, ABD) uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Hayvanlar, Guangdong Laboratuvar Hayvanları İzleme Enstitüsü'nde AAALAC tarafından akredite edilmiş bir tesiste barındırıldı (lisans no. SYXK (YUE) 2016-0122, Çin). HFpEF modelini geliştirmek için altı erkek Tibet minipigi (sahte grup ve DAC grubu için n = 3, 25-30 kg ağırlığında) kullanıldı.

1. Hayvan ve enstrüman hazırlama

1. Ameliyattan önce hayvanları 14 gün boyunca tesise alıştırın.
2. Ameliyattan önce biyokimyasal testler ve ekokardiyografi dahil olmak üzere sağlık muayeneleri yapın. T/CALAS85-2020 Laboratuvar hayvanları - Büyük laboratuvar hayvanlarının kalbi, karaciğeri, böbreği ve beyni gibi ana organların sağlık değerlendirmesi için yönergeler (Çin Laboratuvar Hayvanları Bilimleri Derneği, Çin) uyarınca yapısında (ventriküler dilatasyon veya hipertrofi) ve işlevinde (EF %<50) kardiyak anormallikleri olan hayvanları hariç tutun.
3. Ameliyat günü beslenmeyerek hayvanları anesteziden önce 12 saatten fazla aç bırakın.
4. Ameliyathaneyi ve cihazları hazırlayın (Şekil 2). Anestezi ventilatör istasyonunu, veteriner ve hasta monitörlerini, veteriner ultrason sistemini, aspiratörü ve diğer cerrahi cihazları kontrol edin. Makas, forseps, ekartör, neşter sapı, aspiratör başlığı, cerrahi iğneler vb. otoklavlayın (bkz.

2. Sedasyon, trakeal entübasyon ve ven kanülasyonu

1. Hayvanları tartın ve anestezik ilaçları hesaplayın. Minipigleri 1 mg / kg zoletil enjeksiyonu (enjeksiyon için tiletamin ve zolazepam) ve 0.5 mg / kg ksilazin hidroklorür enjeksiyonu ile sakinleştirin (bkz.
2. Minipigleri kısıtlayın ve ameliyat masasında sağ lateral yaslanmış pozisyona yerleştirin. Hayvanların vücut ısısını korumak için ısıtma sistemini açın.
3. Ekokardiyografi yapın (adım 5) ve 2 mL kan örneği alın.
4. Minipigleri bir veteriner anestezi ventilatör istasyonuna bağlı bir endotrakeal tüp ile entübe edin (Şekil 3A) (bkz.
5. Ventilasyonu 8 mL / kg tidal hacimde ve 30 nefes / dk'da başlatın. Cerrahi işlem sırasında hayvanları% 1.5 -% 2.5 izofluran ile koruyun.
6. Bir kulak damarından (genellikle marjinal kulak damarı, Şekil 3B) periferik intravenöz kateter (26 G) (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak intravenöz kanülasyon oluşturun.
7. Hayvanı bir veteriner monitörüne bağlayın.

3. Cerrahi prosedür

1. Sol torasik bölgeyi tıraş edin. Cildi kürek kemiğinden diyaframa aseptik olarak hazırlamak için %0.7 iyot ve %75 alkol uygulayın (Şekil 3C).
2. Ameliyat alanının üzerine steril örtüler yerleştirin.
3. Genel anesteziyi sürdürmek için intravenöz enjeksiyon ile propofol (5 mg / kg) (Malzeme Tablosuna bakınız) uygulayın.
4. Elektrokoter ile cilt insizyonundan önce 4. interkostal boşluk boyunca insizyonu (~ 15 cm uzunluğunda) işaretleyin.
5. Kas ve bağ dokusunun koter ve künt diseksiyonunun bir kombinasyonunu kullanarak göğsü açın. Ameliyat sırasında kanı almak için aspiratör kullanın.
6. Kaburgaları açmak için bir kaburga ekartörü kullanın (Şekil 3D).
7. Torasik inen aort segmentini bulun ve daralma bölgesini belirleyin (Şekil 3E). Segmentin etrafında iki kez dolaşmak için iki adet 3-0 cerrahi dikiş kullanın (Şekil 3F). Dikişlerin dokuya zarar vermesini önlemek için dikiş ile aort arasına üç kat tıbbi gazlı bez yerleştirin.
8. Daralma derecesini belirlemek için basınç ölçüm birimlerini ayarlayın (Şekil 3F-H).
   NOT: Ünite, damar duvarını delen bir kateter, bağlantı tüpü, basınç dönüştürücü ve bir hasta monitörü içerir.
9. İstenilen daralma derecesini elde etmek için inen aort segmentini çevreleyen cerrahi dikişi kademeli olarak sıkın. Basınç okumalarının 20 dakika stabilize olmasına izin verin ve cerrahi düğümleri kalıcı olarak sıkın.
10. Göğüs boşluğundaki havayı ve fazla sıvıları boşaltmak için bir drenaj göğüs tüpü kullanın.
11. Göğüs duvarını katmanlar halinde kapatın, kaburgaları ve bölünmüş kasları emilebilir dikişlerle yeniden yaklaştırın.
12. Herhangi bir kanama olup olmadığını kontrol edin ve iyi bir hemostaz olduğundan emin olun.
13. Ameliyat sonrası ameliyat bölgesine bir şişe benzilpenisilin (800.000 ünite) ( Malzeme Tablosuna bakınız) uygulayın.
14. Hayvanın göz kırpma ve uzuv hareketinin varlığını izleyin. Ventilatörü ayırın ancak endotrakeal tüpü bırakın. Spontan solunumun varlığını izleyin.
15. Hayvanı barınma odasına geri koyun ve otomatik olarak uyanmaya bırakın.

4. Ameliyat sonrası bakım

1. 1 hafta boyunca her gün benzilpenisilin uygulayın (20.000 U / kg).
2. 1 hafta boyunca günde 1 mg / kg fluniksin meglumin ( Malzeme Tablosuna bakınız) uygulayın.
   NOT: Opioid ve NSAID analjezikler ameliyat sırasında ve sonrasında uygulanmalıdır.

5. Transtorasik ekokardiyografi

1. Hayvanı 1 mg / kg zoletil ile sakinleştirin.
2. Hayvanı kanvas kapaklı mobil bir emniyet ünitesine yerleştirin.
   NOT: Mobil emniyet ünitesi (Malzeme Tablosuna bakın), hayvanın ön ayaklarını ve arka bacaklarını uzatmak için tasarlanmış dört açıklığa sahiptir.
3. Hayvanın sol göğsünü tıraş edin.
4. Apikal nabzı hissetmek için parmaklarınızı göğsün sol ortasına yerleştirin. Ultrasonik jeli çevreye uygulayın.
5. Ultrason sisteminin faz dizisi dönüştürücüsünü (3-8 Hz) üçüncü interkostal boşluğa yerleştirin. Dönüştürücüyü ön veya arka yöne doğru hareket ettirin ve çentik açısını ayarlayın.
6. Atriyumları, ventrikülleri ve aortu tanımlayın. B modu ve M modu parasternal uzun eksenli görüntüleri kaydedin.
   NOT: B modu görüntüsü, sol ventrikülün papiller kas seviyesindeki enine kesitini temsil eder ve M modu görüntüsü, sol ventrikülün zaman içindeki hareketini gösterir.
7. Parasternal kısa eksen görünümünü elde etmek için dönüştürücü kafasını saat yönünde 90° çevirin. Sol ventrikülü, sağ ventrikülü ve papiller kası tanımlayın. B modu ve M modu görüntülerini kaydedin.
8. Kardiyak yapıyı ve işlevi değerlendirmek için ultrason sistemi üreticisi tarafından sağlanan iş istasyonunu kullanın.

Sonuçlar

Ekokardiyografi
Kardiyak yapı ve fonksiyon 0, 2, 4, 6, 8, 10 ve 12. haftalarda değerlendirildi. Parasternal kısa eksen görünümünün B modu ve M modu kayıtları Şekil 4A'da gösterilmektedir. Ekokardiyografik ölçümler ventriküler septum kalınlığı (VST), arka duvar kalınlığı (PWT) ve sol ventrikül iç boyutu (LVID) idi. Diyastol sonundaki VST, DAC kalplerinde artarken, diyastol sonundaki PWT, gözlem süresi boyunca arttı ve daha sonra azaldı, bu da ...

Tartışmalar

Bu çalışma, Tibet minipigleri için bir HFpEF modeli geliştirmek için DAC tekniklerini kullandı. Burada sedasyon, trakeal entübasyon, ven kanülasyonu, cerrahi prosedür ve ameliyat sonrası bakım dahil olmak üzere adım adım bir hayvan ve alet hazırlama protokolü sunulmaktadır. Ekokardiyografik B-mod ve M-mod kalp görüntüleri için kayıt teknikleri de sunulmaktadır. DAC'den sonra, kalpte 4. ve 6. haftalarda sol ventrikül hipertrofisi ve 8. haftadan sonra dilatasyon uygulandı. LVEF 12 haftalık süre ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbable surgical suture	Putong Jinhua Medical Co. Ltd, China	4-0
Aesthesia ventilator station	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd, China	WATO EX-35vet
Aspirator	Shanghai Baojia Medical Apparatus Co., Ltd, China	YX930D
Benzylpenicillin	Sichuan Pharmaceutical. INC, China	H5021738
Disposal endotracheal tube with cuff	Shenzhen Verybio Co., Ltd, China	20 cm, ID 0.9
Disposal transducer	Guangdong Baihe Medical Technology Co., Ltd, China
Dissection blade	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd, China
Electrocautery	Shanghai Hutong Medical Instruments (Group) Co., Ltd, China	GD350-B
Enzyme-linked immunosorbent assay ELISA kit	Cusabio Biotech Co., Ltd, China	CSB-E08594r
Eosin	Sigma-Aldrich Corp.	E4009
Flunixin meglumine	Shanghai Tongren Pharmaceutical Co., Ltd., China	Shouyaozi(2012)-090242103
Forceps	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China
Hematoxylin	Sigma-Aldrich Corp.	H3136
Isoflurane	RWD Life Science Co., Ltd, China	Veteasy for animals
Laryngoscope	Taixing Simeite Medical Apparatus and Instruments Limited Co., Ltd, China	For adults
LED surgical lights	Mingtai Medical Group, China	ZF700
Microplate reader	Thermo Fisher Scientific, USA	Multiskan FC
Microscope	Leica, Germany	DM2500
Mobile restraint unit	Customized	N/A	A mobile restraint unit, made by metal frame and wheels, with a canvas cover
Oxygen	Local suppliers, Guangzhou, China
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich Corp.	V900894
Patient monitor	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Company, China	Beneview T5
Peripheral Intravenous (IV) Catheter	Shenzhen Yima Pet Industry Development Co., Ltd., China	26G X 16 mm
Propofol	Guangdong Jiabo Phamaceutical Co., Ltd.	H20051842
Rib retractor	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China
Ruler	Deli Manufacturing Company, China
Scalpel handles	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China
Scissors (g)	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China
Suture	Medtronic-Coviden Corp.	3-0, 4-0
Ultrasonic gel	Tianjin Xiyuansi Production Institute, China	TM-100
Veterinary monitor	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Company, China	ePM12M Vet
Veterinary ultrasound system	Esatoe, Italy	MyLab30	Equiped with phased array transducer (3-8 Hz)
Xylazine hydrochloride injection	Shenda Animal Phamarceutical Co., Ltd., China	Shouyaozi(2016)-07003
Zoletil injection	Virbac, France	Zoletil 50	Tiletamine and zolazepam for injection