Un modèle chirurgical d’insuffisance cardiaque avec fraction d’éjection préservée chez les mini-porcs tibétains

Résumé

Le présent protocole décrit une procédure étape par étape pour établir un modèle mini-porc d’insuffisance cardiaque avec fraction d’éjection préservée à l’aide d’une constriction aortique descendante. Les méthodes d’évaluation de la morphologie, de l’histologie et de la fonction cardiaques de ce modèle de maladie sont également présentées.

Résumé

Plus de la moitié des cas d’insuffisance cardiaque (IC) sont classés comme insuffisance cardiaque avec fraction d’éjection préservée (HFpEF) dans le monde. Les grands modèles animaux sont limités pour étudier les mécanismes fondamentaux de l’HFpEF et identifier des cibles thérapeutiques potentielles. Ce travail fournit une description détaillée de l’intervention chirurgicale de la constriction aortique descendante (DAC) chez les mini-porcs tibétains afin d’établir un modèle animal de grande taille de HFpEF. Ce modèle utilisait une constriction contrôlée avec précision de l’aorte descendante pour induire une surcharge de pression chronique dans le ventricule gauche. L’échocardiographie a été utilisée pour évaluer les changements morphologiques et fonctionnels dans le cœur. Après 12 semaines de stress DAC, le septum ventriculaire était hypertrophique, mais l’épaisseur de la paroi postérieure était significativement réduite, accompagnée d’une dilatation du ventricule gauche. Cependant, la fraction d’éjection VG des cœurs modèles a été maintenue à >50 % au cours de la période de 12 semaines. De plus, le modèle DAC présentait des lésions cardiaques, notamment une fibrose, une inflammation et une hypertrophie cardiomyocytaire. Les taux de marqueurs de l’insuffisance cardiaque étaient significativement élevés dans le groupe DAC. Cette HFpEF induite par le DAC chez les miniporcs est un outil puissant pour l’étude des mécanismes moléculaires de cette maladie et pour les tests précliniques.

Introduction

L’insuffisance cardiaque avec fraction d’éjection préservée (HFpEF) représente plus de la moitié des cas d’insuffisance cardiaque et est devenue un problème de santé publique mondial¹. Les observations cliniques ont indiqué plusieurs caractéristiques critiques de l’HFpEF : (1) un dysfonctionnement diastolique ventriculaire, accompagné d’une rigidité systolique accrue, (2) une fraction d’éjection normale au repos avec une altération des performances physiques, et (3) un remodelage cardiaque². Les mécanismes proposés comprennent le dérèglement hormonal, l’inflammation microvasculaire systémique, les troubles métaboliques et les anomalies des protéines sarcomériques et de la matrice extracellulaire³. Cependant, des études expérimentales ont montré que l’insuffisance cardiaque avec fraction d’éjection réduite (HFrEF) provoque ces altérations. Des études cliniques ont exploré les effets thérapeutiques des inhibiteurs des récepteurs de l’angiotensine et des médicaments pour le traitement de l’HFrEF dans l’HFpEF ^4,5. Cependant, des approches thérapeutiques uniques pour l’HFpEF sont nécessaires. Par rapport à la compréhension des symptômes cliniques, les altérations de la pathologie, de la biochimie et de la biologie moléculaire de l’HFpEF restent mal définies.

Des modèles animaux de HFpEF ont été développés pour explorer les mécanismes, les marqueurs diagnostiques et les approches thérapeutiques. Les animaux de laboratoire, y compris les porcs, les chiens, les rats et les souris, peuvent développer une HFpEF, et divers facteurs de risque, notamment l’hypertension, le diabète sucré et le vieillissement, ont été sélectionnés comme facteurs d’induction ^6,7. Par exemple, l’acétate de désoxycorticostérone seul ou associé à un régime riche en graisses/sucres induit une HFpEF chez les porcs ^8,9. La surcharge de pression ventriculaire est une autre technique utilisée pour développer l’HFpEF dans des modèles animaux de grande et de petite^{taille 10}. En outre, des valeurs seuils spécifiques pour définir l’HFpEF ont été adoptées sur tous les continents ces dernières années, comme le montrent les lignes directrices de la Société européenne de cardiologie, de l’American College of Cardiology Foundation/American Heart Association¹¹, de la Japanese Circulation Society/de la Japanese Heart Failure Society¹². Ainsi, de nombreux modèles déjà établis peuvent devenir appropriés pour les études HFpEF si les critères cliniques sont adoptés. Par exemple, Youselfi et al. ont affirmé qu’une souche de souris génétiquement modifiée, Col4a3-/-, était un modèle HFpEF efficace. Cette souche a développé des symptômes cardiaques typiques de l’HFpEF, tels qu’un dysfonctionnement diastolique, un dysfonctionnement mitochondrial et un remodelage cardiaque¹³. Une étude antérieure a utilisé un régime riche en énergie pour induire un remodelage cardiaque avec un intervalle moyen de FE chez des singes âgés de¹⁴ ans, caractérisé par un trouble métabolique, une fibrose et une réduction de l’actomyosine MgATPase dans le myocarde. La constriction aortique transverse (TAC) chez la souris est l’un des modèles les plus largement utilisés pour imiter la cardiomyopathie ventriculaire induite par l’hypertension. Le ventricule gauche passe d’une hypertrophie concentrique avec une FE accrue à un remodelage dilaté avec une FE réduite^{de 15,16}. Les phénotypes de transition entre ces deux stades typiques suggèrent que la technique de constriction aortique peut être utilisée pour étudier l’HFpEF.

Les caractéristiques pathologiques, la signalisation cellulaire et les profils d’ARNm d’un modèle porcin HFpEF ont déjà été publiés¹⁷. Ici, un protocole étape par étape est présenté pour établir ce modèle et les approches pour évaluer les phénotypes de ce modèle. La procédure est illustrée à la figure 1. Brièvement, le plan chirurgical a été élaboré conjointement par le chercheur principal, les chirurgiens, les techniciens de laboratoire et le personnel de soins aux animaux. Les mini-porcs ont subi des examens de santé, y compris des tests biochimiques et une échocardiographie. Après la chirurgie, des procédures anti-inflammatoires et analgésiques ont été effectuées. L’échocardiographie, l’examen histologique et les biomarqueurs ont été utilisés pour évaluer les phénotypes.

Protocole

Toutes les études sur les animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Institut de surveillance des animaux de laboratoire du Guangdong (approbation n° d’homologation). IACUC2017009). Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément au Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (8e éd., 2011, The National Academies, États-Unis). Les animaux ont été hébergés dans une installation accréditée par l’AAALAC à l’Institut de surveillance des animaux de laboratoire du Guangdong (licence n°. SYXK (YUE) 2016-0122, Chine). Six mini-porcs tibétains mâles (n = 3 chacun pour le groupe simulé et le groupe DAC, poids de 25 à 30 kg) ont été utilisés pour développer le modèle HFpEF.

1. Préparation des animaux et des instruments

1. Acclimater les animaux à l’établissement pendant 14 jours avant la chirurgie.
2. Effectuer des examens de santé, y compris des tests biochimiques et une échocardiographie, avant la chirurgie. Exclure les animaux présentant des anomalies cardiaques de structure (dilatation ventriculaire ou hypertrophie) et de fonction (FE <50 %) conformément à la T/CALAS85-2020 Animaux de laboratoire - Lignes directrices pour l’évaluation de la santé des principaux organes, tels que le cœur, le foie, les reins et le cerveau des grands animaux de laboratoire (Association chinoise pour les sciences des animaux de laboratoire, Chine).
3. Faire jeûner les animaux pendant plus de 12 h avant l’anesthésie en ne les nourrissant pas le jour de l’opération.
4. Préparez la salle d’opération et les appareils (Figure 2). Vérifiez la station de ventilation d’esthésie, les moniteurs vétérinaires et patients, le système d’échographie vétérinaire, l’aspirateur et d’autres dispositifs chirurgicaux. Autoclaver les ciseaux, les pinces, les écarteurs, les manches de scalpel, la tête de l’aspirateur, les aiguilles chirurgicales, etc. (voir le tableau des matériaux).

2. Sédation, intubation trachéale et canulation veineuse

1. Pesez les animaux et calculez les médicaments anesthésiques. Endormir les miniporcs avec 1 mg/kg de zolétil injectable (tilétamine et zolazépam pour injection) et 0,5 mg/kg de chlorhydrate de xylazine injectable (voir le tableau des matériaux).
2. Contentez et placez les miniporcs en position couchée latérale droite sur la table d’opération. Allumez le système de chauffage pour maintenir la température corporelle des animaux.
3. Effectuez l’échocardiographie (étape 5) et prélevez 2 mL d’échantillons de sang.
4. Intuber les miniporcs à l’aide d’une sonde endotrachéale reliée à un ventilateur d’anesthésie vétérinaire (figure 3A) (voir le tableau des matériaux).
5. Amorcer la ventilation à un volume courant de 8 ml/kg et à 30 respirations/min. Maintenir les animaux avec 1,5 % à 2,5 % d’isoflurane pendant l’intervention chirurgicale.
6. Établir une canulation intraveineuse à l’aide d’un cathéter intraveineux périphérique (26 G) (voir le tableau des matériaux) à partir d’une veine de l’oreille (généralement la veine marginale de l’oreille, figure 3B).
7. Connectez l’animal à un moniteur vétérinaire.

3. Intervention chirurgicale

1. Rasez la région thoracique gauche. Appliquer 0,7 % d’iode et 75 % d’alcool pour préparer la peau de manière aseptique de l’omoplate au diaphragme (Figure 3C).
2. Placez des champs stériles sur la zone chirurgicale.
3. Administrer du propofol (5 mg/kg) (voir le tableau des matériaux) par injection intraveineuse pour maintenir l’anesthésie générale.
4. Marquez l’incision (~15 cm de long) le long du 4ème espace intercostal avant l’incision cutanée avec l’électrocautérisation.
5. Ouvrez la poitrine à l’aide d’une combinaison de cautérisation et de dissection contondante du muscle et du tissu conjonctif. Utilisez un aspirateur pour prélever le sang pendant l’opération.
6. Utilisez un écarteur de côtes pour écarter les côtes (Figure 3D).
7. Localisez le segment de l’aorte thoracique descendante et déterminez le site de constriction (Figure 3E). Utilisez deux sutures chirurgicales 3-0 pour faire deux fois le tour du segment (Figure 3F). Placez trois couches de gaze médicale entre la suture et l’aorte pour éviter d’endommager les tissus par les sutures.
8. Mettre en place des unités de mesure de pression pour déterminer le degré de constriction (Figure 3F-H).
   REMARQUE : L’unité comprend un cathéter qui perfore la paroi du vaisseau, un tube de connexion, un transducteur de pression et un moniteur patient.
9. Serrez progressivement la suture chirurgicale entourant le segment descendant de l’aorte pour obtenir le degré de constriction souhaité. Laissez les lectures de pression se stabiliser pendant 20 min et serrez définitivement les nœuds chirurgicaux.
10. Utilisez une sonde thoracique de drainage pour évacuer l’air et l’excès de liquide dans la cavité thoracique.
11. Fermez la paroi thoracique en couches, rapprochez les côtes et les muscles divisés avec des sutures résorbables.
12. Vérifiez s’il y a des saignements et assurez-vous d’une bonne hémostase.
13. Appliquez un flacon de benzylpénicilline (800 000 unités) (voir le tableau des matériaux) sur la zone opératoire après la chirurgie.
14. Surveillez la présence de clignements d’yeux et de mouvements des membres de l’animal. Débranchez le ventilateur mais laissez la sonde endotrachéale. Surveillez la présence d’une respiration spontanée.
15. Remettez l’animal dans sa chambre d’hébergement et laissez-le se réveiller automatiquement.

4. Soins post-opératoires

1. Appliquer de la benzylpénicilline quotidiennement pendant 1 semaine (20 000 U/kg).
2. Appliquer 1 mg/kg de flunixine méglumine (voir le tableau des matériaux) par jour pendant 1 semaine.
   REMARQUE : Les analgésiques opioïdes et AINS doivent être administrés en per- et postopératoire.

5. Échocardiographie transthoracique

1. Endormir l’animal avec 1 mg/kg de zolétil.
2. Placez l’animal dans une unité de contention mobile avec une housse en toile.
   REMARQUE : L’unité de contention mobile (voir le tableau des matériaux) est dotée de quatre ouvertures conçues pour étendre les membres antérieurs et postérieurs de l’animal.
3. Rasez la poitrine gauche de l’animal.
4. Placez les doigts sur le centre gauche de la poitrine pour sentir le pouls apical. Appliquez le gel ultrasonique sur la zone environnante.
5. Placez le transducteur multiéléments de l’échographe (3-8 Hz) dans le troisième espace intercostal. Déplacez le transducteur vers l’avant ou vers l’arrière et ajustez l’angle d’encoche.
6. Identifiez les oreillettes, les ventricules et l’aorte. Enregistrez les images parasternales en mode B et en mode M à grand axe.
   REMARQUE : L’image en mode B représente la section transversale du ventricule gauche au niveau du muscle papillaire, et l’image en mode M montre le mouvement du ventricule gauche au fil du temps.
7. Tournez la tête du transducteur de 90° dans le sens des aiguilles d’une montre pour obtenir la vue parasternale à court axe. Identifiez le ventricule gauche, le ventricule droit et le muscle papillaire. Enregistrez les images en mode B et en mode M.
8. Utilisez le poste de travail fourni par le fabricant de l’échographe pour évaluer la structure et la fonction cardiaques.

Résultats

Échocardiographie
La structure et la fonction cardiaques ont été évaluées aux semaines 0, 2, 4, 6, 8, 10 et 12. Les enregistrements en mode B et en mode M de la vue parasternale à court axe sont illustrés à la figure 4A. La mesure échocardiographique comprenait l’épaisseur du septum ventriculaire (VST), l’épaisseur de la paroi postérieure (PWT) et la dimension interne du ventricule gauche (LVID). La VST à la fin de la diastole a augmenté dans les cœurs ...

Discussion

Cette étude a utilisé les techniques DAC pour développer un modèle HFpEF pour les mini-porcs tibétains. Un protocole étape par étape de préparation de l’animal et de l’instrument est présenté ici, y compris la sédation, l’intubation trachéale, la canulation veineuse, l’intervention chirurgicale et les soins post-opératoires. Les techniques d’enregistrement des images cardiaques échocardiographiques en mode B et en mode M sont également présentées. Après le DAC, le cœur a subi une hypertrophie...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbable surgical suture	Putong Jinhua Medical Co. Ltd, China	4-0
Aesthesia ventilator station	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd, China	WATO EX-35vet
Aspirator	Shanghai Baojia Medical Apparatus Co., Ltd, China	YX930D
Benzylpenicillin	Sichuan Pharmaceutical. INC, China	H5021738
Disposal endotracheal tube with cuff	Shenzhen Verybio Co., Ltd, China	20 cm, ID 0.9
Disposal transducer	Guangdong Baihe Medical Technology Co., Ltd, China
Dissection blade	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd, China
Electrocautery	Shanghai Hutong Medical Instruments (Group) Co., Ltd, China	GD350-B
Enzyme-linked immunosorbent assay ELISA kit	Cusabio Biotech Co., Ltd, China	CSB-E08594r
Eosin	Sigma-Aldrich Corp.	E4009
Flunixin meglumine	Shanghai Tongren Pharmaceutical Co., Ltd., China	Shouyaozi(2012)-090242103
Forceps	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China
Hematoxylin	Sigma-Aldrich Corp.	H3136
Isoflurane	RWD Life Science Co., Ltd, China	Veteasy for animals
Laryngoscope	Taixing Simeite Medical Apparatus and Instruments Limited Co., Ltd, China	For adults
LED surgical lights	Mingtai Medical Group, China	ZF700
Microplate reader	Thermo Fisher Scientific, USA	Multiskan FC
Microscope	Leica, Germany	DM2500
Mobile restraint unit	Customized	N/A	A mobile restraint unit, made by metal frame and wheels, with a canvas cover
Oxygen	Local suppliers, Guangzhou, China
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich Corp.	V900894
Patient monitor	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Company, China	Beneview T5
Peripheral Intravenous (IV) Catheter	Shenzhen Yima Pet Industry Development Co., Ltd., China	26G X 16 mm
Propofol	Guangdong Jiabo Phamaceutical Co., Ltd.	H20051842
Rib retractor	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China
Ruler	Deli Manufacturing Company, China
Scalpel handles	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China
Scissors (g)	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China
Suture	Medtronic-Coviden Corp.	3-0, 4-0
Ultrasonic gel	Tianjin Xiyuansi Production Institute, China	TM-100
Veterinary monitor	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Company, China	ePM12M Vet
Veterinary ultrasound system	Esatoe, Italy	MyLab30	Equiped with phased array transducer (3-8 Hz)
Xylazine hydrochloride injection	Shenda Animal Phamarceutical Co., Ltd., China	Shouyaozi(2016)-07003
Zoletil injection	Virbac, France	Zoletil 50	Tiletamine and zolazepam for injection