티베트 Minipigs에서 박출률이 보존된 심부전의 수술 모델

요약

본 프로토콜은 하행 대동맥 수축을 사용하여 박출률이 보존된 심부전의 minipig 모델을 확립하기 위한 단계별 절차를 설명합니다. 이 질병 모델의 심장 형태, 조직학 및 기능을 평가하는 방법도 제시됩니다.

초록

전 세계적으로 심부전(HF) 사례의 절반 이상이 박출률이 보존된 심부전(HFpEF)으로 분류됩니다. 대형 동물 모델은 HFpEF의 기본 메커니즘을 조사하고 잠재적인 치료 표적을 식별하는 데 한계가 있습니다. 이 연구는 HFpEF의 대형 동물 모델을 확립하기 위해 티베트 미니피그에서 하행 대동맥 수축(DAC)의 수술 절차에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 이 모델은 좌심실의 만성 압력 과부하를 유도하기 위해 하행 대동맥의 정밀하게 제어된 수축을 사용했습니다. 심장초음파는 심장의 형태학적, 기능적 변화를 평가하기 위해 사용되었다. 12주간의 DAC 스트레스 후, 심실 중격은 비대되었지만, 좌심실의 확장과 함께 후벽의 두께가 현저히 감소했습니다. 그러나 모델 하트의 LV 박출률은 12주 동안 >50%로 유지되었습니다. 또한 DAC 모델은 섬유증, 염증 및 심근 세포 비대를 포함한 심장 손상을 나타냈습니다. 심부전 표지자 수치는 DAC 그룹에서 유의하게 상승했습니다. 미니피그에서 이 DAC 유도 HFpEF는 이 질병의 분자 메커니즘을 조사하고 전임상 테스트를 위한 강력한 도구입니다.

서문

박출률이 보존된 심부전(HFpEF)은 심부전 사례의 절반 이상을 차지하며 전 세계 공중 보건 문제가 되었습니다¹. 임상 관찰에 따르면 HFpEF의 몇 가지 중요한 특징은 (1) 수축기 경직 증가를 동반하는 심실 이완기 기능 장애, (2) 운동 수행 능력 저하와 함께 안정 시 정상 박출률, (3) 심장 리모델링². 제안된 기전으로는 호르몬 조절 장애, 전신 미세혈관 염증, 대사 장애, 육종 및 세포외 기질 단백질의 이상이 있다³. 그러나 실험 연구에 따르면 박출률이 감소한 심부전(HFrEF)이 이러한 변화를 유발하는 것으로 나타났습니다. 임상 연구는 HFpEF ^4,5에서 HFrEF를 치료하기 위한 안지오텐신 수용체 억제제 및 약물의 치료 효과를 탐구했습니다. 그러나 HFpEF에 대한 독특한 치료법이 필요합니다. 임상 증상을 이해하는 것과 비교할 때 HFpEF의 병리학, 생화학 및 분자 생물학의 변화는 여전히 제대로 정의되지 않았습니다.

HFpEF의 동물 모델은 메커니즘, 진단 마커 및 치료 접근법을 탐구하기 위해 개발되었습니다. 돼지, 개, 쥐, 생쥐 등 실험동물에서 HFpEF가 발생할 수 있으며, 고혈압, 당뇨병, 노화 등 다양한 위험인자를 유도인자로 선정하였다 ^6,7. 예를 들어, 디옥시코르티코스테론 아세테이트를 단독으로 또는 고지방/설탕 식단과 병행하면 돼지 ^8,9에서 HFpEF를 유도할 수 있습니다. 심실 압력 과부하는 크고 작은 동물 모델에서 HFpEF를 개발하는 데 사용되는 또 다른 기술이다¹⁰. 또한, 유럽 심장학회 가이드라인, 미국 심장학회/미국 심장 협회(American College of Cardiology Foundation)/미국 심장 협회(American Heart Association)¹¹, 일본 순환 학회(Japanese Circulation Society)/일본 심부전 학회(Japanese Heart Failure Society^{) 12}에서 볼 수 있듯이 HFpEF를 정의하기 위한 특정 EF 컷오프 값이 최근 몇 년 동안 대륙 전반에 걸쳐 채택되었습니다. 따라서 임상 기준이 채택되면 이전에 확립된 많은 모델이 HFpEF 연구에 적합해질 수 있습니다. 예를 들어, Youselfi et al.은 유전자 변형 마우스 균주인 Col4a3-/-가 효과적인 HFpEF 모델이라고 주장했습니다. 이 균주는 이완기 기능 장애, 미토콘드리아 기능 장애 및 심장 리모델링과 같은 전형적인 HFpEF 심장 증상을 일으켰다¹³. 이전 연구에서는 대사 장애, 섬유증 및 심근 내 액토미오신 MgATPase 감소를 특징으로 하는¹⁴세 원숭이에서 중간 범위의 EF로 심장 리모델링을 유도하기 위해 고에너지 식단을 사용했습니다. 마우스 횡방향 대동맥 수축(TAC)은 고혈압 유발 심실 심근병증을 모방하기 위해 가장 널리 사용되는 모델 중 하나입니다. 좌심실은 EF가 증가한 동심원 비대에서 EF^15,16이 감소한 확장 리모델링으로 진행됩니다. 이 두 가지 전형적인 단계 사이의 전이 표현형은 대동맥 수축 기법을 사용하여 HFpEF를 연구할 수 있음을 시사합니다.

돼지 HFpEF 모델의 병리학적 특징, 세포 신호 전달 및 mRNA 프로파일은 이전에 발표된 바^{있습니다 17}. 여기에서는 이 모델과 이 모델의 표현형을 평가하기 위한 접근 방식을 설정하기 위한 단계별 프로토콜을 제시합니다. 이 절차는 그림 1에 나와 있습니다. 간단히 말해서, 수술 계획은 수석 연구자, 외과의, 실험실 기술자 및 동물 관리 직원이 공동으로 만들었습니다. 미니피그는 생화학 검사와 심장 초음파 검사를 포함한 건강 검진을 받았다. 수술 후에는 항염증 및 진통 시술을 실시하였다. 심장 초음파, 조직학적 검사 및 바이오마커를 사용하여 표현형을 평가했습니다.

프로토콜

모든 동물 연구는 광둥성 실험동물모니터링연구소(Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute)의 기관 동물 관리 및 이용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. IACUC2017009). 모든 동물 실험은 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (8th Ed., 2011, The National Academies, USA)에 따라 수행되었습니다. 이 동물들은 광둥성 실험동물감시연구소(Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute)의 AAALAC 인증 시설에 수용되었다. SYXK (YUE) 2016-0122, 중국). 6마리의 수컷 티베트 미니피그(가짜 그룹과 DAC 그룹 각각 n = 3, 체중 25-30kg)를 사용하여 HFpEF 모델을 개발했습니다.

1. 동물 및 기구 준비

1. 수술 전 14일 동안 동물을 시설에 적응시킵니다.
2. 수술 전에 생화학 검사 및 심장 초음파를 포함한 건강 검진을 실시합니다. T/CALAS85-2020 Laboratory animals - Guidelines for the health assessment of major organs, such as the heart, liver, kidney, and brain(Chinese Association for Laboratory Animal Sciences, China)에 따라 구조(심실 확장 또는 비대) 및 기능(EF <50%)에 심장 이상이 있는 동물을 제외합니다.
3. 마취 전에 12시간 이상 동물을 단식시켜 수술 당일에 먹이를 주지 마십시오.
4. 수술실과 장치를 준비합니다(그림 2). 마취 인공호흡기 스테이션, 수의학 및 환자 모니터, 수의학 초음파 시스템, 흡인기 및 기타 수술 장치를 확인하십시오. 가위, 집게, 견인기, 메스 손잡이, 흡입기 헤드, 수술용 바늘 등을 오토클레이브합니다( 재료 표 참조).

2. 진정, 기관 삽관 및 정맥 캐뉼레이션

1. 동물의 무게를 측정하고 마취제를 계산합니다. 졸레틸 주사 1mg/kg(주사용 틸레타민 및 졸라제팜)과 자일라진 염산염 주사 0.5mg/kg으로 미니피그를 진정시킵니다( 재료 표 참조).
2. 미니피그를 고정하고 수술 테이블의 오른쪽 측면 누운 위치에 놓습니다. 동물의 체온을 유지하기 위해 난방 시스템을 켜십시오.
3. 심장 초음파(5단계)를 수행하고 2mL의 혈액 샘플을 수집합니다.
4. 수의학 마취 인공호흡기 스테이션(그림 3A)에 연결된 기관내 튜브로 미니피그를 삽관합니다( 재료 표 참조).
5. 8mL/kg의 일회 호흡량과 분당 30회 호흡으로 환기를 시작합니다. 수술 과정에서 1.5%-2.5%의 이소플루란으로 동물을 유지하십시오.
6. 귀 정맥(일반적으로 가장자리 귀 정맥, 그림 3B)에서 말초 정맥 카테터(26G)(재료 표 참조)를 사용하여 정맥 캐뉼레이션을 설정합니다.
7. 동물을 수의학 모니터에 연결하십시오.

3. 수술 절차

1. 왼쪽 흉부를 면도합니다. 0.7%의 요오드와 75%의 알코올을 도포하여 견갑골에서 횡격막까지 피부를 무균 상태로 준비합니다(그림 3C).
2. 수술 부위에 멸균 커튼을 놓습니다.
3. 프로포폴(5mg/kg)( 자료표 참조)을 정맥 주사로 투여하여 전신 마취를 유지합니다.
4. 전기소작으로 피부를 절개하기 전에 4번째 늑간을 따라 절개부(~15cm 길이)를 표시합니다.
5. 소작과 근육 및 결합 조직의 둔기 해부를 조합하여 흉부를 엽니다. 수술 중 흡인기로 혈액을 제거하십시오.
6. 리브 리트랙터를 사용하여 리브를 펼칩니다(그림 3D).
7. 흉부 하행 대동맥 세그먼트를 찾아 수축 부위를 결정합니다(그림 3E). 두 개의 3-0 수술용 봉합사를 사용하여 세그먼트 주위를 두 번 감습니다(그림 3F). 봉합사에 의한 조직 손상을 방지하기 위해 봉합사와 대동맥 사이에 의료용 거즈를 3겹 끼웁니다.
8. 수축 정도를 결정하기 위해 압력 측정 단위를 설정합니다(그림 3F-H).
   알림: 이 장치에는 혈관 벽에 구멍을 뚫는 카테터, 연결 튜브, 압력 변환기 및 환자 모니터가 포함되어 있습니다.
9. 하행 대동맥 분절을 둘러싼 수술용 봉합사를 서서히 조여 원하는 수축 정도를 얻습니다. 압력 판독값이 20분 동안 안정화되도록 하고 수술 매듭을 영구적으로 조입니다.
10. 배액 흉관을 사용하여 흉강의 공기와 과도한 체액을 배출합니다.
11. 흉벽을 여러 겹으로 닫고 흡수성 봉합사로 갈비뼈와 분할된 근육을 근사화합니다.
12. 출혈이 있는지 확인하고 지혈이 잘 되었는지 확인하십시오.
13. 수술 후 수술 부위에 벤질페니실린 한 병(800,000 단위)( 재료 표 참조)을 바릅니다.
14. 동물의 눈 깜박임과 팔다리 움직임의 존재를 모니터링합니다. 인공호흡기를 분리하되 기관내 튜브는 그대로 둡니다. 자발적인 호흡의 존재를 모니터링하십시오.
15. 동물을 사육실로 돌려보내고 자동으로 깨어나도록 놔둔다.

4. 수술 후 관리

1. 벤질페니실린을 1주일(20,000U/kg) 동안 매일 바릅니다.
2. 1주일 동안 매일 1mg/kg의 플루니신 메글루민( 재료 표 참조)을 적용합니다.
   참고: 오피오이드 및 NSAID 진통제는 수술 중 및 수술 후에 투여해야 합니다.

5. 경흉부 심장 초음파

1. 졸레틸 1mg/kg으로 동물을 진정시킵니다.
2. 캔버스 덮개가 있는 이동식 안전 장치에 동물을 놓습니다.
   알림: 이동식 고정 장치( 재료 표 참조)에는 동물의 앞다리와 뒷다리를 확장하도록 설계된 4개의 구멍이 있습니다.
3. 동물의 왼쪽 가슴을 면도하십시오.
4. 가슴의 왼쪽 중앙에 손가락을 대고 정점 맥박을 느낍니다. 초음파 젤을 주변 부위에 바릅니다.
5. 초음파 시스템의 위상 배열 변환기(3-8Hz)를 세 번째 늑간 공간에 놓습니다. 변환기를 전방 또는 후방 방향으로 이동하고 노치 각도를 조정합니다.
6. 심방, 심실 및 대동맥을 식별합니다. B-모드 및 M-모드 흉골 주위 장축 이미지를 기록합니다.
   참고: B-모드 이미지는 유두근 수준에서 좌심실의 단면을 나타내고 M-모드 이미지는 시간 경과에 따른 좌심실의 움직임을 보여줍니다.
7. 변환기 헤드를 시계 방향으로 90° 돌려 parasternal short-axis view. 좌심실, 우심실, 유두근을 확인합니다. B-모드 및 M-모드 이미지를 기록합니다.
8. 초음파 시스템 제조업체에서 제공하는 워크스테이션을 사용하여 심장 구조와 기능을 평가하십시오.

결과

심초음파검사
심장 구조 및 기능은 0주, 2주, 4주, 6주, 8주, 10주 및 12주에 평가되었습니다. 흉골 단축 보기의 B-모드 및 M-모드 기록은 그림 4A에 표시되어 있습니다. 심초음파 측정에는 심실 중격 두께(VST), 후벽 두께(PWT) 및 좌심실 내부 치수(LVID)가 포함되었습니다. 말단 이완기의 VST는 DAC 심장에서 증가한 반면, 말단 이완기의 PWT는 관찰 기간 동안 증가했다가 감...

토론

이 연구는 DAC 기술을 사용하여 티베트 미니피그를 위한 HFpEF 모델을 개발했습니다. 진정, 기관 삽관, 정맥 캐뉼레이션, 수술 절차 및 수술 후 관리를 포함한 단계별 동물 및 기구 준비 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다. 심장 초음파 B-모드 및 M-모드 심장 영상에 대한 기록 기술도 제시됩니다. DAC 후 심장은 4주차와 6주차에 좌심실 비대를 겪었고 8주차 후에는 확장을 겪었습니다. LVEF는 12주 동안...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbable surgical suture	Putong Jinhua Medical Co. Ltd, China	4-0
Aesthesia ventilator station	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd, China	WATO EX-35vet
Aspirator	Shanghai Baojia Medical Apparatus Co., Ltd, China	YX930D
Benzylpenicillin	Sichuan Pharmaceutical. INC, China	H5021738
Disposal endotracheal tube with cuff	Shenzhen Verybio Co., Ltd, China	20 cm, ID 0.9
Disposal transducer	Guangdong Baihe Medical Technology Co., Ltd, China
Dissection blade	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd, China
Electrocautery	Shanghai Hutong Medical Instruments (Group) Co., Ltd, China	GD350-B
Enzyme-linked immunosorbent assay ELISA kit	Cusabio Biotech Co., Ltd, China	CSB-E08594r
Eosin	Sigma-Aldrich Corp.	E4009
Flunixin meglumine	Shanghai Tongren Pharmaceutical Co., Ltd., China	Shouyaozi(2012)-090242103
Forceps	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China
Hematoxylin	Sigma-Aldrich Corp.	H3136
Isoflurane	RWD Life Science Co., Ltd, China	Veteasy for animals
Laryngoscope	Taixing Simeite Medical Apparatus and Instruments Limited Co., Ltd, China	For adults
LED surgical lights	Mingtai Medical Group, China	ZF700
Microplate reader	Thermo Fisher Scientific, USA	Multiskan FC
Microscope	Leica, Germany	DM2500
Mobile restraint unit	Customized	N/A	A mobile restraint unit, made by metal frame and wheels, with a canvas cover
Oxygen	Local suppliers, Guangzhou, China
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich Corp.	V900894
Patient monitor	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Company, China	Beneview T5
Peripheral Intravenous (IV) Catheter	Shenzhen Yima Pet Industry Development Co., Ltd., China	26G X 16 mm
Propofol	Guangdong Jiabo Phamaceutical Co., Ltd.	H20051842
Rib retractor	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China
Ruler	Deli Manufacturing Company, China
Scalpel handles	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China
Scissors (g)	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China
Suture	Medtronic-Coviden Corp.	3-0, 4-0
Ultrasonic gel	Tianjin Xiyuansi Production Institute, China	TM-100
Veterinary monitor	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Company, China	ePM12M Vet
Veterinary ultrasound system	Esatoe, Italy	MyLab30	Equiped with phased array transducer (3-8 Hz)
Xylazine hydrochloride injection	Shenda Animal Phamarceutical Co., Ltd., China	Shouyaozi(2016)-07003
Zoletil injection	Virbac, France	Zoletil 50	Tiletamine and zolazepam for injection