チベットミニブタの駆出率が保たれた心不全の外科的モデル

要約

本プロトコルは、下行大動脈狭窄を使用して駆出率を維持した心不全のミニブタモデルを確立するための段階的な手順を記述する。また、この疾患モデルの心臓の形態、組織型、および機能を評価する方法も紹介します。

要約

心不全(HF)症例の半数以上は、世界中で駆出率保持型心不全(HFpEF)に分類されています。HFpEFの基本的なメカニズムを調査し、潜在的な治療標的を特定するための大型動物モデルは限られています。この研究は、HFpEFの大型動物モデルを確立するために、チベットのミニブタにおける下行大動脈狭窄(DAC)の外科的処置の詳細な説明を提供します。このモデルは、下行大動脈の狭窄を正確に制御して、左心室の慢性的な圧力過負荷を誘発しました。心エコー検査は、心臓の形態学的および機能的変化を評価するために使用されました。DACストレスの12週間後、心室中隔は肥大したが、左心室の拡張を伴って後壁の厚さは有意に減少した。しかし、モデル心臓のLV駆出率は、12週間の間、>50%に維持された。さらに、DACモデルでは、線維化、炎症、心筋細胞肥大などの心臓障害が認められました。心不全マーカーレベルはDAC群で有意に上昇した。このDAC誘導性HFpEFは、この疾患の分子メカニズムの調査や前臨床試験のための強力なツールです。

概要

駆出率が保たれた心不全(HFpEF)は、心不全症例の半数以上を占めており、世界的な公衆衛生上の問題となっています¹。臨床観察では、HFpEFのいくつかの重要な特徴が示されています:(1)収縮期硬化の増加を伴う心室拡張期機能障害、(2)運動能力の低下を伴う安静時の正常駆出率、および(3)心臓リモデリング²。提案されたメカニズムには、ホルモン調節不全、全身性微小血管炎症、代謝障害、およびサルコメアおよび細胞外マトリックスタンパク質の異常^{が含まれます3。}しかし、実験的研究は、駆出率の低下を伴う心不全(HFrEF)がこれらの変化を引き起こすことを示しています。臨床研究では、アンジオテンシン受容体阻害剤とHFpEFのHFrEF治療薬の治療効果が調査されています^4,5。しかし、HFpEFには独自の治療法が必要です。臨床症状の理解と比較すると、HFpEFの病理学、生化学、および分子生物学の変化は十分に定義されていません。

HFpEFの動物モデルは、そのメカニズム、診断マーカー、および治療アプローチを探求するために開発されています。ブタ、イヌ、ラット、マウスなどの実験動物はHFpEFを発症する可能性があり、高血圧、糖尿病、老化など多様な危険因子を誘導因子として選択しました^6,7。例えば、酢酸デオキシコルチコステロン単独または高脂肪/高糖質飼料と組み合わせると、豚にHFpEFが誘導されます^8,9。心室圧過負荷は、大動物および小動物モデルでHFpEFを発症するために使用される別の技術です¹⁰。また、欧州心臓病学会のガイドライン、米国心臓病学会財団/米国心臓協会¹¹、日本循環器学会/日本心不全学会¹²に見られるように、近年、HFpEFを定義するための特定のEFカットオフ値が大陸を超えて採用されています。したがって、臨床基準が採用されれば、以前に確立された多くのモデルがHFpEF研究に適している可能性があります。例えば、Youselfiらは、遺伝子改変マウス系統Col4a3-/-が有効なHFpEFモデルであると主張した。この株は、拡張期機能障害、ミトコンドリア機能障害、心臓リモデリングなどの典型的なHFpEF心臓症状を発症した¹³。以前の研究では、高エネルギー食を使用して、代謝障害、線維症、および心筋のアクトミオシンMgATPaseの減少を特徴とする高齢のサル¹⁴で中程度のEFによる心臓リモデリングを誘発しました。マウス横大動脈狭窄術(TAC)は、高血圧誘発性心室性心筋症を模倣するために最も広く使用されているモデルの1つです。左心室は、EFの増加を伴う同心円状の肥大から、^EF15,16の減少を伴う拡張型リモデリングへと進行する。これら2つの典型的な病期の間の移行表現型は、大動脈狭窄法を使用してHFpEFを研究できることを示唆しています。

ブタHFpEFモデルの病理学的特徴、細胞シグナル伝達、およびmRNAプロファイルは、以前に発表されています¹⁷。ここでは、このモデルを確立するためのステップバイステップのプロトコルと、このモデルの表現型を評価するためのアプローチを示します。この手順を 図 1 に示します。簡単に言うと、手術計画は、主任研究者、外科医、検査技師、および動物ケアスタッフによって共同で作成されました。ミニブタは、生化学検査や心エコー検査などの健康診断を受けました。手術後、抗炎症薬と鎮痛薬の処置が行われました。心エコー検査、組織学的検査、およびバイオマーカーを使用して表現型を評価しました。

プロトコル

すべての動物実験は、広東省実験動物モニタリング研究所の動物管理および使用委員会によって承認されました。IACUC2017009)です。すべての動物実験は、実験動物のケアと使用に関するガイド(第8版、2011年、米国国立アカデミー)に従って実施されました。動物は、広東省実験動物監視研究所(ライセンス番号)のAAALAC認定施設に収容されました。SYXK (YUE) 2016-0122, 中国)。6匹のオスのチベットミニブタ(偽群とDAC群でそれぞれn=3匹、体重25〜30kg)を使用してHFpEFモデルを開発しました。

1.動物と器具の準備

1. 手術前の14日間、動物を施設に順応させます。
2. 手術前に生化学検査や心エコー検査などの健康診断を行ってください。T/CALAS85-2020 実験動物 - 大型実験動物の心臓、肝臓、腎臓、脳などの主要臓器の健康評価に関するガイドライン (中国実験動物科学協会、中国) に従って、構造 (心室拡張または肥大) および機能 (EF <50%) の心臓異常のある動物を除外します。
3. 手術当日は給餌しないことで、麻酔前に12時間以上絶食します。
4. 手術室とデバイスを準備します(図2)。麻酔人工呼吸器ステーション、獣医および患者モニター、獣医超音波システム、吸引器、およびその他の手術器具を確認してください。はさみ、鉗子、リトラクター、メスのハンドル、吸引器の頭、手術針などをオートクレーブします( 材料表を参照)。

2.鎮静、気管挿管、静脈カニューレ挿入

1. 動物の体重を量り、麻酔薬を計算します。1 mg / kgのゾレチル注射(注射用のチレタミンとゾラゼパム)と0.5 mg / kgの塩酸キシラジン注射でミニブタを鎮静させます( 材料表を参照)。
2. ミニピグを拘束し、手術台の右横臥位に置きます。動物の体温を維持するために暖房システムをオンにします。
3. 心エコー検査(ステップ5)を行い、2mLの血液サンプルを採取します。
4. 獣医用麻酔人工呼吸器ステーションに接続された気管内チューブでミニブタを挿管します(図3A)( 材料表を参照)。
5. 8 mL / kgの一回換気量と30回の呼吸/分で換気を開始します。外科的処置中は、1.5%〜2.5%のイソフルランで動物を維持します。
6. 耳の静脈(通常は辺縁の耳静脈、図3B)から末梢静脈内カテーテル(26 G)(材料表を参照)を使用して静脈内カニューレ挿入を確立します。
7. 動物を獣医モニターに接続します。

3.外科的処置

1. 左胸部を剃ります。0.7%のヨウ素と75%のアルコールを塗布して、肩甲骨から横隔膜までの皮膚を無菌的に準備します(図3C)。
2. 手術部位に滅菌ドレープを置きます。
3. 全身麻酔を維持するために、プロポフォール(5 mg / kg)( 材料表を参照)を静脈内注射で投与します。.
4. 電気焼灼による皮膚切開の前に、第4肋間腔に沿って切開(~15cm)に印を付けます。
5. 焼灼と筋肉と結合組織の鈍的解剖を組み合わせて胸を開きます。手術中は吸引器を使用して血液を抜いてください。
6. リブリトリトラクターを使用してリブを広げます(図3D)。
7. 胸部下行大動脈セグメントの位置を特定し、狭窄部位を決定します(図3E)。2つの3-0外科用縫合糸を使用して、セグメントを2回ループさせます(図3F)。縫合糸と大動脈の間に医療用ガーゼを3層重ねて、縫合による組織の損傷を防ぎます。
8. 収縮の程度を決定するための圧力測定ユニットを設定します(図3F-H)。
   注:このユニットには、血管壁に穴を開けるカテーテル、接続チューブ、圧力トランスデューサー、および患者モニターが含まれています。
9. 下行する大動脈セグメントを囲む外科的縫合糸を徐々に締めて、目的の収縮度を達成します。圧力測定値を20分間安定させ、外科用結び目を恒久的に締めます。
10. ドレナージ胸腔チューブを使用して、胸腔内の空気と余分な液体を排出します。
11. 胸壁を層状に閉じ、吸収性縫合糸で肋骨と分割された筋肉を再近似します。
12. 出血がないか確認し、止血が良好であることを確認してください。
13. ベンジルペニシリン(800,000単位)( 材料表を参照)のボトルを手術後の手術部位に塗布します。
14. 動物のまばたきと手足の動きの存在を監視します。人工呼吸器を外しますが、気管内チューブは残します。自発呼吸の存在を監視します。
15. 動物を飼育室に戻し、自動的に目を覚ますのを待っておきます。

4. 術後のケア

1. ベンジルペニシリンを毎日1週間(20,000 U / kg)塗布します。.
2. 1 mg / kgのフルニキシンメグルミン( 材料表を参照)を毎日1週間適用します。.
   注:オピオイドおよびNSAID鎮痛薬は、術中および術後に投与する必要があります。.

5.経胸壁心エコー検査

1. 1 mg / kgのゾレチルで動物を鎮静させます。.
2. 動物をキャンバスカバー付きの移動式拘束ユニットに入れます。
   注意: 移動式拘束ユニット( 資料表を参照)には、動物の前肢と後肢を伸ばすように設計された4つの開口部があります。
3. 動物の左胸を剃ります。
4. 胸の左中央に指を置き、頂端の脈を感じます。超音波ジェルを周囲に塗布します。
5. 超音波システムのフェーズドアレイトランスデューサ(3〜8 Hz)を3番目の肋間腔に配置します。トランスデューサーを前後方向に動かし、ノッチ角度を調整します。
6. 心房、心室、大動脈を特定します。BモードおよびMモードの胸骨傍長軸画像を記録します。
   注:Bモード画像は乳頭筋レベルでの左心室の断面を表し、Mモード画像は時間の経過に伴う左心室の動きを示しています。
7. トランスデューサーヘッドを時計回りに90°回して、胸骨傍の短軸ビューを取得します。左心室、右心室、乳頭筋を特定します。BモードとMモードの画像を記録します。
8. 超音波システムの製造元が提供するワークステーションを使用して、心臓の構造と機能を評価します。

結果

心エコー検査
心臓の構造と機能は、0、2、4、6、8、10、および12週で評価されました。胸骨傍短軸図のBモードおよびMモードの記録を図4Aに示す。心エコー検査の測定には、心室中隔の厚さ (VST)、後壁の厚さ (PWT)、および左心室の内寸 (LVID) が含まれていました。DAC心臓では拡張末期のVSTが増加し、拡張末期のPWTは観察期間中に増加し、その後減少したこと?...

ディスカッション

本研究では、DAC技術を用いて、チベットミニブタのHFpEFモデルを開発しました。ここでは、鎮静、気管挿管、静脈カニューレ挿入、外科的処置、術後ケアなど、動物および器具の準備手順を段階的に説明します。また、心エコー検査のBモードおよびMモードの心臓画像の記録技術についても紹介します。DAC後、心臓は4週目と6週目に左心室肥大を起こし、8週目以降に拡張しました。LVEFは12週間...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbable surgical suture	Putong Jinhua Medical Co. Ltd, China	4-0
Aesthesia ventilator station	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd, China	WATO EX-35vet
Aspirator	Shanghai Baojia Medical Apparatus Co., Ltd, China	YX930D
Benzylpenicillin	Sichuan Pharmaceutical. INC, China	H5021738
Disposal endotracheal tube with cuff	Shenzhen Verybio Co., Ltd, China	20 cm, ID 0.9
Disposal transducer	Guangdong Baihe Medical Technology Co., Ltd, China
Dissection blade	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd, China
Electrocautery	Shanghai Hutong Medical Instruments (Group) Co., Ltd, China	GD350-B
Enzyme-linked immunosorbent assay ELISA kit	Cusabio Biotech Co., Ltd, China	CSB-E08594r
Eosin	Sigma-Aldrich Corp.	E4009
Flunixin meglumine	Shanghai Tongren Pharmaceutical Co., Ltd., China	Shouyaozi(2012)-090242103
Forceps	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China
Hematoxylin	Sigma-Aldrich Corp.	H3136
Isoflurane	RWD Life Science Co., Ltd, China	Veteasy for animals
Laryngoscope	Taixing Simeite Medical Apparatus and Instruments Limited Co., Ltd, China	For adults
LED surgical lights	Mingtai Medical Group, China	ZF700
Microplate reader	Thermo Fisher Scientific, USA	Multiskan FC
Microscope	Leica, Germany	DM2500
Mobile restraint unit	Customized	N/A	A mobile restraint unit, made by metal frame and wheels, with a canvas cover
Oxygen	Local suppliers, Guangzhou, China
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich Corp.	V900894
Patient monitor	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Company, China	Beneview T5
Peripheral Intravenous (IV) Catheter	Shenzhen Yima Pet Industry Development Co., Ltd., China	26G X 16 mm
Propofol	Guangdong Jiabo Phamaceutical Co., Ltd.	H20051842
Rib retractor	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China
Ruler	Deli Manufacturing Company, China
Scalpel handles	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China
Scissors (g)	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China
Suture	Medtronic-Coviden Corp.	3-0, 4-0
Ultrasonic gel	Tianjin Xiyuansi Production Institute, China	TM-100
Veterinary monitor	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Company, China	ePM12M Vet
Veterinary ultrasound system	Esatoe, Italy	MyLab30	Equiped with phased array transducer (3-8 Hz)
Xylazine hydrochloride injection	Shenda Animal Phamarceutical Co., Ltd., China	Shouyaozi(2016)-07003
Zoletil injection	Virbac, France	Zoletil 50	Tiletamine and zolazepam for injection