成年绵羊模型中自体心包经导管肺动脉瓣置换术，使用自扩展镍钛诺支架

摘要

本研究证明了通过在成年绵羊模型中使用自膨胀镍钛诺支架来开发自体肺动脉瓣植入原体肺动脉瓣位置的可行性和安全性。这是为右心室流出道功能障碍患者开发经导管肺动脉瓣置换术的一步。

摘要

经导管肺动脉瓣置换术已被确立为右心室流出道或生物人工瓣膜功能障碍患者的可行替代方法，具有良好的早期和晚期临床结局。然而，必须解决诸如支架式心脏瓣膜恶化、冠状动脉阻塞、心内膜炎和其他并发症等临床挑战，以终生应用，特别是在儿科患者中。为了促进为患者开发终身解决方案，在成年绵羊模型中进行了经导管自体肺动脉瓣置换术。自体心包在通气麻醉下 ，通过 左前外侧切开术从绵羊身上收获。将心包置于3D定形心脏瓣膜模型上进行无毒交联2天21 h。进行心内超声心动图（ICE）和血管造影以评估天然肺动脉瓣（NPV）的位置，形态，功能和尺寸。修剪后，将交联的心包缝合到可自膨胀的镍钛诺支架上，并压接到自我设计的输送系统中。 通过 左颈静脉导管插入术将自体肺动脉瓣（APV）植入NPV位置。重复ICE和血管造影以评估APV的位置，形态，功能和尺寸。APV成功植入绵羊J体内。本文选取绵羊J获得具有代表性的结果。将带有镍钛诺支架的30 mm APV精确植入NPV位置，无任何显着的血流动力学变化。无瓣膜旁渗漏、无新发肺动脉瓣功能不全或肺动脉瓣移位移。该研究在长期随访中证明了在成年绵羊模型中 开发 一种用于在NPV位置植入自膨胀镍钛诺支架的可行性和安全性。

引言

朋霍费尔等人¹ 标志着2000年经导管肺动脉瓣置换术（TPVR）的开始，这是一项快速创新，在尽量减少并发症和提供替代治疗方法方面取得了重大进展。此后，使用TPVR治疗右心室流出道（RVOT）或生物假体瓣膜功能障碍迅速增加^2，3。迄今为止，目前市场上可用的TPVR设备已经为RVOT功能障碍患者提供了令人满意的长期和短期结果^4，5，6。此外，正在开发和评估各种类型的TPVR瓣膜，包括去细胞心脏瓣膜和干细胞驱动的心脏瓣膜，其可行性已在临床前大型动物模型^7，8中得到证明。Duran博士首次报道了使用自体心包进行主动脉瓣重建，其中以三个不同大小的连续凸起为模板，根据主动脉环的尺寸指导心包的形成，随访60^个月9时存活率为84.53%。Ozaki手术被认为是瓣膜修复程序而不是瓣膜置换程序，涉及用戊二醛处理的自体心包替换主动脉瓣叶;然而，与Duran博士的程序相比，它在用模板测量患病瓣膜以切割固定心包¹⁰ 方面显着改善，并且不仅从成人病例中获得了令人满意的结果，而且在儿科病例¹¹中也取得了令人满意的结果。目前，只有Ross手术可以为患有主动脉瓣疾病的患者提供活瓣替代品，在避免长期抗凝，生长潜力和心内膜炎¹²风险低方面具有明显优势。但是，在如此复杂的外科手术后，肺自体移植物和右心室至肺动脉导管可能需要重新干预。

目前可用于临床的生物假体瓣膜由于对显性猪或牛组织的移植物抗宿主反应而不可避免地随着时间的推移而降解¹³.瓣膜相关的钙化，降解和功能不全可能需要在几年后重复干预，特别是在年轻患者中，由于缺乏瓣膜生长，需要在其一生中接受多次肺动脉瓣置换术，这是当前生物假体材料固有的特性¹⁴。此外，目前可用的基本上是非再生的TPVR瓣膜具有重大局限性，例如血栓栓塞和出血并发症，以及由于不良组织重塑而导致的耐久性有限，这可能导致小叶回缩和普遍瓣膜功能障碍^15，16。

据推测，开发一种具有自我修复、再生和生长能力特征的自膨胀镍钛诺支架上的天然自体肺动脉瓣（APV）将确保生理性能和长期功能。而无毒交联剂处理的自体心包可以从收获和制造过程中唤醒。为此，这项临床前试验在成年绵羊模型中植入支架自体肺动脉瓣，目的是开发理想的介入性瓣膜替代品和低风险的程序方法来改善RVOT功能障碍的经导管治疗。本文选取绵羊J来说明全面的TPVR手术，包括心包切除术和经颈静脉植入自体心脏瓣膜。

研究方案

这项临床前研究由柏林卫生和社会事务区域办事处（LAGeSo）的法律和伦理委员会批准。所有动物（绵羊）都按照欧洲和德国实验动物科学学会（FELASA，GV-SOLAS）的指导方针得到了人道的照顾。该手术通过对一只3岁，47公斤的雌性绵羊J进行自体肺动脉瓣置换来说明。

1. 术前管理

1. 从抵达当天到心包切除术日，将所有实验性绵羊安置在同一个装有稻草的房间里1周，以保持社会陪伴（图1A）。
2. 在心包切除术和植入前12小时剥夺绵羊的食物，但不喝水。
3. 在插管前20分钟肌内注射咪达唑仑（0.4mg / kg），布托芬醇（0.4mg / kg）和格隆溴铵（0.011mg / kg或200mcg）对绵羊进行预用药。

2. 全身麻醉的诱导

1. 无菌地将18G安全静脉（IV）导管，注射口和T口放置在头静脉中（图1B）。
2. 通过静脉注射丙泊酚（20毫克/毫升，1-2.5毫克/千克）和芬太尼（0.01毫克/千克）诱导麻醉。
3. 镇静水平足够的指征包括下颌松弛、吞咽丧失和反射。镇静后，用适当大小的气管插管插管绵羊（图1C）。剃须绵羊，然后将其转移到手术室（OR）。

3. 心包切除术和植入术中麻醉管理

1. 使用压力循环机械呼吸机启动间歇正压通气 （IPPV），手术室中氧气含量为 100%。
2. 将绵羊连接到麻醉装置平台，并在压力模式下在整个麻醉期间对绵羊进行通气（潮气量（TV）= 8-12毫升/千克，呼吸频率（RF）= 12-14次呼吸/分钟）。调整电视和射频，将潮气末二氧化碳（EtCO₂）保持在35-45毫米汞柱之间，并将CO₂ （PaCO₂）的动脉分压保持在50毫米汞柱以下。
3. 维持麻醉联合异氟醚（实际上，建议维持浓度为1.5%-2.5%）在氧气中，流速为1 L / min（吸入氧分数（FiO₂）= 75%），并结合芬太尼（5-15微克/千克/小时）和咪达唑仑（0.2-0.5mg / kg / h）的连续速率输注（CRI）。
4. 在耳动脉中放置18G安全IV导管，用于测量有创血压（IBP）。
5. 将绵羊连接到多功能麻醉平台进行血流动力学监测，该平台显示直接测量耳动脉中的侵入性血压（IBP）（在心脏水平处归零），直肠探头测量体温，铅IV心电图，体积描记氧饱和度（SpO₂），电视，RF，EtCO₂，心率（HR）和FiO₂。
6. 放置胃管以从网中排出多余的气体和液体，为心包切除术做准备。为胃管配备标记导线作为植入的参考。
7. 将尿道中的尿道放入连接到尿袋的膀胱内。用至少5 mL盐水溶液（0.9%NaCl）使弗利球囊膨胀。
8. 在植入前30分钟进行活化凝血试验（ACT:240-300 s），以确认植入前的充分肝素化和植入后的拮抗。在心包切除术和植入前30分钟以及两个程序中每小时进行动脉血气分析（ABGs）以分析内部环境。
9. 在心包切除术和植入前 通过 静脉滴注30分钟施用以下抗生素，即舒巴坦/氨苄西林（20mg / kg）。确保在整个心包切除术和植入过程中连续输注晶体（5 mL / kg / h，等渗平衡电解质溶液）和羟乙基淀粉（HES，30 mL / h）。

4. 心包切除术

1. 心包切除术的准备
   1. 将绵羊放在手术台上，在右侧侧卧位，左侧抬高30°，然后用安全带和带子固定四肢。
   2. 在进行小胸切开术之前，用氯己定酒精对手术部位进行灭菌（心包切除术:左锁骨上方、胸骨前方、膈肌水平下，左锁骨中线后方）。用无菌覆盖覆盖其余区域（图2A）。
   3. 在全身麻醉下，使用#10手术刀片在第四肋骨旁位置做一个5厘米的皮肤切口。
   4. 通过左外侧小切开术（m-LLT）将胸大肌-胸大肌-胸小胸侧-肋间肌切成5cm长度连续且分开的切口，在第三和第四肋间隙进行理想暴露（图2B）。
   5. 使切口与胸骨偏移至少2厘米，以防止左胸内动脉和静脉受伤。在打开胸部之前，停止呼吸机10秒以防止肺损伤。
   6. 放置肋骨撒布器后，使用几种无菌纱布压缩左肺，以便更好地暴露手术场（图2C）。在手术领域可视化心包和胸腺（图2D）。
2. 在心包和膈肌的连接点开始心包切除术，收获两个膈神经之间的心包组织，直到无名静脉，直到膈肌。
   1. 按照步骤4.1.5中提到的压缩左肺以暴露膈肌 - 心包 - 纵隔胸膜的附着物。使用手术剪刀切开膈肌-心包-纵隔胸膜连接处的左纵隔胸膜，切开长度为 1 cm 的切口。沿着距左膈神经偏移1厘米的线向上延伸切口进入无名静脉（图2E）。
   2. 用手指将心包的右半部分向上抬高心包的右侧，重复该过程。从胸骨中解剖胸腺和心包脂肪。
   3. 在主动脉前迎接心包的两个切口。将心包和胸腺的交界处从主动脉前面的两个心包切叉夹紧，方法是将它们牢固地固定到位，并使用4-0不可吸收的缝合线手动绑住六个手术结。
   4. 在收获心包时，避免膈神经和下面的血管结构受伤。在心包切除术期间，从心包表面切除脂肪组织，包括胸腺。使用烧灼工具（即电切口术，Bovie）进行止血。
3. 将收获的心包置于厘米级的无菌板上以除去多余的脂肪组织，然后在0.9%NaCl中洗涤两次（图2F）。仔细检查所有手术区域是否有止血。
4. 用3-0聚二胖酮将打开的右纵隔胸膜缝合到残余的右心包边缘两次。使用呼吸袋手动将右肺充气至最大体积，并在关闭右胸前保持10秒。用3-0聚二肟酮将打开的左纵隔胸膜缝合到残余的左心包边缘两次。
5. 按如下所述，分四层关闭左胸切口。
   1. 以简单的中断或十字形方式用2-0聚二氧杂环酮缝合肋间肌肉和前锯齿，以跑步方式用3-0聚二氧杂环酮缝合小胸大胸肌，以十字形方式用3-0聚二氧杂环酮缝合皮下，以简单的中断方式用3-0尼龙缝合皮肤。以1厘米的间隔放置所有缝合线。
   2. 使用呼吸气球手动将左肺充气至最大体积，并在关闭肋间肌肉之前保持10秒。
6. 用无菌纱布覆盖切口并手动压缩5分钟，以防止肝素化后出血，用于新的心脏瓣膜植入。然后包扎手术部位。
7. 在进行皮肤缝合时停止静脉麻醉剂和异氟醚，以减少镇静深度。
8. 在自主呼吸恢复后取出胃管和导尿管。然后将带有脉搏血氧仪的绵羊转移到担架上的恢复室。
9. 当吞咽反射、反射和正常自主呼吸恢复时，取出气管插管。在植入前皮下注射0.5mg / kg美洛昔康，每日一次。
10. 一旦麻醉完全逆转（即，当绵羊能够独立站立时），绵羊就可以获得食物和水。

5. 三维自体心脏瓣膜的制备

1. 通过去除脂肪组织来修剪心包（图3A，B，C），然后将其置于3D成型心脏瓣膜模具上。（由于专利申请正在申请中，因此此步骤无法提供数字。
2. 将心包和3D成型心脏瓣膜模型放入具有无毒交联剂（30mL）的培养箱中2天21小时（图3D;由于专利申请中，此步骤中无法提供无毒交联剂的图形和详细信息）。

6. 准备亚太石油公司

1. 在0.9%NaCl中洗涤交联心脏瓣膜两次，并在2天21小时后以不连续的方式将其缝合到镍钛诺支架（直径30mm，高度29.4mm，48个菱形细胞）中。使用5-0聚丙烯将心脏瓣膜缝合到位，使用6至8节对齐心脏瓣膜和支架之间的连接点。（由于专利申请，此步骤无法提供数字。
2. 用15号手术刀片切开自体肺动脉瓣的三个自由边缘（图4A，B）。用手术镊子固定支架肺动脉瓣，抬起并将APV保持在0.9%NaCl中，以测试其打开和关闭，并评估三个条件是否需要进一步切割以实现更大的孔口开口。
3. 将APV在培养箱中孵育30分钟，在47.6mLPBS中与0.8%两性霉素B（0.4mL）和4.0%青霉素/链霉素（2mL）灭菌。使用商用压接器将支架心脏瓣膜压接到输送系统（DS）的头部进行双重测试（图4C-D），并将其安装到输送系统中（图4E）。

7. 经导管自体肺动脉瓣 通过 左颈静脉植入

1. 麻醉绵羊以进行 APV 植入，如步骤 1 至 3 所示。
2. 血管通路:剃除绵羊并对手术场进行绝育，包括下颌骨下缘上，前中线前，左锁骨上缘，后中线后方，使用聚维酮碘消毒剂对后中线进行消毒。用无菌覆盖剩余的未剃须和未消毒区域。
   1. 在脖子上标记左颈静脉，并使用Seldinger技术将导丝放入左颈静脉。用10号刀片扩大穿刺点，将11 F鞘放入ICE探针和输送系统的左颈静脉中（图5A，B）。用4-0不可吸收的缝合线在鞘引入器周围放置一个钱包线缝合线。
3. 心内超声心动图 （ICE）¹⁷
   1. 在植入之前和之后立即使用10 Fr超声导管进行ICE（图5C）。通过 2D、彩色、脉冲波和短轴和长轴中的连续多普勒来评估 NPV、APV 和三尖瓣阀的尺寸和功能等参数。
   2. 通过ICE的半定量评估¹⁸评估静脉收缩瓣膜反流的程度（图6）。 
4. 血管造影¹⁹:使用便携式C型臂和功能性屏幕进行血管造影，通过测量RVOT，NPV，肺球和瓣膜上肺动脉的直径来指导植入，并在植入后评估APV（图7A-D）。
5. 血流动力学²⁰:使用5.2 F 145°尾纤导管测量并记录植入前后的右心室和肺动脉压力。 通过 耳动脉测量全身动脉压。
6. 着床
   1. 建立 TPVR 束:在透视术的指导下，将 0.035 英寸的倾斜导丝置于右侧肺动脉。然后，将5.2 Fr尾纤导管放入左颈静脉，并在透视下先前放置的导丝的指导下将其推进到右侧肺动脉中。
   2. 从左颈静脉中取出倾斜的导丝。将 5 Fr Berman 血管造影球囊导管放入左颈静脉，并在导丝的引导下将其推进到右肺动脉。
   3. 根据透视测量，将0.035英寸的超硬导丝预成型成一个长度约为8-10厘米的圆圈，其直径等于从三尖瓣中心点到肺动脉瓣中心点的距离，并在球囊导管的指导下将其推进到右肺动脉（图8A）。确保导线不会干扰三尖瓣脉络膜。
   4. 用11号刀片扩张皮肤，并使用商用扩张器从16 Fr到22 Fr依次扩张左颈静脉（图8B）。扩张后用3-0聚二氧杂环酮围线缝合切口（图8C）。如¹⁹所述，进行血管造影以确保DS支架承载部分的所需位置。
   5. 在肺血管造影期间，将收缩末期和舒张末期心脏期的肺动脉瓣窦接头标记为着陆区的远端边界，并将肺动脉瓣的基平面标记为着陆区的近端边界。
   6. 重新打开并检查支架自体阀是否有压接引起的损坏。重新压接APV并将其安装到DS的头部（图8D）。通过预成型导丝 将 加载的DS通过右心室流入道（RVIT）和RVOT推进到NPV位置（图8E，F和 图9A）。
   7. 缩回DS的盖管，并在透视引导下缓慢而直接地将APV部署在舒张期末端的着陆区的NPV上（图9A-C）。当负荷的 DS 穿过 RVIT 和 RVOT 之间的交界处时要小心，以防止心肌损伤和心室颤动。APV的最佳位置是支架的中间部分放置在NPV上。
   8. 展开后，将DS的尖端小心地缩回盖管中，并从绵羊身上取回DS（图9D）。重复ICE（图6D-F），血管造影（图7C-D）和血流动力学测量，用于植入APV的尺寸和功能的后检查。用预先放置的钱包线缝合颈部左侧的切口，然后手动压缩。

8. 植入期药物

1. 在植入之前，用肝素以5000IU的剂量施用绵羊，以维持240-300 s的活化凝血时间（ACT）。在整个过程中使用 ACT 测试。手术开始后每30分钟重复一次ACT测试，以确认植入前和植入后足够的肝素化。
2. 在APV植入之前，以0.02 mol / L的剂量施用10%镁，以3-5mg / kg的剂量施用胺碘酮以预防心律失常。
3. 静脉注射舒巴坦/氨苄西林（20 mg/kg），以预防心包切除术和植入手术开始时的感染和心内膜炎。

9. 术后管理

1. 每天进行5天的术后随访，检查绵羊的心率和节律，呼吸深度，呼吸节律和呼吸声音（用于检查术后肺炎），疼痛迹象和其他异常的一般状况。检查伤口术后是否有肿胀、炎症、发红、出血和分泌物。
2. 继续抗凝5天，使用达肝素5000 IU或其他低分子量肝素皮下给药，每日一次。皮下注射1mg/kg美洛昔康，术后镇痛5天。
3. 进行实验室血液检查，包括血液学，肝功能，肾功能和血清化学，以评估绵羊的身体状况。

10. 跟进

1. 进行 ICE、心脏磁共振成像 （cMRI）、血管造影，并在植入后每 3-6 个月记录一次血流动力学，最长可达 21 个月。如上图所示进行 ICE 和血管造影。
2. 使用标准心电图门控电影 MRI 方法在 3.0 T MRI 扫描仪上执行 cMRI 以评估反流分数 （RF）²¹。进行最终的心脏计算机断层扫描（CT）以评估支架位置和右心在整个心脏周期中的变形，如我们之前的研究²²所示。

结果

在绵羊J中，APV（直径30毫米）被成功植入RVOT的"着陆区"。

在绵羊J中，在通气的全身麻醉下，以及后续MRI和ICE中，血液动力学在整个左前外侧小胸切开术中保持稳定（表1，表2和表3）。收获测量9 cm x 9 cm的自体心包，并通过去除多余的组织进行修剪（图3A-C）。将自体心包置于3D成型模具上，?...

讨论

这项研究是开发用于TPVR的活肺动脉瓣的重要一步。在成年绵羊模型中，该方法能够证明， 通过 颈静脉导管插入，可以将来自绵羊自身心包的APV植入自膨胀镍钛诺支架。在绵羊J中，使用自行设计的通用输送系统，支架自体肺动脉瓣成功地植入正确的肺部位置。植入后，绵羊J的心脏瓣膜在长达21个月的时间内显示出良好的功能，不仅为未来未成熟绵羊自体肺动脉瓣的临床前试验提供了安全有...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 % Magnesium	Inresa Arzneimittel GmbH	PZN: 00091126	0.02 mol/ L, 10X10 ml
10 Fr Ultrasound catheter	Siemens Healthcare GmbH	SKU  10043342RH	ACUSON AcuNav™ ultrasound catheter
3D Slicer	Slicer	Slicer 4.13.0-2021-08-13	Software: 3D Slicer image computing platform
Adobe Illustrator	Adobe	Adobe Illustrator 2021	Software
Amiodarone	Sanofi-Aventis Deutschland GmbH	PZN: 4599382	3- 5 mg/ kg, 150 mg/ 3 ml
Amplatz ultra-stiff guidewire	COOK MEDICAL LLC, USA	Reference Part Number:THSF-35-145-AUS	0.035 inch, 145 cm
Anesthetic device platform	Drägerwerk AG & Co. KGaA	8621500	Dräger Atlan A350
ARROW Berman Angiographic Balloon Catheter	Teleflex Medical Europe Ltd	LOT: 16F16M0070	5Fr, 80cm (X)
Butorphanol	Richter Pharma AG	Vnr531943	0.4mg/kg
C-Arm	BV Pulsera, Philips Heathcare, Eindhoven, The Netherlands	CAN/CSA-C22.2 NO.601.1-M90	Medical electral wquipment
Crimping tool	Edwards Lifesciences, Irvine, CA, USA	9600CR	Crimper
CT	Siemens Healthcare GmbH	−	CT platform
Dilator	Edwards Lifesciences, Irvine, CA, USA	9100DKSA	14- 22 Fr
Ethicon Suture	Ethicon	LOT:MKH259	4- 0 smooth monophilic thread, non-resorbable
Ethicon Suture	Ethicon	LOT:DEE274	3-0, 45 cm
Fast cath hemostasis introducer	ST. JUDE MEDICAL Minnetonka MN	LOT Number: 3458297	11 Fr
Fentanyl	Janssen-Cilag Pharma GmbH	DE/H/1047/001-002	0.01mg/kg
Fragmin	Pfizer Pharma GmbH, Berlin, Germany	PZN: 5746520	Dalteparin 5000 IU/ d
Functional screen	BV Pulsera, Philips Heathcare, Eindhoven, The Netherlands	System ID: 44350921	Medical electral wquipment
Glycopyrroniumbromid	Accord Healthcare B.V	PZN11649123	0.011mg/kg
Guide Wire M	TERUMO COPORATION JAPAN	REF*GA35183M	0.89 mm, 180 cm
Hemochron Celite ACT	International Technidyne Corporation, Edison, USA	NJ 08820-2419	ACT
Heparin	Merckle GmbH	PZN: 3190573	Heparin-Natrium 5.000 I.E./0,2 ml
Hydroxyethyl starch (Haes-steril 10 %)	Fresenius Kabi Deutschland GmbH	ATC Code: B05A	500 ml, 30 ml/h
Imeron 400 MCT	Bracco Imaging	PZN00229978	2.0–2.5 ml/kg, Contrast agent
Isoflurane	CP-Pharma Handelsges. GmbH	ATCvet Code: QN01AB06	250 ml, MAC: 1 %
Jonosteril Infusionslösung	Fresenius Kabi Deutschland GmbH	PZN: 541612	1000 ml
Ketamine	Actavis Group PTC EHF	ART.-Nr. 799-762	2–5 mg/kg/h
Meloxicam	Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH	M21020A-09	20 mg/ mL, 50 ml
Midazolam	Hameln pharma plus GMBH	MIDAZ50100	0.4mg/kg
MRI	Philips Healthcare	−	Ingenia Elition X, 3.0T
Natriumchloride (NaCl)	B. Braun Melsungen AG	PZN /EAN:04499344 / 4030539077361	0.9 %, 500 ml
Pigtail catheter	Cordis, Miami Lakes, FL, USA	REF: 533-534A	5.2 Fr 145 °, 110 cm
Propofol	B. Braun Melsungen AG	PZN 11164495	20mg/ml, 1–2.5 mg/kg
Propofol	B. Braun Melsungen AG	PZN 11164443	10mg/ml, 2.5–8.0 mg/kg/h
Safety IV Catheter with Injection port	B. Braun Melsungen AG	LOT: 20D03G8346	18 G Catheter with Injection port
Sulbactam- ampicillin	Pfizer Pharma GmbH, Berlin, Germany	PZN: 4843132	3 g, 2.000 mg/ 1.000 mg
Sulbactam/ ampicillin	Instituto Biochimico Italiano G Lorenzini S.p.A. – Via Fossignano 2, Aprilia (LT) – Italien	ATC Code: J01CR01	20 mg/kg, 2 g/1 g
Surgical Blade	Brinkmann Medical ein Unternehmen der Dr. Junghans Medical GmbH	PZN: 354844	15 #
Surgical Blade	Brinkmann Medical ein Unternehmen der Dr. Junghans Medical GmbH	PZN: 354844	11 #
Suture	Johnson & Johnson	Hersteller Artikel Nr. EH7284H	5-0 polypropylene