检测白纹伊蚊细胞系中的沃尔巴克氏体菌株 wAlbB

摘要

采用4种方法检测细胞内沃尔巴克氏体，相辅相成，提高了抗生素治愈白纹伊蚊来源的Aa23和Aa23-T感染的细菌感染的准确性。

摘要

作为母体内共生体，沃尔巴克氏体感染了大部分昆虫种群。最近的研究报道了使用沃尔巴克氏体转染的蚊子成功调节RNA病毒传播。控制病毒的关键策略包括通过细胞质不相容性操纵宿主繁殖，以及通过免疫启动和竞争宿主来源资源来抑制病毒转录本。然而，沃尔巴克氏体转染蚊子对病毒感染反应的潜在机制知之甚少。本文提出了一种在白纹伊蚊（Diptera:Culicidae）Aa23细胞的核酸和蛋白质水平上体外鉴定沃尔巴克氏体感染的方案，以增强对沃尔巴克氏体与其昆虫载体之间相互作用的理解。通过结合使用聚合酶链反应（PCR）、定量PCR、免疫印迹和免疫学分析方法，已经描述了一种比使用单一方法更准确的用于检测沃尔巴克氏体感染细胞的标准形态学方案。这种方法也可用于检测其他昆虫分类群中的沃尔巴克氏体感染。

引言

亚洲虎蚊 白纹 伊蚊（Skuse）（双翅目:Culicidae）是亚洲和世界其他地区登革热病毒（DENV）的主要载体¹，是两种类型的细胞内细菌的天然宿主， 沃尔巴克氏体 （wAlbA和 wAlbB），分布在整个种系和体细胞组织中^2，3。来自 白纹 松胚胎的Aa23细胞系由至少两种形态细胞类型组成，这两种细胞都支持感染⁴ ，并且可以使用抗生素（Aa23-T）治愈天然 沃尔巴克氏体 感染。鉴于Aa23仅保留 wAlbB，它是研究宿主 - 内共生体相互作用^4，5，6的有用模型。

沃尔巴克氏体是母体传播的，估计感染了65%的昆虫物种^8，9和28%的蚊子物种¹⁰。它感染多种组织并与宿主形成亲密的共生关系，通常通过操纵宿主生殖系统^12，13诱导细胞质不相容（CI）¹¹和种群替代。在模拟果蝇¹⁴的自然种群和在实验室笼子和田间试验¹⁵的埃及伊蚊中观察到这些宿主反应。沃尔巴克氏体引发的一个重要的非生殖性操作是诱导宿主对各种病原体的抗性，包括DENV，基孔肯雅病毒（CHIKV）和西尼罗河病毒（WNV）^16，17，这些病原体可能由共生体的先天免疫系统改善^18，19介导，沃尔巴克氏体和病毒之间对基本宿主资源的竞争²⁰，以及操纵宿主病毒防御途径²¹.

该方案是为研究 沃尔巴克氏体诱导的宿主抗病毒反应的这些潜在机制而开发的。它使用四种方法检测Aa23细胞的细胞内 沃尔巴克氏体 感染。这些方法为研究其他宿主物种的细胞内 沃尔巴克氏体 感染提供了强有力的理论基础。第一种方法，PCR - 一种强大的技术，允许在不使用常规克隆程序的情况下酶扩增DNA的特定区域 - 用于检测 沃尔巴克氏体 DNA并确定 是否存在沃尔巴克氏体 感染²²。第二种方法是使用定量PCR（qPCR）测量 沃尔巴克氏体 DNA拷贝密度，以可靠地检测和测量每个PCR循环中产生的产物，该产物与PCR²³之前的模板量成正比。第三种方法使用蛋白质印迹检测细胞内 沃尔巴克氏体 蛋白的存在 - 这是通过结合电泳的高分离能力，抗体的特异性和显色酶促反应的敏感性来检测复杂混合物中特定蛋白质的最强大工具之一。最后一种方法是免疫荧光测定（IFA），结合免疫学，生物化学和显微镜，通过抗原抗体反应检测 沃尔巴克氏体 表面蛋白（wsp），以确认 沃尔巴克氏体的 细胞摄取并确定其细胞定位。

本文介绍了上述四种验证细胞中 沃尔巴克氏体 存在的方法，可用于检测外源性 沃尔巴克氏体 是否成功转染，细胞内的 沃尔巴克氏体 是否被清除。在确定细胞中是否存在 沃尔巴克氏体 后，可以进行各种不同的分析，包括基因组学，蛋白质组学或代谢组学。该协议演示了通过Aa23细胞检测 沃尔巴克氏体 ，但也可用于其他细胞。

研究方案

1. 材料和试剂

1. 使用无热原溶液和培养基进行细胞培养（参见 材料表）。
2. 使用超纯水制备所有溶液。
3. 在选择用于细胞培养的胎牛血清（FBS）时要小心，遵循批次检查过程。
   注意:由于FBS批次可能会定期更改，因此无法在该协议中说明相关目录和批号。
4. 选择来自 白纹 松卵的Aa23细胞株，对应于无 沃尔巴克氏体Aa23-T。

2. 细胞培养

1. 用4 mL施耐德培养基和10%FBS制备^{25 cm 2} 细胞培养瓶。
2. 将烧瓶在28°C下在5%CO₂ 气氛下孵育5至7天^7，24。
3. 使用光学显微镜以100x放大倍率观察烧瓶中未染色的Aa23和Aa23-T细胞（图1）。

3. 脱氧核糖核酸提取

1. 培养细胞5-7天，直到每个烧瓶70-80%汇合（步骤2）。通过在微量离心机中以100×g离心5分钟，从1mL重悬的培养基中手动移液收获细胞。
2. 通过抽吸除去上清液，并将所得细胞沉淀储存在-20°C。
3. 将沉淀重悬于0.40mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，将50μL溶液置于微量离心管中，加入5μL蛋白酶K（20mg / mL），并在55°C下孵育1小时。最后，将这些管在99°C下加热15分钟，以获得粗DNA并将其储存在-20°C。

4. 沃尔巴克氏体 核酸的检测

1. 聚合酶链反应分析
   1. 在总反应体积为 20 μL、含有 8 μL ddH₂O、10 μL Taq 聚合酶（参见 材料表）、1 μL DNA 模板（从步骤 3 开始）、0.5 μL 正反引物 （10 μM） 中进行 PCR: Wsp81F（5' TCC AAT AAT AAG 特加特加特加 AGAAAC 3'）和 WSP691R（5' AAA AAT ACG CTA CTC CA 3'）²⁵， 分别。
   2. 使用以下PCR条件:在95°C下初始变性5分钟，然后在94°C下进行35个变性循环，在55°C退火，在72°C下延伸;然后，在72°C下进行最终延伸7分钟。
   3. 使用凝胶成像仪检测1%琼脂糖凝胶（PBS中为1%w / v琼脂糖）上的DNA。
2. 二氯杀伤性反应分析
   1. 使用 WSP 引物 183 F（5' AAGGAGAGTCTC3'）和 QBrev R （5' AGTGAGTAGTCTCCC 3'）²² 分析从提取的 DNA（步骤 3）中分离出的三个生物重复 （n = 6），用核糖体蛋白 S6 （RPS6） 正向和反向引物（5' GAGGGGTCT3' 和 5' GAGATGGT3'）3'标准化 ^3。3。
   2. 生成一条标准曲线，用于调整和 RPS6。
      1. 从PMD-18T（用于高效克隆PCR产物（TA克隆）的特殊载体）中提取含有 WSp 和 rps6 基因片段的重组质粒（补充文件）并测量质粒DNA浓度（参见 材料表）。
      2. 使用等式（1）将质粒DNA浓度转换为拷贝数浓度。
         质粒拷贝数 = （1）
      3. 用超纯水将质粒拷贝数从10¹ 稀释到10⁸ ，并为每个浓度梯度设置3个重复。
      4. 使用TB Green和实时荧光定量PCR系统（参见 材料表）进行qPCR扩增，并记录每个反应的结果。使用 Ct 值开发标准曲线。分析总反应体积为20 μL的DNA，包括7 μL ddH₂O，10.4 μL TB绿（参见 材料表），1 μL DNA模板（由步骤3提供）和0.8 μL正向和反向引物（10 μM）。使用以下反应条件:在95°C下初始变性5分钟，然后在95°C下40个变性循环10秒，在60°C退火35秒。
      5. 根据建立的标准曲线计算细胞中的WSP和RPS6基因拷贝数，并通过wsp / RPS6的拷贝数计算沃尔巴克氏体相对密度。使用独立的样本 t 检验分析数据。
3. 沃尔巴克氏体蛋白的蛋白质印迹分析
   1. 蛋白质提取
      1. 在微量离心管中从六孔板（从步骤2开始）中收集2×10⁷ Aa23和Aa23-T细胞，用PBS洗涤三次，并在4°C下以100× g 离心5分钟。
      2. 用RIPA裂解缓冲液（50 mM三（pH 7.4），150mM氯化钠，1%曲拉基X-100，1%脱氧胆酸钠，0.1%十二烷基硫酸钠[SDS]，2mM焦磷酸钠，25mM β-甘油磷酸盐，1mM EDTA，1mM Na₃VO₄，0.5μg/ mL亮蛋白汀）和PMSF（终浓度1mM）制备1mL裂解物。
      3. 向细胞沉淀中加入200μL裂解缓冲液，并在冰上保持30分钟。在4°C下以12，000× g 离心裂解物10分钟并除去上清液。
   2. 按照制造商的说明，使用双辛可宁酸（BCA）蛋白测定试剂盒（参见 材料表）测定上清液的wsp浓度。
   3. 在15%SDS-PAGE凝胶上加载等量的蛋白质[10%蒸馏水; 50%（30%阿克里双歧杆菌（29:1），38%1M三，pH 8.8;1%（10%SDS），1%（10%过硫酸铵），0.04%TEMED]。
   4. 将蛋白质转移到硝酸纤维素膜中，用5%脱脂牛奶在室温下阻断膜^{2小时26，27} ，然后用TBST（1mL吐温20在1L TBS中）洗涤膜三次（见 材料表）。
   5. 用100μL抗wsp多克隆抗体（内部制备，参见 补充文件）在4°C下孵育膜过夜，用5%脱脂牛奶（1:12，000）稀释一抗。
   6. 用TBST洗涤一抗三次。
   7. 将膜在室温下在振荡器上孵育100μL辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗中1小时。
   8. 用TBST洗涤膜三次，并在化学发光检测试剂盒中以1:1的比例混合20μL溶液A（HRP底物鲁米诺试剂）和20μL溶液B（HRP底物过氧化物试剂）。同时将整个膜浸入发光溶液中，并使用多功能成像系统观察信号。
4. 沃尔巴克氏体蛋白的免疫荧光定位
   1. 在底部厚度^为 0.17 mm的激光共聚焦培养皿上，在28°C下孵育5×10 5_{Aa23和Aa23-T} 细胞，在5%CO 2气氛下孵育3至4天^7，24。等到细胞汇合60%-70%，并用PBS洗涤细胞三次。
   2. 将细胞在4°C下在PBS中以1mL的4%（w / v）多聚甲醛固定20分钟。
   3. 使用PBST（PBS中0.2%v / v曲拉顿X-100）洗涤固定细胞5分钟，并用PBS再次洗涤细胞两次。
   4. 将载玻片在37°C下在PBS中以1mL的3%（w / v）牛血清白蛋白孵育1小时。
   5. 将载玻片在4°C的湿箱（可以保持湿度并防止水分蒸发）中将100μL小鼠抗wsp多克隆抗体（内部制备）和小鼠血清（PBS中1:1，000稀释）中孵育过夜。
   6. 从湿盒中取出载玻片，将其恢复到室温;用 PBS 清洗它们三次，然后取出 PBS。
      注意:从步骤 4.4.7 开始，所有操作都必须防光。
   7. 将载玻片与100μLAlexa Fluor 488偶联的山羊抗小鼠抗体（在PBS中稀释1:2，000）在37°C下孵育30分钟。
   8. 将样品载玻片与50μL4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI在PBS中稀释至10μg/ mL，与DNA强结合）在37°C下孵育5分钟，然后用PBS洗涤三次。
   9. 在共聚焦显微镜下观察免疫染色。
      1. 打开电源和激光。
      2. 打开显微镜的正常灯和水银灯。
      3. 启动系统并运行操作软件。在样品载玻片上滴一滴雪松油，将样品载玻片放在显微镜载物台上，然后将载物台移动到适当的位置。
      4. 单击软件中的 汞灯观察 按钮，打开汞灯快门，在倒置显微镜下观察样品以进行聚焦。
      5. 使用 手动控制面板 选择绿色和蓝色荧光，以拍摄100倍放大倍率下的荧光照片。
      6. 关闭 汞灯观察 按钮并开始获取图像。
      7. 为确保良好的图像质量，请按扫描大小（512 像素 x 512 像素）进行预扫描。调整扫描大小以获得清晰的图像（1，024 像素 x 1，024 像素）。
      8. 如果背景噪音过高，则进行降噪。
      9. 停止扫描并保存图像。
      10. 关闭汞灯和激光。
      11. 用75%酒精擦拭物镜，并将物镜降低到最低位置。
      12. 关闭快门和显微镜电源。
      13. 仪器冷却后，用防尘罩盖住。

结果

在检测到沃尔巴克氏体之前，在光学显微镜下观察Aa23和Aa23-T细胞，以确定两种细胞系之间的任何形态差异。Aa23和Aa23-T细胞至少具有两种细胞形态，但两种细胞类型之间没有明显的形态差异（图1）。在这里，Aa23细胞被用作使用四种方法检测沃尔巴克氏体感染的模型系统。使用诊断引物81F/691R对Wolbachiawsp基因进行阳性扩增在Aa23细胞（泳?...

讨论

细胞内 沃尔巴克氏体 感染的检测对于研究 沃尔巴克氏体-宿主相互作用和确认新菌株细胞的成功转染至关重要。在该方案中，使用了四种方法在核酸和蛋白质水平上成功检测细胞内 沃尔巴克氏体 感染。这四种实验方法证实并提高了 沃尔巴克氏体 感染细胞的检测精度。

PCR用于在核酸水平上检测细胞 的沃尔巴克氏体 感染的存在。然而，由于...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope	Zeiss		SteREO Discovery V8
Petri dish	Fisher Scietific	FB0875713
Pipette	Pipetman	F167380	P10
inSituX platform
Analysis software	In-house developed
Cerium doped yttrium aluminum garnet	MSE Supplies		Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates
Chip holder	In-house developed
Control software	In-house developed
Immersion oil	Cargille Laboratories	16482	Type A low viscosity 150 cSt
inSituX platform	In-house developed
IR light source	Thorlabs Incorporated	LED1085L	LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18
Outer ring	In-house developed
Pump lasers	Thorlabs Incorporated	LD785-SE400	785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode
Raspberry Pi	Raspberry Pi Fundation
Retaining ring	Thorlabs Incorporated	SM1RR	SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts
Seedless quartz crystal	University Wafers, Inc.	U01-W2-L-190514	25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X
Shim	In-house developed
X-ray beam stop	In-house developed