Detectando wolbachia strain wAlbb em linhas celulares Aedes albopictus

Resumo

Quatro métodos foram usados para detectar wolbachia intracelular, que se complementou e melhorou a precisão de detecção da infecção wolbachia da Aa23 e Aa23-T derivadas de Aa23 e Aa23-T curadas da infecção nativa wolbachia usando antibióticos.

Resumo

Como um endossímbionte abrigado maternamente, Wolbachia infecta grandes proporções de populações de insetos. Estudos relataram recentemente a regulamentação bem sucedida da transmissão do vírus RNA usando mosquitos transfectados por Wolbachia. As principais estratégias para controlar vírus incluem a manipulação da reprodução do hospedeiro por incompatibilidade citoplasmática e a inibição de transcrições virais por meio de priming imunológico e competição por recursos derivados do hospedeiro. No entanto, os mecanismos subjacentes das respostas dos mosquitos transfectados wolbachia à infecção viral são mal compreendidos. Este artigo apresenta um protocolo para a identificação in vitro da infecção por Wolbachia nos níveis nucleicos de ácido e proteína em células Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23 para melhorar a compreensão das interações entre Wolbachia e seus vetores de insetos. Através do uso combinado de reação em cadeia de polimerase (PCR), PCR quantitativo, mancha ocidental e métodos analíticos imunológicos, um protocolo morfológico padrão foi descrito para a detecção de células infectadas por Wolbachia que é mais precisa do que o uso de um único método. Essa abordagem também pode ser aplicada à detecção da infecção por Wolbachia em outras taxas de insetos.

Introdução

O mosquito tigre asiático Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae), que é um vetor chave do vírus da dengue (DENV) na Ásia e em outras partes do mundo¹, é um hospedeiro natural de dois tipos de bactérias intracelulares, Wolbachia (wAlbA e wAlbB), que estão distribuídas por toda a linha germe e tecido somático ^2,3. A linha celular Aa23 derivada de embriões A. albopictus consiste em pelo menos dois tipos de células morfológicas, ambos suportam a infecção⁴ e podem ser curados da infecção nativa da Wolbachia usando antibióticos (Aa23-T). Dado que o Aa23 mantém apenas wAlbB, é um modelo útil para o estudo das interações hospedeira-endossímbionte ^4,5,6.

Wolbachia é transmitida maternamente e infecta cerca de 65% das espécies de insetos ^8,9 e 28% das espécies de^{mosquitos 10}. Infecta uma variedade de tecidos e forma uma relação simbiótica íntima com o hospedeiro, geralmente induzindo incompatibilidade citoplasmática (IC)¹¹ e substituição populacional manipulando o sistema reprodutivo^{hospedeiro 12,13}. Essas respostas hospedeiras têm sido observadas em populações naturais de simuladores de Drosophila¹⁴ e em A. aegypti em uma gaiola de laboratório e ensaio de campo¹⁵. Uma importante manipulação não reproducente provocada pela Wolbachia é induzida resistência hospedeira a uma variedade de patógenos, incluindo DENV, vírus Chikungunya (CHIKV) e vírus do Nilo Ocidental (WNV)^16,17, que podem ser mediados por um sistema imunológico inato melhorado do simbionte^18,19, competição entre Wolbachia e vírus para recursos essenciais de hospedagem²⁰, e manipulação de vias de defesa viral^{hospedeira 21} .

Este protocolo foi desenvolvido para estudar esses mecanismos subjacentes das respostas antivirais induzidas pela Wolbachia. Utiliza quatro métodos de detecção da infecção por Wolbachia intracelular de células Aa23. Esses métodos fornecem uma forte base teórica para estudos de infecção por Wolbachia intracelular de outras espécies hospedeiras. O primeiro método, PCR-uma técnica poderosa que permite a amplificação enzimática de regiões específicas do DNA sem utilizar procedimentos convencionais de clonagem - foi usado para detectar DNA wolbachia e determinar a presença/ausência da infecção wolbachia ²². O segundo método mede a densidade de cópia de DNA de Wolbachia usando PCR quantitativo (qPCR) para detecção e medição confiável de produtos gerados durante cada ciclo pcr que é diretamente proporcional à quantidade de modelo antes do PCR²³. O terceiro método detecta a presença de proteínas wolbachia intracelulares, utilizando uma das ferramentas mais poderosas para detectar proteínas específicas em misturas complexas, combinando o alto poder de separação da eletroforese, a especificidade dos anticorpos e a sensibilidade das reações enzimáticas cromogênicas. O método final é um ensaio de imunofluorescência (IFA) que combina imunologia, bioquímica e microscopia para detectar a proteína da superfície de Wolbachia (wsp) através de uma reação de anticorpos de antígeno para confirmar a absorção celular de Wolbachia e determinar sua localização celular.

Este artigo descreve os quatro métodos listados acima para verificar a existência de Wolbachia nas células, que podem ser usados para detectar se a exógena Wolbachia foi transfeinada com sucesso e a Wolbachia na célula foi limpa. Depois de determinar se wolbachia está presente nas células ou não, uma variedade de diferentes análises podem ser realizadas, incluindo genômica, proteômica ou metabolômica. Este protocolo demonstra a detecção de Wolbachia através de células Aa23, mas também pode ser usado em outras células.

Protocolo

1. Materiais e reagentes

1. Use soluções e mídias sem pirógenos para cultura celular (veja a Tabela de Materiais).
2. Use água ultrauso para preparar todas as soluções.
3. Tenha cuidado ao selecionar o soro bovino fetal (FBS) para a cultura celular, seguindo um processo de verificação de lotes.
   NOTA: Como os lotes da FBS estão sujeitos a alterações regulares, é impossível declarar os números relevantes do catálogo e dos lotes neste protocolo.
4. Selecione as cepas de células Aa23 derivadas de ovos A. albopictus , correspondentes ao Aa23-T livre de Wolbachia.

2. Cultura celular

1. Prepare frascos de cultura celular^{de 25 cm 2} com 4 mL do meio de Schneider com 10% de FBS.
2. Incubar os frascos a 28 °C sob uma atmosfera de CO₂ de 5% para 5 a 7 dias ^7,24.
3. Observe células Aa23 e Aa23-T não manchadas nos frascos usando microscopia leve a 100x de ampliação (Figura 1).

3. Extração de DNA

1. Cultura as células por 5-7 dias até 70-80% confluência por frasco (passo 2). Colher as células com tubulação manual de 1 mL de meio de cultura resuspended por centrifugação por 5 min a 100 × g em um microcentrifuge.
2. Remova o supernatante por aspiração e armazene a pelota de célula resultante a -20 °C.
3. Resuspenja as pelotas em 0,40 mL de salina tamponada com fosfato (PBS), coloque 50 μL da solução em um tubo de microcentrifuuga, adicione 5 μL de proteinase K (20 mg/mL) e incubar a 55 °C por 1 h. Por fim, aqueça estes tubos a 99 °C por 15 minutos para obter o DNA bruto e armazená-lo a -20 °C.

4. Detecção de ácido nucleico wolbachia

1. Análise do PCR
   1. Execute PCR em um volume total de reação de 20 μL, contendo 8 μL de ddH₂O, 10 μL de polimerase Taq (ver a Tabela de Materiais), 1 μL de modelo de DNA (a partir da etapa 3), 0,5 μL de primers dianteiros e invertidos (10 μM): wsp81F (5' TGG TCC AAT AAG TGATGA AGAAAC 3') e wsp691R (5' AAA AAT TAA ACG CTA CTC CA 3')²⁵, respectivamente.
   2. Use as seguintes condições de PCR: desnaturação inicial a 95 °C por 5 min, seguida por 35 ciclos de desnaturação a 94 °C, ressarem a 55 °C e extensão a 72 °C; em seguida, uma prorrogação final a 72 °C por 7 min.
   3. Detecte o DNA em um gel de 1% de agarose (1% w/v agarose em PBS) usando um imager de gel.
2. análise qPCR
   1. Analise a cópia do genoma de Wolbachia para três réplicas biológicas (n = 6) do DNA extraído (etapa 3) usando primers wsp 183 F (5' AAGGAACCGAAGTTCATG 3') e QBrev R (5' AGTTGAGAGTAAAGTCCC 3')²², normalizados com primers de proteína ribossômica S6 (RPS6) para frente e para trás (5' GAAGTTGAACGTATCGTTTC 3' e 5' GAGATGGTCAGCGGTGATTT 3', respectivamente)³.
   2. Gere uma curva padrão para wAlbB e RPS6.
      1. Extrair DNA do PMD-18T (vetor especial para clonagem eficiente de produtos PCR (clonagem de TA)) plasmídeo recombinante contendo fragmentos genéticos wsp e rps6 (Arquivo Suplementar) e medir a concentração de DNA plasmídeo (ver a Tabela de Materiais).
      2. Converta a concentração de DNA plasmídeo para copiar a concentração numépide usando Eq (1).
         Número da cópia plasmid = (1)
      3. Diluir o número da cópia plasmida de 10¹ a 10⁸ com água ultrapura e definir 3 réplicas para cada gradiente de concentração.
      4. Realize a amplificação qPCR usando TB Green e um sistema PCR em tempo real (veja a Tabela de Materiais) e regissue os resultados de cada reação. Use o valor ct para desenvolver uma curva padrão. Analise o DNA em um volume total de reação de 20 μL, compreendendo 7 μL de ddH₂O, 10,4 μL de TB Verde (ver a Tabela de Materiais), 1 μL de modelo de DNA (fornecido pelo Passo 3) e 0,8 μL de primers dianteiros e invertidos (10 μM). Use as seguintes condições de reação: denaturação inicial a 95 °C por 5 min, seguida por 40 ciclos de desinaturação a 95 °C para 10 s, e ressarem a 60 °C para 35 s.
      5. Calcule os números de cópia genética WSP e RPS6 nas células de acordo com a curva padrão estabelecida e a densidade relativa de Wolbachia pelo número de cópia do wsp/RPS6. Analise os dados usando um teste de amostras independentes.
3. Análise de manchas ocidentais da proteína Wolbachia
   1. Extração de proteínas
      1. Colete 2 × 10^células Aa23 e Aa23-T da placa de seis poços (a partir do passo 2) em um tubo de microcentrífuga, lave-as três vezes com PBS e centrífugas a 100 × g por 5 min a 4 °C.
      2. Prepare 1 mL de lise com tampão de lise RIPA (50 mM Tris (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1%Triton X-100, 1% desoxicosolato de sódio, 0,1% sulfato de dodecil de sódio [SDS], pirofosfato de sódio de 2 mM, 25 mM β-glicerofosfato, 1 mM EDTA, 1 mM Na₃VO₄, 0,5 μg/mL leupeptin) e PMSF (concentração final 1 mM).
      3. Adicione 200 μL de tampão de lise à pelota celular e mantenha por 30 minutos no gelo. Centrifugar os lises a 12.000 × g por 10 min a 4 °C e remover o sobrenante.
   2. Ensaio a concentração de wsp do supernante usando um kit de ensaio de proteína de ácido bicinchonínico (BCA) (ver a Tabela de Materiais) seguindo as instruções do fabricante.
   3. Carregar quantidades iguais de proteína em um gel de 15% SDS-PAGE [10% água destilada; 50% (30% Acr-Bis (29:1), 38% 1 M Tris, pH 8,8; 1% (10% SDS), 1% (10% de amônio persulfato), 0,04% TEMED].
   4. Transfira a proteína para membranas nitrocelulosese, bloqueie as membranas com 5% de leite desnatado por 2 h^26,27 à temperatura ambiente e depois lave as membranas três vezes com TBST (1 mL de Tween 20 em 1 L de TBS) (ver a Tabela de Materiais).
   5. Incubar as membranas durante a noite a 4 °C com 100 μL de anticorpo policlonal anti-wsp (preparado internamente, ver Arquivo Suplementar)), preparado pela diluição do anticorpo primário com 5% de leite desnatado (1:12.000).
   6. Lave o anticorpo primário três vezes com TBST.
   7. Incubar as membranas em 100 μL de peroxidase de rabanete (HRP) anticorpo secundário conjugado em um agitador por 1 h à temperatura ambiente.
   8. Lave as membranas três vezes com TBST, e misture 20 μL de solução A (HRP Substrate Luminol Reagent) e 20 μL de solução B (HRP Substrate Peroxide Reagent) no kit de detecção de quimiominascência em uma razão de 1:1. Mergulhe toda a membrana na solução de luminescência ao mesmo tempo, e observe os sinais usando um sistema de imagem multifuncional.
4. Localização de imunofluorescência da proteína Wolbachia
   1. Incubar 5 ×¹⁰ células Aa23 e Aa23-T a 28 °C em uma placa de Petri confocal laser com uma espessura de 0,17 mm na parte inferior, sob uma atmosfera de 5% de CO₂ por 3 a 4 dias ^7,24. Espere até que a célula esteja 60%-70% de confluência e lave as células três vezes com PBS.
   2. Fixar as células por 20 min a 4 °C em 1 mL de paraformaldeído de 4% (w/v) em PBS.
   3. Lave as células fixas usando PBST (0,2% v/v Triton X-100 em PBS) por 5 min e lave as células novamente duas vezes com PBS.
   4. Incubar os slides por 1 h a 37 °C em 1 mL de 3% (w/v) albumina de soro bovino na PBS.
   5. Incubar os slides durante a noite em 100 μL de anticorpo policlonal anti-wsp de rato (preparado internamente) e soro de rato (1:1.000 diluição em PBS) em uma caixa molhada (pode manter a umidade e evitar que a umidade evapore) a 4 °C.
   6. Remova os slides da caixa molhada e devolva-os à temperatura ambiente; lave-os três vezes com PBS e remova o PBS.
      NOTA: A partir do passo 4.4.7 em diante, todas as operações devem ser protegidas à luz.
   7. Incubar os slides com 100 μL de um anticorpo anti-rato de cabra Alexa Fluor 488 conjugado (1:2.000 diluição em PBS) a 37 °C por 30 min.
   8. Incubar os slides de amostra com 50 μL de 4',6-diamidino-2-fenilôdole (DAPI diluído em PBS a 10 μg/mL, liga fortemente ao DNA) a 37 °C por 5 min e depois lavá-los três vezes com PBS.
   9. Observe a imunostaining sob um microscópio confocal.
      1. Ligue a energia e o laser.
      2. Ligue as lâmpadas normais e de mercúrio do microscópio.
      3. Inicie o sistema e execute o software de operação. Coloque uma gota de óleo de cedro nos slides da amostra, coloque os slides da amostra no estágio do microscópio e mova o palco para a posição apropriada.
      4. Clique no botão de observação da lâmpada de mercúrio no software, abra o obturador da lâmpada de mercúrio e observe a amostra sob um microscópio invertido para se concentrar.
      5. Use o painel de controle manual para selecionar fluorescência verde e azul para tirar fotos de fluorescência sob ampliação de 100x.
      6. Desligue o botão de observação da lâmpada de mercúrio e comece a adquirir imagens.
      7. Para garantir uma boa qualidade de imagem, prescan pelo tamanho da varredura (512 pixels x 512 pixels). Ajuste o tamanho da varredura para obter imagens claras (1.024 pixels x 1.024 pixels).
      8. Realize a redução de ruído se o ruído de fundo for muito alto.
      9. Pare de digitalizar e salve as imagens.
      10. Desligue a lâmpada de mercúrio e os lasers.
      11. Limpe o objetivo com 75% de álcool e abaixe o objetivo para a posição mais baixa.
      12. Desligue o obturador e a energia do microscópio.
      13. Depois que o instrumento esfriar, cubra-o com a tampa de pó.

Resultados

Antes da córdia ser detectada, as células Aa23 e Aa23-T foram observadas sob um microscópio leve para determinar quaisquer diferenças morfológicas entre as duas linhas celulares. As células Aa23 e Aa23-T têm pelo menos duas morfologias celulares, mas nenhuma diferença morfológica óbvia entre os dois tipos de células (Figura 1). Aqui, as células Aa23 foram usadas como um sistema modelo para detectar a infecção por Wolbachia usando quatro métod...

Discussão

A detecção da infecção por Wolbachia intracelular é essencial para o estudo das interações wolbachia-hospedeira e a confirmação da transfecção bem sucedida de células com novas cepas. Neste protocolo, quatro métodos foram utilizados para detectar com sucesso a infecção por Wolbachia intracelular nos níveis nucleicos de ácido e proteína. Estes quatro métodos experimentais corroboraram e melhoraram a precisão de detecção da infecção por Wolbachia das células.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope	Zeiss		SteREO Discovery V8
Petri dish	Fisher Scietific	FB0875713
Pipette	Pipetman	F167380	P10
inSituX platform
Analysis software	In-house developed
Cerium doped yttrium aluminum garnet	MSE Supplies		Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates
Chip holder	In-house developed
Control software	In-house developed
Immersion oil	Cargille Laboratories	16482	Type A low viscosity 150 cSt
inSituX platform	In-house developed
IR light source	Thorlabs Incorporated	LED1085L	LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18
Outer ring	In-house developed
Pump lasers	Thorlabs Incorporated	LD785-SE400	785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode
Raspberry Pi	Raspberry Pi Fundation
Retaining ring	Thorlabs Incorporated	SM1RR	SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts
Seedless quartz crystal	University Wafers, Inc.	U01-W2-L-190514	25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X
Shim	In-house developed
X-ray beam stop	In-house developed