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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Quatre méthodes ont été utilisées pour détecter les Wolbachia intracellulaires, qui se complétaient et amélioraient la précision de la détection de l’infection à Wolbachia de aa23 dérivé d’Aedes albopictus et de l’Aa23-T guéris de l’infection native de Wolbachia à l’aide d’antibiotiques.

Résumé

En tant qu’endosymbiote domestique de la mère, Wolbachia infecte de grandes proportions de populations d’insectes. Des études ont récemment rapporté la régulation réussie de la transmission du virus à ARN à l’aide de moustiques transfectés par Wolbachia. Les stratégies clés pour contrôler les virus comprennent la manipulation de la reproduction de l’hôte par incompatibilité cytoplasmique et l’inhibition des transcriptions virales par l’amorçage immunitaire et la concurrence pour les ressources dérivées de l’hôte. Cependant, les mécanismes sous-jacents des réponses des moustiques transfectés par Wolbachia à l’infection virale sont mal compris. Cet article présente un protocole pour l’identification in vitro de l’infection à Wolbachia aux niveaux d’acide nucléique et de protéines dans les cellules Aa23 d’Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) afin d’améliorer la compréhension des interactions entre Wolbachia et ses insectes vecteurs. Grâce à l’utilisation combinée de la réaction en chaîne par polymérase (PCR), de la PCR quantitative, du transfert western et des méthodes d’analyse immunologique, un protocole morphologique standard a été décrit pour la détection des cellules infectées par Wolbachia qui est plus précis que l’utilisation d’une seule méthode. Cette approche peut également être appliquée à la détection de l’infection à Wolbachia dans d’autres taxons d’insectes.

Introduction

Le moustique tigre asiatique Aedes albopictus (Skuse) (Diptères: Culicidae), qui est un vecteur clé du virus de la dengue (DENV) en Asie et dans d’autres parties du monde1, est un hôte naturel de deux types de bactéries intracellulaires, Wolbachia (wAlbA et wAlbB), qui sont réparties dans toute la lignée germinale et le tissu somatique 2,3. La lignée cellulaire Aa23 dérivée d’embryons d’A. albopictus se compose d’au moins deux types de cellules morphologiques, qui soutiennent tous deux l’infection4 et peuvent être guéris de l’infection native de Wolbachia à l’aide d’antibiotiques (Aa23-T). Étant donné que Aa23 ne conserve que wAlbB, c’est un modèle utile pour l’étude des interactions hôte-endosymbiote 4,5,6.

Wolbachia est transmis par la mère et infecte environ 65% des espèces d’insectes 8,9 et 28% des espèces de moustiques10. Il infecte une variété de tissus et forme une relation symbiotique intime avec l’hôte, induisant généralement une incompatibilité cytoplasmique (IC)11 et un remplacement de la population en manipulant le système reproducteur hôte12,13. Ces réponses de l’hôte ont été observées dans des populations naturelles de Drosophila simulans14 et chez A. aegypti dans une cage de laboratoire et un essai sur le terrain15. Une manipulation non reproductrice importante provoquée par Wolbachia est la résistance induite de l’hôte à une variété d’agents pathogènes, y compris le DENV, le virus Chikungunya (CHIKV) et le virus du Nil occidental (VNO)16,17, qui peut être médiée par un système immunitaire inné amélioré du symbiote18,19, la compétition entre Wolbachia et les virus pour les ressources essentielles de l’hôte20 et la manipulation des voies de défense virale de l’hôte21 .

Ce protocole a été développé pour étudier ces mécanismes sous-jacents des réponses antivirales de l’hôte induites par Wolbachia. Il utilise quatre méthodes de détection de l’infection intracellulaire à Wolbachia des cellules Aa23. Ces méthodes fournissent une base théorique solide pour les études de l’infection intracellulaire à Wolbachia d’autres espèces hôtes. La première méthode, la PCR - une technique puissante permettant l’amplification enzymatique de régions spécifiques de l’ADN sans utiliser de procédures de clonage conventionnelles - a été utilisée pour détecter l’ADN de Wolbachia et déterminer la présence / absence d’infection à Wolbachia 22. La deuxième méthode mesure la densité de copie de l’ADN de Wolbachia à l’aide de la PCR quantitative (qPCR) pour une détection et une mesure fiables des produits générés au cours de chaque cycle de PCR qui est directement proportionnelle à la quantité de gabarit avant la PCR23. La troisième méthode détecte la présence de protéines intracellulaires de Wolbachia , en utilisant le transfert de Western, l’un des outils les plus puissants pour détecter des protéines spécifiques dans des mélanges complexes en combinant le pouvoir de séparation élevé de l’électrophorèse, la spécificité des anticorps et la sensibilité des réactions enzymatiques chromogènes. La dernière méthode est un test d’immunofluorescence (IFA) qui combine l’immunologie, la biochimie et la microscopie pour détecter la protéine de surface de Wolbachia (wsp) par une réaction antigène-anticorps afin de confirmer l’absorption cellulaire de Wolbachia et de déterminer sa localisation cellulaire.

Cet article décrit les quatre méthodes énumérées ci-dessus pour vérifier l’existence de Wolbachia dans les cellules, qui peuvent être utilisées pour détecter si le Wolbachia exogène a été transfecté avec succès et si le Wolbachia dans la cellule a été éliminé. Après avoir déterminé si Wolbachia est présent dans les cellules ou non, une variété d’analyses différentes peuvent être effectuées, y compris la génomique, la protéomique ou la métabolomique. Ce protocole démontre la détection de Wolbachia à travers les cellules Aa23 mais peut également être utilisé dans d’autres cellules.

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Protocole

1. Matériaux et réactifs

  1. Utilisez des solutions et des milieux sans pyrogène pour la culture cellulaire (voir le Tableau des matériaux).
  2. Utilisez de l’eau ultrapure pour préparer toutes les solutions.
  3. Soyez prudent dans le choix du sérum fœtal bovin (FBS) pour la culture cellulaire, en suivant un processus de vérification du lot.
    REMARQUE: Comme les lots FBS sont sujets à des changements réguliers, il est impossible d’indiquer le catalogue et les numéros de lot pertinents dans ce protocole.
  4. Sélectionner des souches de cellules Aa23 dérivées d’œufs d’A. albopictus , correspondant à Aa23-T sans Wolbachia.

2. Culture cellulaire

  1. Préparer des flacons de culture cellulairede 25 cm 2 avec 4 mL de milieu de Schneider avec 10% de FBS.
  2. Incuber les flacons à 28 °C sous une atmosphère de 5 % deCO2 pendant 5 à 7 jours 7,24.
  3. Observez les cellules Aa23 et Aa23-T non colorées dans les flacons à l’aide de la microscopie optique à un grossissement de 100x (Figure 1).

3. Extraction de l’ADN

  1. Cultivez les cellules pendant 5-7 jours jusqu’à 70-80% de confluence par flacon (étape 2). Prélever les cellules par pipetage manuel à partir de 1 mL de milieu de culture remis en suspension par centrifugation pendant 5 min à 100 × g dans une microcentrifugeuse.
  2. Retirer le surnageant par aspiration et stocker la pastille cellulaire résultante à -20 °C.
  3. Remettre les granulés dans 0,40 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), placer 50 μL de la solution dans un tube de microcentrifugeuse, ajouter 5 μL de protéinase K (20 mg/mL) et incuber à 55 °C pendant 1 h. Enfin, chauffer ces tubes à 99 °C pendant 15 min pour obtenir l’ADN brut et le stocker à -20 °C.

4. Détection de l’acide nucléique Wolbachia

  1. Analyse PCR
    1. Effectuer la PCR dans un volume de réaction total de 20 μL, contenant 8 μL de ddH2O, 10 μL de Taq polymérase (voir la Table des matériaux), 1 μL de gabarit d’ADN (à partir de l’étape 3), 0,5 μL d’amorces avant et arrière (10 μM) : wsp81F (5' TGG TCC AAT AAG TGATGA AGAAAC 3') et wsp691R (5' AAA AAT TAA ACG CTC CA 3')25, respectivement.
    2. Utiliser les conditions de PCR suivantes : dénaturation initiale à 95 °C pendant 5 min, suivie de 35 cycles de dénaturation à 94 °C, recuit à 55 °C et extension à 72 °C ; puis, une dernière prolongation à 72 °C pendant 7 min.
    3. Détecter l’ADN sur un gel d’agarose à 1 % (1 % p/v d’agarose dans le PBS) à l’aide d’un imageur de gel.
  2. Analyse qPCR
    1. Analyser la copie du génome de Wolbachia pour trois répliques biologiques (n = 6) de l’ADN extrait (étape 3) à l’aide des amorces wsp 183 F (5' AAGGAACCGAAGTTCATG 3') et QBrev R (5' AGTTGAGAGTAAAGTCCC 3')22, normalisées avec des amorces avant et arrière de la protéine ribosomique S6 (RPS6) (5' GAAGTTGAACGTATCGTTTC 3' et 5' GAGATGGTCAGGTGATTT 3', respectivement)3.
    2. Générez une courbe standard pour wAlbB et RPS6.
      1. Extraire l’ADN de PMD-18T (un vecteur spécial pour le clonage efficace de produits PCR (clonage TA)) plasmide recombinant contenant des fragments de gènes wsp et rps6 (fichier supplémentaire) et mesurer la concentration d’ADN plasmidique (voir la table des matériaux).
      2. Convertissez la concentration d’ADN plasmidique en concentration en nombre de copies à l’aide de Eq (1).
        Nombre de copies plasmidiques = figure-protocol-3997 (1)
      3. Diluer le nombre de copies plasmidiques de 101 à 108 avec de l’eau ultrapure et définir 3 répliques pour chaque gradient de concentration.
      4. Effectuez une amplification qPCR à l’aide de TB Green et d’un système de PCR en temps réel (voir la table des matériaux) et enregistrez les résultats de chaque réaction. Utilisez la valeur Ct pour développer une courbe standard. Analyser l’ADN dans un volume de réaction total de 20 μL, comprenant 7 μL de ddH2O, 10,4 μL de TB Green (voir la Table des matériaux), 1 μL de gabarit d’ADN (fourni par l’étape 3) et 0,8 μL d’amorces avant et arrière (10 μM). Utilisez les conditions de réaction suivantes : dénaturation initiale à 95 °C pendant 5 min, suivie de 40 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 10 s, et recuit à 60 °C pendant 35 s.
      5. Calculer le nombre de copies des gènes WSP et RPS6 dans les cellules en fonction de la courbe standard établie et de la densité relative de Wolbachia par le nombre de copies de wsp/RPS6. Analysez les données à l’aide d’un test t d’échantillons indépendants.
  3. Analyse par transfert de Western de la protéine Wolbachia
    1. Extraction de protéines
      1. Prélever 2 × 10cellules Aa23 et Aa23-T de 10 7 dans la plaque à six puits (à partir de l’étape 2) dans un tube de microcentrifugation, les laver trois fois avec du PBS et les centrifuger à 100 × g pendant 5 min à 4 °C.
      2. Préparer 1 mL de lysats avec un tampon de lyse RIPA (50 mM Tris (pH 7,4), 150 mM de NaCl, 1 % de Triton X-100, 1 % de désoxycholate de sodium, 0,1 % de dodécylsulfate de sodium [SDS], 2 mM de pyrophosphate de sodium, 25 mM de β-glycérophosphate, 1 mM d’EDTA, 1 mM Na3VO4, 0,5 μg/mL de leupeptine) et PMSF (concentration finale 1 mM).
      3. Ajouter 200 μL de tampon de lyse à la pastille cellulaire et maintenir pendant 30 min sur de la glace. Centrifuger les lysats à 12 000 × g pendant 10 min à 4 °C et retirer le surnageant.
    2. Analyser la concentration de wsp du surnageant à l’aide d’une trousse d’analyse des protéines de l’acide bicinchoninique (ACB) (voir la table des matériaux) en suivant les instructions du fabricant.
    3. Charger des quantités égales de protéines sur un gel SDS-PAGE à 15 % [10 % d’eau distillée; 50 % (30 % Acr-Bis (29:1), 38 % 1 M Tris, pH 8,8 ; 1 % (10 % SDS), 1 % (persulfate d’ammonium à 10 %), 0,04 % TEMED].
    4. Transférer la protéine dans des membranes de nitrocellulose, bloquer les membranes avec du lait écrémé à 5 % pendant2 h 26,27 à température ambiante, puis laver les membranes trois fois avec du TBST (1 mL de Tween 20 sur 1 L de TBS) (voir le Tableau des matériaux).
    5. Incuber les membranes pendant la nuit à 4 °C avec 100 μL d’anticorps polyclonal anti-wsp (préparés en interne, voir Fichier supplémentaire)), préparés en diluant l’anticorps primaire avec du lait écrémé à 5 % (1:12 000).
    6. Lavez l’anticorps primaire trois fois avec TBST.
    7. Incuber les membranes dans 100 μL d’anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) sur un agitateur pendant 1 h à température ambiante.
    8. Lavez les membranes trois fois avec tbST et mélangez 20 μL de solution A (réactif luminol de substrat HRP) et 20 μL de solution B (réactif de peroxyde de substrat HRP) dans le kit de détection de chimiluminescence dans un rapport de 1:1. Plongez l’ensemble de la membrane dans la solution de luminescence en même temps et observez les signaux à l’aide d’un système d’imagerie multifonctionnel.
  4. Localisation par immunofluorescence de la protéine Wolbachia
    1. Incuber 5 × 105 cellules Aa23 et Aa23-T à 28 °C sur une boîte de Petri confocale laser d’une épaisseur de 0,17 mm en fond, sous une atmosphère de CO2 à 5% pendant 3 à 4 jours 7,24. Attendez que la cellule soit à 60% à 70% de confluence et lavez les cellules trois fois avec PBS.
    2. Fixer les cellules pendant 20 min à 4 °C dans 1 mL de paraformaldéhyde à 4 % (p/v) dans le PBS.
    3. Lavez les cellules fixes à l’aide de PBST (0,2 % v/v Triton X-100 dans PBS) pendant 5 min et lavez à nouveau les cellules deux fois avec PBS.
    4. Incuber les lames pendant 1 h à 37 °C dans 1 mL d’albumine sérique bovine à 3 % (p/v) dans du PBS.
    5. Incuber les lames pendant la nuit dans 100 μL d’anticorps polyclonal anti-wsp de souris (préparé en interne) et de sérum de souris (dilution de 1:1 000 dans du PBS) dans une boîte humide (il peut maintenir l’humidité et empêcher l’humidité de s’évaporer) à 4 °C.
    6. Retirez les glissières de la boîte humide et remettez-les à température ambiante; lavez-les trois fois avec pbS et retirez le PBS.
      REMARQUE: À partir de l’étape 4.4.7, toutes les opérations doivent être protégées de la lumière.
    7. Incuber les lames avec 100 μL d’un anticorps anti-souris de chèvre conjugué Alexa Fluor 488 (dilution 1:2 000 dans pbS) à 37 °C pendant 30 min.
    8. Incuber les lames de l’échantillon avec 50 μL de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI dilué dans du PBS à 10 μg/mL, se lie fortement à l’ADN) à 37 °C pendant 5 min, puis les laver trois fois avec du PBS.
    9. Observez l’immunocoloration au microscope confocal.
      1. Allumez l’alimentation et le laser.
      2. Allumez les lampes normales et au mercure du microscope.
      3. Démarrez le système et exécutez le logiciel d’exploitation. Placez une goutte d’huile de cèdre sur les lames d’échantillon, placez les lames d’échantillon sur la scène du microscope et déplacez la scène à la position appropriée.
      4. Cliquez sur le bouton d’observation de la lampe au mercure dans le logiciel, ouvrez l’obturateur de la lampe au mercure et observez l’échantillon sous un microscope inversé pour faire la mise au point.
      5. Utilisez le panneau de commande manuel pour sélectionner la fluorescence verte et bleue afin de prendre des photos de fluorescence sous un grossissement de 100x.
      6. Éteignez le bouton d’observation de la lampe au mercure et commencez à acquérir des images.
      7. Pour garantir une bonne qualité d’image, prénumérisez par taille de numérisation (512 pixels x 512 pixels). Ajustez la taille de numérisation pour obtenir des images claires (1 024 pixels x 1 024 pixels).
      8. Effectuez une réduction du bruit si le bruit de fond est trop élevé.
      9. Arrêtez la numérisation et enregistrez les images.
      10. Éteignez la lampe au mercure et les lasers.
      11. Essuyez l’objectif avec 75% d’alcool et abaissez l’objectif à la position la plus basse.
      12. Coupez l’obturateur et l’alimentation du microscope.
      13. Une fois l’instrument refroidi, couvrez-le avec le couvercle anti-poussière.

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Résultats

Avant la détection de Wolbachia , les cellules Aa23 et Aa23-T ont été observées au microscope optique pour déterminer les différences morphologiques entre les deux lignées cellulaires. Les cellules Aa23 et Aa23-T ont au moins deux morphologies cellulaires, mais aucune différence morphologique évidente entre les deux types de cellules (Figure 1). Ici, les cellules Aa23 ont été utilisées comme système modèle pour détecter l’infection à Wolbachia<...

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Discussion

La détection de l’infection intracellulaire à Wolbachia est essentielle pour l’étude des interactions Wolbachia-hôte et la confirmation de la transfection réussie des cellules avec de nouvelles souches. Dans ce protocole, quatre méthodes ont été utilisées pour détecter avec succès l’infection intracellulaire à Wolbachia aux niveaux d’acide nucléique et de protéines. Ces quatre méthodes expérimentales ont corroboré et amélioré la précision de détection de l’infecti...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Nous remercions le Dr Xin-Ru Wang de l’Université du Minnesota pour ses suggestions et ses conseils perspicaces. Ce travail a été soutenu par une subvention de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (No.81760374).

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
MicroscopeZeissSteREO Discovery V8
Petri dishFisher ScietificFB0875713
PipettePipetmanF167380P10
inSituX platform
Analysis softwareIn-house developed
Cerium doped yttrium aluminum garnetMSE SuppliesCe:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates
Chip holderIn-house developed
Control softwareIn-house developed
Immersion oilCargille Laboratories16482Type A low viscosity 150 cSt
inSituX platformIn-house developed
IR light source Thorlabs IncorporatedLED1085LLED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18
Outer ring In-house developed
Pump lasers Thorlabs IncorporatedLD785-SE400785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode
Raspberry PiRaspberry Pi Fundation
Retaining ringThorlabs IncorporatedSM1RRSM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts
Seedless quartz crystalUniversity Wafers, Inc.U01-W2-L-19051425.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X
ShimIn-house developed
X-ray beam stopIn-house developed

Références

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