Aedes albopictus 세포주에서 Wolbachia 균주 wAlbB 검출

요약

네 가지 방법이 세포 내 Wolbachia를 검출하기 위해 사용되었는데, 이는 서로를 보완하고 항생제를 사용하여 네이티브 울바키아 감염의 Aa23 및 Aa23-T가 완치된 Aedes albopictus 유래 Aa23 및 Aa23-T의 Wolbachia 감염의 검출 정확도를 향상시켰다.

초록

모성으로 품어진 내생 생물로서 Wolbachia는 곤충 개체군의 많은 부분을 감염시킵니다. 최근 연구에 따르면 울바키아 형질감염된 모기를 이용한 RNA 바이러스 전염의 성공적인 조절이 보고되었다. 바이러스를 조절하기 위한 주요 전략은 세포질 비양립성을 통한 숙주 재생의 조작과 숙주 유래 자원에 대한 면역 프라이밍 및 경쟁을 통한 바이러스 전사체의 억제를 포함한다. 그러나 바이러스 감염에 대한 Wolbachia-transfected 모기의 반응의 근본적인 메커니즘은 잘 이해되지 않았습니다. 이 논문은 울바키아와 그의 곤충 벡터 사이의 상호작용에 대한 이해를 향상시키기 위해 Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23 세포에서 핵산 및 단백질 수준에서 울바키아 감염의 시험관내 확인을 위한 프로토콜을 제시 한다. 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 정량적 PCR, 웨스턴 블롯 및 면역학적 분석 방법의 조합된 사용을 통해, 단일 방법의 사용보다 더 정확한 울바치아 감염 세포의 검출을 위한 표준 형태학적 프로토콜이 기술되었다. 이 접근법은 또한 다른 곤충 탁사에서 울바키아 감염의 검출에 적용될 수 있다.

서문

아시아 호랑이 모기 Aedes albopictus (Skuse) (Diptera : Culicidae)는 아시아 및 세계¹의 다른 지역에서 뎅기열 바이러스 (DENV)의 핵심 벡터이며, 생식선과 체세포 조직 ^2,3에 걸쳐 분포하는 두 가지 유형의 세포 내 박테리아 인 Wolbachia (wAlbA 및 wAlbB)의 자연 숙주입니다. A. 알보픽투스 배아로부터 유래된 Aa23 세포주는 적어도 두 가지 형태학적 세포 유형으로 구성되며, 둘 다 감염⁴를 지지하고 항생제(Aa23-T)를 사용하여 천연 울바키아 감염을 치료할 수 있다. Aa23이 단지 wAlbB만을 보유한다는 것을 감안할 때, 숙주-endosymbiont 상호작용 ^4,5,6의 연구에 유용한 모델이다.

울바키아는 모성으로 전염되며 곤충 종 ^8,9의 약 65 %와 모기 종¹⁰의 28 %를 감염시킵니다. 그것은 다양한 조직을 감염시키고 숙주와 친밀한 공생 관계를 형성하며, 일반적으로 숙주 생식 시스템(^12,13)을 조작함으로써 세포질 비적합성(CI)¹¹ 및 집단 대체를 유도한다. 이러한 숙주 반응은 초파리 시뮬란(14)의 자연 개체군에서, 그리고 실험실 케이지 및 현장 시험(¹⁵)에서 A. aegypti에서 관찰되었다. 울바키아에 의해 도출된 중요한 비생식 조작은 DENV, 치쿤구냐 바이러스(CHIKV) 및 웨스트나일 바이러스(WNV)^16,17을 포함하는 다양한 병원체에 대한 숙주 내성을 유도하는데, 이는 공생^18,19의 개선된 선천적 면역계^, 필수 숙주 자원에 대한 울바키아와 바이러스 사이의 경쟁(²⁰), 및 숙주 바이러스 방어 경로의 조작(21)에 의해 매개될 수 있다. .

이 프로토콜은 울바키아-유도된 숙주 항바이러스 반응의 이러한 근본적인 메카니즘을 연구하기 위해 개발되었다. 그것은 Aa23 세포의 세포 내 울바키아 감염의 검출의 네 가지 방법을 사용합니다. 이러한 방법은 다른 숙주 종의 세포 내 울바키아 감염에 대한 연구를위한 강력한 이론적 기반을 제공합니다. 첫 번째 방법은, PCR-종래의 클로닝 절차를 이용하지 않고 DNA의 특정 영역의 효소적 증폭을 허용하는 강력한 기술-울바키아 DNA를 검출하고 울바키아 감염⁽²²)의 존재/부재를 결정하기 위해 사용되었다. 두 번째 방법은 PCR²³ 이전의 주형의 양에 직접적으로 비례하는 각 PCR 주기 동안 생성된 산물의 신뢰할 수 있는 검출 및 측정을 위해 정량적 PCR(qPCR)을 사용하여 울바키아 DNA 카피 밀도를 측정한다. 세 번째 방법은 전기 영동의 높은 분리력, 항체의 특이성 및 발색 효소 반응의 민감도를 결합하여 복잡한 혼합물에서 특정 단백질을 검출하는 가장 강력한 도구 중 하나 인 웨스턴 블롯을 사용하여 세포 내 Wolbachia 단백질의 존재를 감지합니다. 최종 방법은 면역학, 생화학 및 현미경을 결합하여 항원 - 항체 반응을 통해 울바키아 표면 단백질 (wsp)을 검출하여 울바키아의 세포 흡수를 확인하고 세포 국소화를 결정하는 면역 형광 분석 (IFA)입니다.

이 논문은 세포에 Wolbachia의 존재를 확인하기 위해 위에 열거 된 네 가지 방법을 설명합니다.이 방법은 외인성 Wolbachia가 성공적으로 형질감염되었고 세포의 Wolbachia가 제거되었는지 여부를 감지하는 데 사용할 수 있습니다. Wolbachia가 세포에 존재하는지 여부를 결정한 후, 유전체학, 프로테오믹스 또는 대사체학을 포함한 다양한 분석을 수행 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 Aa23 세포를 통한 울바키아의 검출을 보여 주지만 다른 세포에서도 사용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 재료 및 시약

1. 세포 배양을 위해 발열원이없는 용액과 배지를 사용하십시오 ( 재료 표 참조).
2. 초순수를 사용하여 모든 용액을 준비하십시오.
3. 세포 배양을 위해 태아 소 혈청 (FBS)을 선택할 때 조심하십시오, 로트 확인 과정을 따르십시오.
   참고: FBS 로트는 정기적으로 변경될 수 있으므로 이 프로토콜에서 관련 카탈로그 및 로트 번호를 명시하는 것은 불가능합니다.
4. 울바키아 프리 Aa23-T에 해당하는 A. 알보픽투스 알로부터 유래된 Aa23 세포 균주를 선택하십시오.

2. 세포 배양

1. 슈나이더 배지^{4mL와 함께 25cm2} 세포 배양 플라스크를 10% FBS로 준비합니다.
2. 플라스크를 5% CO2 분위기 하에서₂₈°C에서 5 내지 7일 동안 ^7,24일 동안 인큐베이션한다.
3. 100x 배율에서 광 현미경을 사용하여 플라스크에서 염색되지 않은 Aa23 및 Aa23-T 세포를 관찰하십시오 (그림 1).

3. DNA 추출

1. 플라스크 당 70-80% 합류할 때까지 세포를 5-7일 동안 배양한다(단계 2). 세포를 마이크로원심분리기에서 100 × g에서 5분 동안 원심분리하여 재현탁된 배양 배지 1 mL로부터 수동 피펫팅으로 수확하였다.
2. 흡인에 의해 상청액을 제거하고 생성된 세포 펠릿을 -20°C에서 저장한다.
3. 펠렛을 0.40 mL의 인산완충식염수(PBS)에 재현탁시키고, 용액 50μL를 미세원심분리 튜브에 넣고, 5μL의 프로테이나제 K(20mg/mL)를 첨가하고, 55°C에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 마지막으로, 이들 튜브를 99°C에서 15분 동안 가열하여 조질 DNA를 수득하고 이를 -20°C에서 저장한다.

4. 울바키아 핵산의 검출

1. PCR 분석
   1. 8 μL의 ddH2O, 10 μL의 Taq 중합효소(물질 표 참조), 1 μL의 DNA 주형(단계 3부터), 0.5 μL의 정방향 및 역방향 프라이머(10 μM)를 함유하는₂₀μL의 총 반응 부피에서 PCR을 수행한다: wsp81 F(5' TGG TCC AAT AAG TGATGA AGAAAC 3') 및 wsp691R(5' AAA AAT TAA ACG CTA CTC CA 3')²⁵, 각각.
   2. 다음의 PCR 조건을 사용한다: 95°C에서 5분 동안 초기 변성, 이어서 94°C에서 변성의 35 사이클, 55°C에서 어닐링, 및 72°C에서 연장; 이어서, 72°C에서 7분 동안 최종 연장하였다.
   3. 겔 이미저를 사용하여 1% 아가로스 겔(PBS에서 1% w/v 아가로스)에서 DNA를 검출한다.
2. qPCR 분석
   1. wsp 프라이머 183F (5' AAGGAACCGAAGTTCATG 3') 및 QBrev R (5' AGTTGAGAGTAAGTCCC 3')²², 리보솜 단백질 S6 (RPS6) 정방향 및 역방향 프라이머 (5' GAAGTTGAACGTATCGTTTC 3' 및 5' GAGATGGTCAGCGTGTGTT 3')3')를 사용하여 추출된 DNA (단계 3)로부터 ³개의 생물학적 복제물 (n=6)에 대한 울바키아 게놈 카피를 분석한다.
   2. wAlbB 및 RPS6에 대한 표준 곡선을 생성합니다.
      1. wsp 및 rps6 유전자 단편을 함유하는 PMD-18T(PCR 산물의 효율적인 클로닝(TA 클로닝)를 위한 특수 벡터)로부터 DNA를 추출하고 플라스미드 DNA 농도를 측정하였다(표 참조).
      2. 플라스미드 DNA 농도를 Eq (1)를 사용하여 카피 수 농도로 전환시킨다.
         플라스미드 카피 수 = (1)
      3. 플라스미드 카피 수 10¹ 내지 10⁸ 을 초순수로 희석하고, 각 농도 구배에 대해 3 반복실험을 설정한다.
      4. TB Green 및 실시간 PCR 시스템을 사용하여 qPCR 증폭을 수행하고(물질 표 참조), 각 반응의 결과를 기록한다. Ct 값을 사용하여 표준 곡선을 개발합니다. 7 μL의 ddH2O, 10.4 μL의 TB Green (물질의 표 참조), 1 μL의 DNA 주형 (단계 3에 의해 제공됨) 및 0.8 μL의 정방향 및 역방향 프라이머 (10 μM)를 포함하는₂₀μL의 총 반응 부피에서 DNA를 분석한다. 다음의 반응 조건을 사용하십시오: 95°C에서 5분 동안 초기 변성, 이어서 95°C에서 10초 동안 변성의 40 사이클, 및 60°C에서 35초 동안 어닐링.
      5. 확립된 표준 곡선에 따라 세포의 WSP 및 RPS6 유전자 카피 수를 계산하고, wsp/RPS6의 카피 수에 의해 울바키아 상대 밀도를 계산한다. 독립적인 샘플 t-검정을 사용하여 데이터를 분석합니다.
3. 울바키아 단백질의 웨스턴 블롯 분석
   1. 단백질 추출
      1. 2 ×^10,7 Aa23 및 Aa23-T 세포를 6-웰 플레이트 (단계 2로부터)로부터 마이크로원심분리 튜브에서 수집하고, 이를 PBS로 3회 세척하고, 이를 4°C에서 5분 동안 100 × g 에서 원심분리한다.
      2. RIPA 용해액 (50 mM 트리스 (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1%Triton X-100, 1% 소듐 데옥시콜레이트, 0.1% 소듐 도데실 설페이트 [SDS], 2 mM 소듐 피로포스페이트, 25 mM β-글리세로포스페이트, 1 mM EDTA, 1 mM_Na3VO4, 0.5 μg/mL 류펩틴) 및 PMSF (최종 농도 1 mM)로 1 mL 용해물을 준비한다.
      3. 세포 펠릿에 용해 완충액 200μL를 첨가하고 얼음 위에서 30분 동안 유지한다. 용해물을 4°C에서 10분 동안 12,000 × g 에서 원심분리하고 상층액을 제거하였다.
   2. 제조자의 지시에 따라 비신코닌산(BCA) 단백질 분석 키트( 물질의 표 참조)를 사용하여 상청액의 wsp 농도를 분석한다.
   3. 15% SDS-PAGE 겔에 동량의 단백질을 로딩[10% 증류수; 50% (30% Acr-Bis (29:1), 38% 1 M 트리스, pH 8.8; 1% (10% SDS), 1% (10% 과황산암모늄), 0.04% TEMED].
   4. 단백질을 니트로셀룰로스 막으로 옮기고, 실온에서 2시간^26,27분 동안 5% 탈지유로 막을 차단한 다음^, TBST(TBS 1 L의 트윈 20 mL)로 멤브레인을 3회 세척한다(물자 표 참조).
   5. 멤브레인을 100 μL의 항-wsp 폴리클로날 항체 (사내에서 제조, 보충 파일 참조)와 함께 4°C에서 밤새 인큐베이션하고, 1차 항체를 5% 탈지유 (1:12,000)로 희석하여 준비한다.
   6. 일차 항체를 TBST로 세 번 세척한다.
   7. 멤브레인을 100 μL의 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)-접합된 이차 항체를 진탕기 상에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
   8. 멤브레인을 TBST로 세 번 세척하고, 화학발광 검출 키트에 용액 A(HRP 기질 루미놀 시약) 20μL와 용액 B(HRP 기질 과산화물 시약) 20μL를 1:1의 비율로 혼합한다. 멤브레인 전체를 발광 용액에 동시에 담그고, 다기능 이미징 시스템을 이용하여 신호를 관찰한다.
4. 울바키아 단백질의 면역형광 국소화
   1. 5 × 10^5Aa23 및 Aa23-T 세포를 바닥에서 두께 0.17 mm의 레이저 공초점 페트리 디쉬 상에서 28°C에서, 5%_CO2 분위기 하에서 3 내지 4일 동안 ^7,24일 동안 인큐베이션한다. 세포가 60%-70% 합류할 때까지 기다렸다가 PBS로 세포를 세 번 세척한다.
   2. 세포를 PBS 중의 4% (w/v) 파라포름알데히드 1 mL에 4°C에서 20분 동안 고정시켰다.
   3. 고정된 세포를 PBST (PBS 중 0.2% v/v 트리톤 X-100)를 사용하여 5분 동안 세척하고 PBS로 세포를 다시 2회 세척하였다.
   4. 슬라이드를 PBS 중의 3%(w/v) 소 혈청 알부민 1 mL에서 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
   5. 슬라이드를 100 μL의 마우스 항-wsp 폴리클로날 항체 (사내에서 제조) 및 마우스 혈청 (PBS에서 1:1,000 희석액)에서 하룻밤 동안 습윤 박스 (습도를 유지하고 수분이 증발하는 것을 방지할 수 있음)에서 4°C에서 인큐베이션한다.
   6. 젖은 상자에서 슬라이드를 제거하고 실온으로 되돌립니다. 이를 PBS로 세 번 세척하고 PBS를 제거하였다.
      참고: 4.4.7단계부터 모든 작업을 빛으로부터 보호해야 합니다.
   7. 슬라이드를 100 μL의 알렉사 플루오르 488-컨쥬게이션된 염소 항-마우스 항체 (PBS 중 1:2,000 희석액)와 함께 37°C에서 30분 동안 인큐베이션한다.
   8. 샘플 슬라이드를 50 μL의 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (PBS에서 10 μg/mL로 희석된 DAPI, DNA에 강하게 결합함)으로 5분 동안 37°C에서 인큐베이션한 다음, PBS로 3회 세척한다.
   9. 공초점 현미경으로 면역 염색을 관찰하십시오.
      1. 전원과 레이저를 켭니다.
      2. 현미경의 일반 및 수은 램프를 켭니다.
      3. 시스템을 시작하고 운영 소프트웨어를 실행하십시오. 샘플 슬라이드에 삼나무 기름 한 방울을 넣고 샘플 슬라이드를 현미경 단계에 놓고 스테이지를 적절한 위치로 옮깁니다.
      4. 소프트웨어에서 수은 램프 관찰 버튼을 클릭하고 수은 램프 셔터를 연 다음 거꾸로 된 현미경으로 샘플을 관찰하여 초점을 맞춥니다.
      5. 수동 제어판을 사용하여 녹색과 파란색 형광을 선택하여 100x 배율로 형광 사진을 찍습니다.
      6. 수은 램프 관찰 버튼을 끄고 이미지 획득을 시작하십시오.
      7. 좋은 이미지 품질을 보장하려면 스캔 크기(512픽셀 x 512픽셀)로 미리 스캔합니다. 스캔 크기를 조정하여 선명한 이미지(1,024픽셀 x 1,024픽셀)를 가져옵니다.
      8. 배경 소음이 너무 높으면 소음 감소를 수행하십시오.
      9. 스캔을 중지하고 이미지를 저장하십시오.
      10. 수은 램프와 레이저를 끕니다.
      11. 75% 알코올로 목표를 닦아내고 목표를 가장 낮은 위치로 낮춥니다.
      12. 셔터와 현미경 전원을 끕니다.
      13. 계측기가 냉각되면 먼지 덮개로 덮으십시오.

결과

울바키아가 검출되기 전에, Aa23 및 Aa23-T 세포를 광학 현미경으로 관찰하여 두 세포주 사이의 형태학적 차이를 확인하였다. Aa23 및 Aa23-T 세포는 적어도 두 개의 세포 형태를 갖지만 두 세포 유형 사이에 명백한 형태학적 차이는 없다(도 1). 여기서, Aa23 세포는 네 가지 방법을 사용하여 울바키아 감염을 검출하기 위한 모델 시스템으로 사용되었다. 진?...

토론

세포 내 울바키아 감염의 검출은 울바키아-숙주 상호작용의 연구와 새로운 균주를 가진 세포의 성공적인 형질감염의 확인에 필수적이다. 이 프로토콜에서는 핵산 및 단백질 수준에서 세포 내 울바키아 감염을 성공적으로 검출하기 위해 네 가지 방법이 사용되었습니다. 이 네 가지 실험 방법은 세포의 울바키아 감염의 검출 정확도를 확증하고 개선시켰다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope	Zeiss		SteREO Discovery V8
Petri dish	Fisher Scietific	FB0875713
Pipette	Pipetman	F167380	P10
inSituX platform
Analysis software	In-house developed
Cerium doped yttrium aluminum garnet	MSE Supplies		Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates
Chip holder	In-house developed
Control software	In-house developed
Immersion oil	Cargille Laboratories	16482	Type A low viscosity 150 cSt
inSituX platform	In-house developed
IR light source	Thorlabs Incorporated	LED1085L	LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18
Outer ring	In-house developed
Pump lasers	Thorlabs Incorporated	LD785-SE400	785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode
Raspberry Pi	Raspberry Pi Fundation
Retaining ring	Thorlabs Incorporated	SM1RR	SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts
Seedless quartz crystal	University Wafers, Inc.	U01-W2-L-190514	25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X
Shim	In-house developed
X-ray beam stop	In-house developed