Обнаружение штамма Wolbachia wAlbB в клеточных линиях Aedes albopictus

Резюме

Для выявления внутриклеточной вольбахии использовались четыре метода, которые дополняли друг друга и повышали точность обнаружения инфекции Wolbachia Aedes albopictus Aa23 и Aa23-T, вылеченной от нативной инфекции Wolbachia с использованием антибиотиков.

Аннотация

Как материнский эндосимбионт, Wolbachia заражает большую часть популяций насекомых. Недавно в исследованиях сообщалось об успешной регуляции передачи РНК-вируса с использованием комаров, транс инфицированных Wolbachia. Ключевые стратегии борьбы с вирусами включают манипулирование размножением хозяина через цитоплазматическую несовместимость и ингибирование вирусных транскриптов посредством иммунного прайминга и конкуренции за ресурсы, полученные от хозяина. Однако основные механизмы реакций комаров, транс инфицированных Вольбахией, на вирусную инфекцию плохо изучены. В этой статье представлен протокол идентификации in vitro инфекции Wolbachia на уровнях нуклеиновых кислот и белка в клетках Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23 для улучшения понимания взаимодействий между Wolbachia и ее насекомыми-переносчиками. Благодаря комбинированному использованию полимеразной цепной реакции (ПЦР), количественной ПЦР, западного блоттинга и иммунологических аналитических методов был описан стандартный морфологический протокол для обнаружения клеток, инфицированных Вольбахией, который является более точным, чем использование одного метода. Этот подход также может быть применен к обнаружению инфекции Wolbachia у других таксонов насекомых.

Введение

Азиатский тигровый комар Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae), который является ключевым переносчиком вируса денге (DENV) в Азии и других частях мира¹, является естественным хозяином двух типов внутриклеточных бактерий, Wolbachia (wAlbA и wAlbB), которые распределены по всей зародышевой линии и соматической ткани ^2,3. Клеточная линия Aa23, полученная из эмбрионов A. albopictus, состоит, по меньшей мере, из двух морфологических типов клеток, оба из которых поддерживают инфекцию⁴ и могут быть излечены от нативной инфекции Wolbachia с использованием антибиотиков (Aa23-T). Учитывая, что Aa23 сохраняет только wAlbB, это полезная модель для изучения взаимодействий хозяин-эндосимбионт ^4,5,6.

Wolbachia передается через мать и заражает, по оценкам, 65% видов насекомых ^8,9 и 28% видов комаров¹⁰. Он инфицирует различные ткани и формирует интимные симбиотические отношения с хозяином, обычно вызывая цитоплазматическую несовместимость (CI)¹¹ и популяционную замену путем манипулирования репродуктивной системой хозяина^12,13. Эти ответы хозяина наблюдались в естественных популяциях Drosophila simulans¹⁴ и у A. aegypti в лабораторной клетке и полевых испытаниях¹⁵. Важной нерепродуктивной манипуляцией, вызванной Вольбахией, является индуцированная устойчивость хозяина к различным патогенам, включая DENV, вирус чикунгуньи (CHIKV) и вирус Западного Нила (ВЗН)^16,17, которые могут быть опосредованы улучшенной врожденной иммунной системой симбионта^18,19, конкуренцией между Wolbachia и вирусами за основные ресурсы хозяина²⁰ и манипулированием путями вирусной защиты хозяина²¹ .

Этот протокол был разработан для изучения этих основных механизмов противовирусных реакций хозяина, вызванных Вольбахией. В нем используются четыре метода выявления внутриклеточной вольбахской инфекции клеток Aa23. Эти методы обеспечивают прочную теоретическую основу для исследований внутриклеточной инфекции Wolbachia других видов хозяев. Первый метод, ПЦР - мощный метод, позволяющий ферментативную амплификацию определенных областей ДНК без использования обычных процедур клонирования - был использован для обнаружения ДНК Wolbachia и определения наличия /отсутствия инфекции Wolbachia ²². Второй метод измеряет плотность копий ДНК Wolbachia с использованием количественной ПЦР (qPCR) для надежного обнаружения и измерения продуктов, генерируемых во время каждого цикла ПЦР, что прямо пропорционально количеству шаблона до ПЦР²³. Третий метод обнаруживает наличие внутриклеточных белков Wolbachia , используя западный блот — один из самых мощных инструментов для обнаружения специфических белков в сложных смесях путем сочетания высокой силы разделения электрофореза, специфичности антител и чувствительности хромогенных ферментативных реакций. Окончательным методом является иммунофлуоресцентный анализ (IFA), который сочетает иммунологию, биохимию и микроскопию для обнаружения поверхностного белка Wolbachia (wsp) через реакцию антиген-антитело для подтверждения клеточного поглощения Wolbachia и определения его клеточной локализации.

В этой статье описываются четыре метода, перечисленные выше для проверки существования Wolbachia в клетках, которые могут быть использованы для определения того, была ли экзогенная Wolbachia успешно трансфектирована и Wolbachia в клетке была очищена. После определения того, присутствует ли Вольбахия в клетках или нет, может быть выполнено множество различных анализов, включая геномику, протеомику или метаболомику. Этот протокол демонстрирует обнаружение Wolbachia через клетки Aa23, но также может быть использован в других клетках.

протокол

1. Материалы и реагенты

1. Используйте безпирогеновые растворы и среды для клеточной культуры (см. Таблицу материалов).
2. Используйте сверхчистую воду для приготовления всех растворов.
3. Будьте осторожны при выборе фетальной бычьей сыворотки (FBS) для клеточной культуры после процесса проверки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку лоты FBS могут регулярно изменяться, в этом протоколе невозможно указать соответствующий каталог и номера партий.
4. Выберите штаммы клеток Aa23, полученные из яиц A. albopictus , соответствующие Aa23-T без Wolbachia.

2. Клеточная культура

1. Приготовьте колбы с культурой^{25 см2} с 4 мл среды Шнайдера с 10% FBS.
2. Инкубируют колбы при 28 °C при 5% CO₂ атмосферы в течение 5-7 дней ^7,24.
3. Наблюдайте незапятнанные Aa23 и Aa23-T-клетки в колбах с помощью световой микроскопии при 100-кратном увеличении (рисунок 1).

3. Извлечение ДНК

1. Культивируйте клетки в течение 5-7 дней до 70-80% слияния на колбу (шаг 2). Собирают клетки с ручным пипетированием из 1 мл повторно суспендированной питательной среды методом центрифугирования в течение 5 мин при 100 × г в микроцентрифуге.
2. Удалите супернатант путем аспирации и храните полученную ячейку гранулы при -20 °C.
3. Повторно суспендировать гранулы в 0,40 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), поместить 50 мкл раствора в микроцентрифужную пробирку, добавить 5 мкл протеиназы K (20 мг/мл) и инкубировать при 55 °C в течение 1 ч. Наконец, нагревайте эти трубки при 99 °C в течение 15 мин, чтобы получить сырую ДНК и сохранить ее при -20 °C.

4. Обнаружение нуклеиновой кислоты Wolbachia

1. ПЦР-анализ
   1. Выполняют ПЦР в общем реакционном объеме 20 мкл, содержащем 8 мкл ddH_2O, 10 мкл taq-полимеразы (см. Таблицу материалов), 1 мкл шаблона ДНК (из стадии 3), 0,5 мкл прямых и обратных праймеров (10 мкМ): wsp81F (5' TGG TCC AAT AAG TGATGA AGAAAC 3') и wsp691R (5' AAT TAA ACG CTA CTC CA 3')²⁵, соответственно.
   2. Используйте следующие условия ПЦР: начальная денатурация при 95 °C в течение 5 мин, затем 35 циклов денатурации при 94 °C, отжиг при 55 °C и удлинение при 72 °C; затем окончательное расширение при 72 °C в течение 7 мин.
   3. Обнаружение ДНК на 1% агарозном геле (1% мас./об.агарозы в PBS) с помощью гелевого тепловизора.
2. Анализ qPCR
   1. Проанализируйте копию генома Wolbachia на три биологические реплики (n = 6) из извлеченной ДНК (этап 3) с использованием праймеров wsp 183 F (5' AAGGAACCGAAGTTCATG 3') и QBrev R (5' AGTTGAGAGTAAAGTCCC 3')²², нормализованных рибосомальным белком S6 (RPS6) прямыми и обратными праймерами (5' GAAGTTGAACGTATCGTTTC 3' и 5' GAGATGGTCAGCGGTGATTT 3', соответственно)³.
   2. Создайте стандартную кривую для wAlbB и RPS6.
      1. Извлечение ДНК из PMD-18T (специальный вектор для эффективного клонирования продуктов ПЦР (TA клонирование)) рекомбинантной плазмиды, содержащей фрагменты генов wsp и rps6 (Дополнительный файл) и измерение концентрации плазмидной ДНК (см. Таблицу материалов).
      2. Преобразуйте концентрацию плазмидной ДНК в концентрацию числа копий с помощью Eq (1).
         Номер копии плазмиды = (1)
      3. Разбавляют число плазмидных копий от 10¹ до 10⁸ сверхчистой водой, и устанавливают 3 реплики для каждого градиента концентрации.
      4. Выполните амплификацию qPCR с использованием TB Green и системы ПЦР в режиме реального времени (см. Таблицу материалов) и запишите результаты каждой реакции. Используйте значение Ct для разработки стандартной кривой. Проанализируйте ДНК в общем реакционном объеме 20 мкл, включающем 7 мкл ddH₂O, 10,4 мкл TB Green (см. Таблицу материалов), 1 мкл шаблона ДНК (предусмотренного этапом 3) и 0,8 мкл прямых и обратных праймеров (10 мкМ). Используйте следующие условия реакции: начальная денатурация при 95 °C в течение 5 мин, затем 40 циклов денатурации при 95 °C в течение 10 с и отжиг при 60 °C в течение 35 с.
      5. Рассчитайте количество копий генов WSP и RPS6 в клетках в соответствии с установленной стандартной кривой и относительной плотностью Wolbachia по числу копий wsp/RPS6. Анализируйте данные с помощью независимых образцов t-теста.
3. Вестерн-блот-анализ белка Wolbachia
   1. Экстракция белка
      1. Соберите 2 × 10⁷ Aa23 и Aa23-T-клеток из шестилуночной пластины (из стадии 2) в микроцентрифужной трубке, промыть их три раза PBS и центрифугировать их при 100 × г в течение 5 мин при 4 °C.
      2. Готовят 1 мл лизатов с буфером лизиса RIPA (50 мМ Tris (pH 7,4), 150 мМ NaCl, 1% Triton X-100, 1% дезоксихолата натрия, 0,1% додецилсульфата натрия [SDS], 2 мМ пирофосфата натрия, 25 мМ β-глицерофосфата, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ Na₃VO₄, 0,5 мкг/мл лейпептина) и PMSF (конечная концентрация 1 мМ).
      3. Добавьте 200 мкл буфера лизиса в гранулу клетки и выдерживайте в течение 30 минут на льду. Центрифугируют лизаты при 12 000 × г в течение 10 мин при 4 °C и удаляют супернатант.
   2. Анализ концентрации супернатанта wsp с использованием набора для анализа белка бицинхониновой кислоты (BCA) (см. Таблицу материалов) в соответствии с инструкциями производителя.
   3. Нагрузите равное количество белка на 15% гель SDS-PAGE [10% дистиллированной воды; 50% (30% Acr-Bis (29:1), 38% 1 M Tris, pH 8,8; 1% (10% SDS), 1% (10% персульфата аммония), 0,04% TEMED].
   4. Перенесите белок на нитроцеллюлозные мембраны, блокируйте мембраны 5% обезжиренным молоком в течение 2 ч ^26,27 при комнатной температуре, а затем трижды промывайте мембраны TBST (1 мл Tween 20 в 1 л TBS) (см. Таблицу материалов).
   5. Инкубировать мембраны в течение ночи при 4 °C со 100 мкл поликлонального антитела против wsp (приготовленного собственными силами, см. Дополнительный файл)), приготовленного путем разбавления первичного антитела 5% обезжиренным молоком (1:12 000).
   6. Промыть первичное антитело три раза с помощью TBST.
   7. Инкубируют мембраны в 100 мкл пероксидазы хрена (HRP)-конъюгированного вторичного антитела на шейкере в течение 1 ч при комнатной температуре.
   8. Промыть мембраны три раза TBST и смешать 20 мкл раствора A (HRP Substrate Luminol Regent) и 20 мкл раствора B (HRP Substrate Peroxide Reagent) в наборе для детектирования хемилюминесценции в соотношении 1:1. Одновременно погрузите всю мембрану в люминесцентный раствор и наблюдайте за сигналами с помощью многофункциональной системы визуализации.
4. Иммунофлуоресцентная локализация белка Wolbachia
   1. Инкубировать 5 × 10⁵ Aa23 и Aa23-T-клеток при 28 °C на лазерной конфокальной чашке Петри толщиной 0,17 мм на дне, под 5% атмосферой CO₂ в течение 3 - 4 дней ^7,24. Подождите, пока клетка не сольется на 60%-70% и трижды промыть клетки PBS.
   2. Фиксируйте клетки в течение 20 мин при 4 °C в 1 мл 4% (мас./об.) параформальдегида в PBS.
   3. Промывайте фиксированные ячейки с помощью PBST (0,2% v/v Triton X-100 в PBS) в течение 5 минут и дважды промывайте ячейки PBS.
   4. Инкубировать слайды в течение 1 ч при 37 °C в 1 мл 3% (мас./об.) бычьего сывороточного альбумина в PBS.
   5. Инкубируйте слайды в течение ночи в 100 мкл мышиного анти-wsp поликлонального антитела (приготовленного собственными силами) и мышиной сыворотки (1:1000 разведения в PBS) во влажном ящике (он может поддерживать влажность и предотвращать испарение влаги) при 4 °C.
   6. Извлеките слайды из мокрого ящика и верните их к комнатной температуре; вымойте их три раза с PBS и удалите PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этапа 4.4.7 и далее, все операции должны быть защищены от света.
   7. Инкубируйте слайды со 100 мкл конъюгированного козьего антимышьего антитела Alexa Fluor 488 (разведение 1:2000 в PBS) при 37 °C в течение 30 мин.
   8. Инкубируют образцы слайдами с 50 мкл 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI разводят в PBS до 10 мкг/мл, прочно связываются с ДНК) при 37 °C в течение 5 мин, а затем промывают их три раза PBS.
   9. Наблюдайте за иммуноокрашиванием под конфокальным микроскопом.
      1. Включите питание и лазер.
      2. Включите обычную и ртутную лампы микроскопа.
      3. Запустите систему и запустите операционное программное обеспечение. Поместите каплю кедрового масла на слайды образца, поместите слайды образца на ступень микроскопа и переместите сцену в соответствующее положение.
      4. Нажмите кнопку наблюдения ртутной лампы в программном обеспечении, откройте затвор ртутной лампы и наблюдайте за образцом под перевернутым микроскопом для фокусировки.
      5. Используйте ручную панель управления для выбора зеленой и синей флуоресценции для получения флуоресцентных фотографий при 100-кратном увеличении.
      6. Выключите кнопку наблюдения ртутной лампы и начните получать изображения.
      7. Чтобы обеспечить хорошее качество изображения, выполните предварительное сканирование по размеру сканирования (512 пикселей x 512 пикселей). Отрегулируйте размер сканирования для получения четких изображений (1 024 x 1 024 пикселя).
      8. Выполните шумоподавление, если фоновый шум слишком высок.
      9. Остановите сканирование и сохраните изображения.
      10. Выключите ртутную лампу и лазеры.
      11. Протрите объектив 75% спиртом и опустите объектив в самое низкое положение.
      12. Выключите затвор и питание микроскопа.
      13. После того, как инструмент остынет, накройте его пылезащитным чехлом.

Результаты

До того, как Wolbachia была обнаружена, клетки Aa23 и Aa23-T наблюдались под световым микроскопом, чтобы определить любые морфологические различия между двумя клеточными линиями. Aa23 и Aa23-Т-клетки имеют, по крайней мере, две морфологии клеток, но нет очевидной морфологической разницы между дв...

Обсуждение

Обнаружение внутриклеточной инфекции Wolbachia имеет важное значение для изучения взаимодействий Wolbachia-host и подтверждения успешной трансфекции клеток с новыми штаммами. В этом протоколе были использованы четыре метода для успешного выявления внутриклеточной инфекции Wolbachia

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope	Zeiss		SteREO Discovery V8
Petri dish	Fisher Scietific	FB0875713
Pipette	Pipetman	F167380	P10
inSituX platform
Analysis software	In-house developed
Cerium doped yttrium aluminum garnet	MSE Supplies		Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates
Chip holder	In-house developed
Control software	In-house developed
Immersion oil	Cargille Laboratories	16482	Type A low viscosity 150 cSt
inSituX platform	In-house developed
IR light source	Thorlabs Incorporated	LED1085L	LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18
Outer ring	In-house developed
Pump lasers	Thorlabs Incorporated	LD785-SE400	785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode
Raspberry Pi	Raspberry Pi Fundation
Retaining ring	Thorlabs Incorporated	SM1RR	SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts
Seedless quartz crystal	University Wafers, Inc.	U01-W2-L-190514	25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X
Shim	In-house developed
X-ray beam stop	In-house developed