Rilevamento del ceppo Wolbachia wAlbB nelle linee cellulari Aedes albopictus

Riepilogo

Sono stati utilizzati quattro metodi per rilevare Wolbachia intracellulare, che si sono completati a vicenda e hanno migliorato l'accuratezza del rilevamento dell'infezione da Wolbachia di Aa23 derivato da Aedes albopictus e Aa23-T curato dall'infezione nativa di Wolbachia utilizzando antibiotici.

Abstract

Come endosimbionte materno, Wolbachia infetta grandi proporzioni di popolazioni di insetti. Gli studi hanno recentemente riportato il successo della regolazione della trasmissione del virus a RNA utilizzando zanzare trasfettate da Wolbachia. Le strategie chiave per controllare i virus includono la manipolazione della riproduzione dell'ospite attraverso l'incompatibilità citoplasmatica e l'inibizione dei trascritti virali attraverso l'innesco immunitario e la competizione per le risorse derivate dall'ospite. Tuttavia, i meccanismi alla base delle risposte delle zanzare trasfettate da Wolbachia all'infezione virale sono poco compresi. Questo documento presenta un protocollo per l'identificazione in vitro dell'infezione da Wolbachia a livello di acido nucleico e proteine nelle cellule Aa23 di Aedes albopictus (Ditteri: Culicidae) per migliorare la comprensione delle interazioni tra Wolbachia e i suoi insetti vettori. Attraverso l'uso combinato di reazione a catena della polimerasi (PCR), PCR quantitativa, western blot e metodi analitici immunologici, è stato descritto un protocollo morfologico standard per il rilevamento di cellule infette da Wolbachia che è più accurato dell'uso di un singolo metodo. Questo approccio può anche essere applicato alla rilevazione dell'infezione da Wolbachia in altri taxa di insetti.

Introduzione

La zanzara tigre asiatica Aedes albopictus (Skuse) (Ditteri: Culicidae), che è un vettore chiave del virus della dengue (DENV) in Asia e in altre parti del mondo¹, è un ospite naturale di due tipi di batteri intracellulari, Wolbachia (wAlbA e wAlbB), che sono distribuiti in tutta la linea germinale e nel tessuto somatico ^2,3. La linea cellulare Aa23 derivata da embrioni di A. albopictus è costituita da almeno due tipi di cellule morfologiche, entrambe supportano l'infezione⁴ e possono essere curate dall'infezione nativa di Wolbachia utilizzando antibiotici (Aa23-T). Dato che Aa23 conserva solo wAlbB, è un modello utile per lo studio delle interazioni ospite-endosimbionte ^4,5,6.

Wolbachia è trasmesso per via materna e infetta circa il 65% delle specie di insetti ^8,9 e ^il 28% delle specie di zanzare¹⁰. Infetta una varietà di tessuti e forma un'intima relazione simbiotica con l'ospite, di solito inducendo incompatibilità citoplasmatica (CI)¹¹ e sostituzione della popolazione manipolando il sistema riproduttivo dell'ospite^12,13. Queste risposte dell'ospite sono state osservate in popolazioni naturali di Drosophila simulans¹⁴ e in A. aegypti in una gabbia di laboratorio e in una prova sul campo¹⁵. Un'importante manipolazione non riproduttiva suscitata da Wolbachia è la resistenza indotta dell'ospite a una varietà di agenti patogeni, tra cui DENV, virus Chikungunya (CHIKV) e virus del Nilo occidentale (WNV)^16,17, che può essere mediata da un sistema immunitario innato migliorato del simbionte^18,19, competizione tra Wolbachia e virus per le risorse essenziali dell'ospite²⁰ e manipolazione delle vie di difesa virale dell'ospite²¹ .

Questo protocollo è stato sviluppato per studiare questi meccanismi alla base delle risposte antivirali dell'ospite indotte da Wolbachia. Utilizza quattro metodi di rilevamento dell'infezione intracellulare da Wolbachia delle cellule Aa23. Questi metodi forniscono una solida base teorica per gli studi sull'infezione intracellulare da Wolbachia di altre specie ospiti. Il primo metodo, la PCR, una potente tecnica che consente l'amplificazione enzimatica di specifiche regioni del DNA senza utilizzare procedure di clonazione convenzionali, è stato utilizzato per rilevare il DNA di Wolbachia e determinare la presenza / assenza di infezione da Wolbachia ²². Il secondo metodo misura la densità di copia del DNA di Wolbachia utilizzando la PCR quantitativa (qPCR) per il rilevamento e la misurazione affidabili dei prodotti generati durante ogni ciclo PCR che è direttamente proporzionale alla quantità di modello prima della PCR²³. Il terzo metodo rileva la presenza di proteine Wolbachia intracellulari , utilizzando western blot, uno degli strumenti più potenti per rilevare proteine specifiche in miscele complesse combinando l'elevato potere di separazione dell'elettroforesi, la specificità degli anticorpi e la sensibilità delle reazioni enzimatiche cromogeniche. Il metodo finale è un test di immunofluorescenza (IFA) che combina immunologia, biochimica e microscopia per rilevare la proteina di superficie wolbachia (wsp) attraverso una reazione antigene-anticorpo per confermare l'assorbimento cellulare di Wolbachia e determinarne la localizzazione cellulare.

Questo documento descrive i quattro metodi sopra elencati per verificare l'esistenza di Wolbachia nelle cellule, che possono essere utilizzati per rilevare se la Wolbachia esogena è stata trasfetta con successo e la Wolbachia nella cellula è stata eliminata. Dopo aver determinato se Wolbachia è presente nelle cellule o meno, è possibile eseguire una varietà di analisi diverse, tra cui genomica, proteomica o metabolomica. Questo protocollo dimostra il rilevamento di Wolbachia attraverso le cellule Aa23, ma può essere utilizzato anche in altre cellule.

Protocollo

1. Materiali e reagenti

1. Utilizzare soluzioni e mezzi privi di pirogeni per la coltura cellulare (vedere la Tabella dei materiali).
2. Utilizzare acqua ultrapura per preparare tutte le soluzioni.
3. Fare attenzione nella selezione del siero bovino fetale (FBS) per la coltura cellulare, seguendo un processo di controllo dei lotti.
   NOTA: poiché i lotti FBS sono soggetti a modifiche regolari, è impossibile indicare il catalogo e i numeri di lotto pertinenti in questo protocollo.
4. Selezionare ceppi cellulari Aa23 derivati da uova di A. albopictus , corrispondenti ad Aa23-T senza Wolbachia.

2. Coltura cellulare

1. Preparare palloni di coltura cellulare^{da 25 cm 2} con 4 mL di terreno di Schneider con il 10% di FBS.
2. Incubare i palloni a 28 °C in atmosfera al 5% di CO₂ per 5-7 giorni ^7,24.
3. Osservare le cellule Aa23 e Aa23-T non macchiate nei palloni utilizzando la microscopia ottica con ingrandimento 100x (Figura 1).

3. Estrazione del DNA

1. Coltivare le cellule per 5-7 giorni fino al 70-80% di confluenza per pallone (fase 2). Raccogliere le cellule con pipettaggio manuale da 1 mL di terreno di coltura risospeso mediante centrifugazione per 5 minuti a 100 × g in una microcentrifuga.
2. Rimuovere il surnatante per aspirazione e conservare il pellet cellulare risultante a -20 °C.
3. Risospesare il pellet in 0,40 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), posizionare 50 μL della soluzione in un tubo microcentrifuga, aggiungere 5 μL di proteinasi K (20 mg/mL) e incubare a 55 °C per 1 ora. Infine, riscaldare questi tubi a 99 °C per 15 minuti per ottenere il DNA grezzo e conservarlo a -20 °C.

4. Rilevazione dell'acido nucleico Wolbachia

1. Analisi PCR
   1. Eseguire la PCR in un volume di reazione totale di 20 μL, contenente 8 μL di ddH₂O, 10 μL di Taq polimerasi (vedere la tabella dei materiali), 1 μL di modello di DNA (dalla fase 3), 0,5 μL di primer avanti e indietro (10 μM): wsp81F (5' TGG TCC AAT AAG TGATGA AGAAAC 3') e wsp691R (5' AAA AAT TAA ACG CTA CTC CA 3')²⁵, rispettivamente.
   2. Utilizzare le seguenti condizioni di PCR: denaturazione iniziale a 95 °C per 5 min, seguita da 35 cicli di denaturazione a 94 °C, ricottura a 55 °C ed estensione a 72 °C; poi, un'estensione finale a 72 °C per 7 min.
   3. Rileva il DNA su un gel di agarosio all'1% (1% p/v di agarosio in PBS) utilizzando un imager gel.
2. Analisi qPCR
   1. Analizzare la copia del genoma di Wolbachia per tre repliche biologiche (n = 6) dal DNA estratto (fase 3) utilizzando i primer wsp 183 F (5' AAGGAACCGAAGTTCATG 3') e QBrev R (5' AGTTGAGAGTAAAGTCCC 3')²², normalizzati con primer ribosomiali S6 (RPS6) in avanti e inverso (5' GAAGTTGAACGTATCGTTTC 3' e 5' GAGATGGTCAGCGGTGATTT 3', rispettivamente)³.
   2. Generare una curva standard per wAlbB e RPS6.
      1. Estrarre il DNA dal plasmide ricombinante PMD-18T (un vettore speciale per la clonazione efficiente di prodotti PCR (clonazione TA)) contenente frammenti di geni wsp e rps6 (file supplementare) e misurare la concentrazione di DNA plasmidico (vedere la tabella dei materiali).
      2. Convertire la concentrazione di DNA plasmidico in concentrazione di numero di copie utilizzando Eq (1).
         Numero di copia del plasmide = (1)
      3. Diluire il numero di copie del plasmide da 10¹ a 10⁸ con acqua ultrapura e impostare 3 repliche per ogni gradiente di concentrazione.
      4. Eseguire l'amplificazione qPCR utilizzando TB Green e un sistema PCR in tempo reale (vedere la Tabella dei materiali) e registrare i risultati di ogni reazione. Utilizzate il valore Ct per sviluppare una curva standard. Analizzare il DNA in un volume di reazione totale di 20 μL, comprendente 7 μL di ddH₂O, 10,4 μL di TB Green (vedere la Tabella dei materiali), 1 μL di modello di DNA (fornito dalla fase 3) e 0,8 μL di primer avanti e indietro (10 μM). Utilizzare le seguenti condizioni di reazione: denaturazione iniziale a 95 °C per 5 min, seguita da 40 cicli di denaturazione a 95 °C per 10 s e ricottura a 60 °C per 35 s.
      5. Calcola i numeri di copia del gene WSP e RPS6 nelle cellule secondo la curva standard stabilita e la densità relativa di Wolbachia dal numero di copie di wsp / RPS6. Analizzare i dati utilizzando un t-test di campioni indipendenti.
3. Analisi Western blot della proteina Wolbachia
   1. Estrazione di proteine
      1. Raccogliere 2 × 10⁷ cellule Aa23 e Aa23-T dalla piastra a sei pozzetti (dal punto 2) in un tubo microcentrifuga, lavarle tre volte con PBS e centrifugarle a 100 × g per 5 minuti a 4 °C.
      2. Preparare 1 mL di lisati con tampone di lisi RIPA (50 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% desossicolato di sodio, 0,1% sodio dodecil solfato [SDS], 2 mM pirofosfato di sodio, 25 mM β-glicerofosfato, 1 mM EDTA, 1 mM Na₃VO₄, 0,5 μg/mL leupeptina) e PMSF (concentrazione finale 1 mM).
      3. Aggiungere 200 μL di tampone di lisi al pellet cellulare e mantenere per 30 minuti sul ghiaccio. Centrifugare i lisati a 12.000 × g per 10 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante.
   2. Analizzare la concentrazione di wsp del surnatante utilizzando un kit di analisi proteica dell'acido bicinchoninico (BCA) (vedere la tabella dei materiali) seguendo le istruzioni del produttore.
   3. Caricare quantità uguali di proteine su un gel SDS-PAGE al 15% [10% acqua distillata; 50% (30% Acr-Bis (29:1), 38% 1 M Tris, pH 8,8; 1% (10% SDS), 1% (10% persolfato di ammonio), 0,04% TEMED].
   4. Trasferire la proteina alle membrane nitrocellulose, bloccare le membrane con il 5% di latte scremato per 2 ore^26,27 a temperatura ambiente, quindi lavare le membrane tre volte con TBST (1 mL di Tween 20 in 1 L di TBS) (vedere la Tabella dei materiali).
   5. Incubare le membrane durante la notte a 4 °C con 100 μL di anticorpo policlonale anti-wsp (preparato internamente, vedere File supplementare)), preparato diluendo l'anticorpo primario con il 5% di latte scremato (1:12.000).
   6. Lavare l'anticorpo primario tre volte con TBST.
   7. Incubare le membrane in 100 μL di anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano (HRP) su uno shaker per 1 ora a temperatura ambiente.
   8. Lavare le membrane tre volte con TBST e miscelare 20 μL di soluzione A (HRP Substrate Luminol Reagent) e 20 μL di soluzione B (HRP Substrate Peroxide Reagent) nel kit di rilevamento della chemiluminescenza con un rapporto di 1:1. Immergere contemporaneamente l'intera membrana nella soluzione di luminescenza e osservare i segnali utilizzando un sistema di imaging multifunzionale.
4. Localizzazione in immunofluorescenza della proteina Wolbachia
   1. Incubare 5 × 10⁵ cellule Aa23 e Aa23-T a 28 °C su una capsula di Petri confocale laser con uno spessore di 0,17 mm nella parte inferiore, sotto un'atmosfera di CO_{2 al} 5% per 3-4 giorni ^7,24. Attendere che la cella abbia una confluenza del 60%-70% e lavare le cellule tre volte con PBS.
   2. Fissare le celle per 20 minuti a 4 °C in 1 mL di paraformaldeide al 4% (p/v) in PBS.
   3. Lavare le celle fisse utilizzando PBST (0,2% v/v Triton X-100 in PBS) per 5 minuti e lavare nuovamente le celle due volte con PBS.
   4. Incubare i vetrini per 1 ora a 37 °C in 1 mL di albumina sierica bovina al 3% (p/v) in PBS.
   5. Incubare i vetrini durante la notte in 100 μL di anticorpo policlonale anti-wsp di topo (preparato internamente) e siero di topo (diluizione 1:1.000 in PBS) in una scatola bagnata (può mantenere l'umidità e impedire l'evaporazione dell'umidità) a 4 °C.
   6. Rimuovere le diapositive dalla scatola bagnata e riportarle a temperatura ambiente; lavarli tre volte con PBS e rimuovere il PBS.
      NOTA: dal passaggio 4.4.7 in poi, tutte le operazioni devono essere protette dalla luce.
   7. Incubare i vetrini con 100 μL di un anticorpo anti-topo di capra coniugato Alexa Fluor 488 (diluizione 1:2.000 in PBS) a 37 °C per 30 min.
   8. Incubare i vetrini campione con 50 μL di 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI diluito in PBS a 10 μg/mL, si lega fortemente al DNA) a 37 °C per 5 minuti e poi lavarli tre volte con PBS.
   9. Osservare l'immunocolorazione al microscopio confocale.
      1. Accendi l'alimentazione e il laser.
      2. Accendere le normali lampade al mercurio del microscopio.
      3. Avviare il sistema ed eseguire il software operativo. Metti una goccia di olio di cedro sui vetrini del campione, posiziona i vetrini del campione sul palco del microscopio e sposta il palco nella posizione appropriata.
      4. Fare clic sul pulsante di osservazione della lampada al mercurio nel software, aprire l'otturatore della lampada al mercurio e osservare il campione al microscopio invertito per mettere a fuoco.
      5. Utilizzare il pannello di controllo manuale per selezionare la fluorescenza verde e blu per scattare foto a fluorescenza con ingrandimento 100x.
      6. Spegni il pulsante di osservazione della lampada al mercurio e inizia ad acquisire immagini.
      7. Per garantire una buona qualità dell'immagine, eseguire la scansione preliminare in base alle dimensioni della scansione (512 pixel x 512 pixel). Regolare le dimensioni della scansione per ottenere immagini chiare (1.024 pixel x 1.024 pixel).
      8. Eseguire la riduzione del rumore se il rumore di fondo è troppo alto.
      9. Interrompere la scansione e salvare le immagini.
      10. Spegnere la lampada al mercurio e i laser.
      11. Pulire l'obiettivo con il 75% di alcol e abbassare l'obiettivo alla posizione più bassa.
      12. Spegnere l'otturatore e l'alimentazione del microscopio.
      13. Dopo che lo strumento si è raffreddato, coprirlo con il coperchio antipolvere.

Risultati

Prima che Wolbachia fosse rilevata , le cellule Aa23 e Aa23-T sono state osservate al microscopio ottico per determinare eventuali differenze morfologiche tra le due linee cellulari. Le cellule Aa23 e Aa23-T hanno almeno due morfologie cellulari ma nessuna evidente differenza morfologica tra i due tipi di cellule (Figura 1). Qui, le cellule Aa23 sono state utilizzate come sistema modello per rilevare l'infezione da Wolbachia utilizzando quattro metodi. L'am...

Discussione

Il rilevamento dell'infezione intracellulare da Wolbachia è essenziale per lo studio delle interazioni Wolbachia-ospite e la conferma del successo della trasfezione di cellule con nuovi ceppi. In questo protocollo, sono stati utilizzati quattro metodi per rilevare con successo l'infezione intracellulare da Wolbachia a livello di acido nucleico e proteine. Questi quattro metodi sperimentali hanno corroborato e migliorato l'accuratezza del rilevamento dell'infezione delle cellule da Wolbachi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope	Zeiss		SteREO Discovery V8
Petri dish	Fisher Scietific	FB0875713
Pipette	Pipetman	F167380	P10
inSituX platform
Analysis software	In-house developed
Cerium doped yttrium aluminum garnet	MSE Supplies		Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates
Chip holder	In-house developed
Control software	In-house developed
Immersion oil	Cargille Laboratories	16482	Type A low viscosity 150 cSt
inSituX platform	In-house developed
IR light source	Thorlabs Incorporated	LED1085L	LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18
Outer ring	In-house developed
Pump lasers	Thorlabs Incorporated	LD785-SE400	785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode
Raspberry Pi	Raspberry Pi Fundation
Retaining ring	Thorlabs Incorporated	SM1RR	SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts
Seedless quartz crystal	University Wafers, Inc.	U01-W2-L-190514	25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X
Shim	In-house developed
X-ray beam stop	In-house developed