Nachweis des Wolbachia-Stammes wAlbB in Aedes albopictus-Zelllinien

Zusammenfassung

Vier Methoden wurden verwendet, um intrazelluläre Wolbachia nachzuweisen, die sich gegenseitig ergänzten und die Nachweisgenauigkeit der Wolbachia-Infektion von Aedes albopictus-abgeleiteten Aa23 und Aa23-T, die von nativer Wolbachia-Infektion mit Antibiotika geheilt wurden, verbesserten.

Zusammenfassung

Als mütterlich beherbergter Endosymbiont infiziert Wolbachia große Teile der Insektenpopulationen. Studien haben kürzlich über die erfolgreiche Regulation der RNA-Virusübertragung mit Wolbachia-transfizierten Moskitos berichtet. Zu den wichtigsten Strategien zur Kontrolle von Viren gehören die Manipulation der Wirtsreproduktion durch zytoplasmatische Inkompatibilität und die Hemmung viraler Transkripte durch Immun-Priming und Konkurrenz um vom Wirt abgeleitete Ressourcen. Die zugrunde liegenden Mechanismen der Reaktionen von Wolbachia-transfizierten Moskitos auf eine Virusinfektion sind jedoch kaum verstanden. Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die In-vitro-Identifizierung von Wolbachia-Infektionen auf Nukleinsäure- und Proteinebene in Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23-Zellen vor, um das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Wolbachia und seinen Insektenvektoren zu verbessern. Durch die kombinierte Verwendung von Polymerase-Kettenreaktion (PCR), quantitativer PCR, Western Blot und immunologischen Analysemethoden wurde ein morphologisches Standardprotokoll für den Nachweis von Wolbachia-infizierten Zellen beschrieben, das genauer ist als die Verwendung einer einzigen Methode. Dieser Ansatz kann auch auf den Nachweis einer Wolbachia-Infektion in anderen Insektentaxa angewendet werden.

Einleitung

Die Asiatische Tigermücke Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae), die in Asien und anderen Teilen der Welt ein Schlüsselvektor des Dengue-Virus (DENV) ist¹, ein natürlicher Wirt von zwei Arten der intrazellulären Bakterien, Wolbachia (w AlbA und wAlbB), die über die Keimbahn und das somatische Gewebe verteilt sind ^2,3. Die Aa23-Zelllinie, die aus A. albopictus-Embryonen gewonnen wird, besteht aus mindestens zwei morphologischen Zelltypen, die beide die Infektion⁴ unterstützen und mit Antibiotika (Aa23-T) von einer nativen Wolbachia-Infektion geheilt werden können. Da Aa23 nur wAlbB behält, ist es ein nützliches Modell für die Untersuchung von Wirt-Endosymbionten-Interaktionen ^4,5,6.

Wolbachia wird mütterlich übertragen und infiziert schätzungsweise 65% der Insektenarten ^8,9 und 28% der Mückenarten^10. Es infiziert eine Vielzahl von Geweben und bildet eine intime symbiotische Beziehung mit dem Wirt, die normalerweise zytoplasmatische Inkompatibilität (CI)¹¹ und Populationsersatz durch Manipulation des Wirtsfortpflanzungssystems^12,13 induziert. Diese Wirtsreaktionen wurden in natürlichen Populationen von Drosophila simulans¹⁴ und in A. aegypti in einem Laborkäfig und Feldversuch¹⁵ beobachtet. Eine wichtige nichtreproduktive Manipulation, die durch Wolbachia ausgelöst wird, ist die induzierte Wirtsresistenz gegen eine Vielzahl von Krankheitserregern, einschließlich DENV, Chikungunya-Virus (CHIKV) und West-Nil-Virus (WNV) 16,17, die durch ein verbessertes angeborenes Immunsystem des Symbionten^{vermittelt werden können 18,19,} die Konkurrenz zwischen Wolbachia und Viren um essentielle Wirtsressourcen 20 und die Manipulation von viralen Abwehrwegen des Wirts ²¹ .

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um diese zugrunde liegenden Mechanismen der antiviralen Reaktionen des Wolbachia-induzierten Wirts zu untersuchen. Es verwendet vier Methoden zum Nachweis der intrazellulären Wolbachia-Infektion von Aa23-Zellen. Diese Methoden bieten eine starke theoretische Grundlage für Studien zur intrazellulären Wolbachia-Infektion anderer Wirtsarten. Die erste Methode, die PCR - eine leistungsstarke Technik, die die enzymatische Amplifikation bestimmter DNA-Regionen ohne Verwendung herkömmlicher Klonierungsverfahren ermöglicht - wurde verwendet, um Wolbachia-DNA nachzuweisen und das Vorhandensein / Fehlen einer Wolbachia-Infektion ^{zu bestimmen 22}. Die zweite Methode misst die Wolbachia-DNA-Kopierdichte mittels quantitativer PCR (qPCR) für den zuverlässigen Nachweis und die Messung von Produkten, die während jedes PCR-Zyklus erzeugt werden, der direkt proportional zur Menge der Vorlage vor PCR²³ ist. Die dritte Methode erkennt das Vorhandensein von intrazellulären Wolbachia-Proteinen unter Verwendung von Western Blot - einem der leistungsfähigsten Werkzeuge zum Nachweis spezifischer Proteine in komplexen Gemischen, indem es die hohe Trennleistung der Elektrophorese, die Spezifität von Antikörpern und die Empfindlichkeit chromogener enzymatischer Reaktionen kombiniert. Die letzte Methode ist ein Immunfluoreszenz-Assay (IFA), der Immunologie, Biochemie und Mikroskopie kombiniert, um das Wolbachia-Oberflächenprotein (wsp) durch eine Antigen-Antikörper-Reaktion nachzuweisen, um die zelluläre Aufnahme von Wolbachia zu bestätigen und seine zelluläre Lokalisation zu bestimmen.

Dieses Papier beschreibt die vier oben aufgeführten Methoden, um die Existenz von Wolbachia in den Zellen zu überprüfen, mit denen nachgewiesen werden kann, ob die exogene Wolbachia erfolgreich transfiziert und die Wolbachia in der Zelle beseitigt wurde. Nachdem festgestellt wurde, ob Wolbachia in den Zellen vorhanden ist oder nicht, können verschiedene Analysen durchgeführt werden, einschließlich Genomik, Proteomik oder Metabolomik. Dieses Protokoll demonstriert den Nachweis von Wolbachia durch Aa23-Zellen, kann aber auch in anderen Zellen verwendet werden.

Protokoll

1. Materialien und Reagenzien

1. Verwenden Sie pyrogenfreie Lösungen und Medien für die Zellkultur (siehe Materialtabelle).
2. Verwenden Sie Reinstwasser, um alle Lösungen vorzubereiten.
3. Seien Sie vorsichtig bei der Auswahl von fetalem Rinderserum (FBS) für die Zellkultur nach einem Lot-Check-Prozess.
   HINWEIS: Da FBS-Chargen regelmäßigen Änderungen unterliegen, ist es unmöglich, den entsprechenden Katalog und die Chargennummern in diesem Protokoll anzugeben.
4. Wählen Sie Aa23-Zellstämme, die aus A. albopictus-Eiern stammen und dem Wolbachia-freien Aa23-T entsprechen.

2. Zellkultur

1. Bereiten Sie 25 cm² Zellkulturflaschen mit 4 ml Schneider's Medium mit 10% FBS vor.
2. Die Kolben werden bei 28 °C unter einer CO₂ -% Atmosphäre für 5 bis 7 Tage ^7,24 inkubiert.
3. Beobachten Sie ungefärbte Aa23- und Aa23-T-Zellen in den Kolben mittels Lichtmikroskopie bei 100-facher Vergrößerung (Abbildung 1).

3. DNA-Extraktion

1. Kultivieren Sie die Zellen für 5-7 Tage bis zu 70-80% Konfluenz pro Kolben (Schritt 2). Ernten Sie die Zellen mit manueller Pipettierung aus 1 ml resuspendiertem Kulturmedium durch Zentrifugation für 5 min bei 100 × g in einer Mikrozentrifuge.
2. Entfernen Sie den Überstand durch Absaugung und lagern Sie das resultierende Zellpellet bei -20 °C.
3. Die Pellets werden in 0,40 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) resuspendiert, 50 μL der Lösung in ein Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, 5 μL Proteinase K (20 mg/ml) zugegeben und bei 55 °C für 1 h inkubiert. Schließlich erhitzen Sie diese Röhren bei 99 ° C für 15 Minuten, um die rohe DNA zu erhalten und bei -20 ° C zu lagern.

4. Nachweis von Wolbachia-Nukleinsäure

1. PCR-Analyse
   1. Durchführung einer PCR in einem Gesamtreaktionsvolumen von 20 μL, bestehend aus 8 μL ddH₂O, 10 μL Taq-Polymerase (siehe Materialtabelle), 1 μL DNA-Vorlage (aus Schritt 3), 0,5 μL Vorwärts- und Rückwärtsprimern (10 μM): wsp81 F (5' TGG TCC AAT AAG TGATGA AGAAAC 3') und wsp691R (5' AAA AAT TAA ACG CTA CTC CA 3')²⁵, beziehungsweise.
   2. Verwenden Sie die folgenden PCR-Bedingungen: anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 5 min, gefolgt von 35 Denaturierungszyklen bei 94 °C, Glühen bei 55 °C und Verlängerung bei 72 °C; dann eine letzte Verlängerung bei 72 °C für 7 min.
   3. Nachweis der DNA auf einem 1% Agarosegel (1% w/v Agarose in PBS) mit einem Gel-Imager.
2. qPCR-Analyse
   1. Analysieren Sie die Wolbachia-Genomkopie auf drei biologische Replikate (n = 6) aus der extrahierten DNA (Schritt 3) mit den wsp-Primern 183 F (5' AAGGAACCGAAGTTCATG 3') und QBrev R (5' AGTTGAGAGTAAAGTCCC 3')²², normalisiert mit ribosomalen S6 (RPS6) Vorwärts- und Rückwärtsprimern (5' GAAGTTGAACGTATCGTC 3' bzw. 5' GAGATGGTCAGCGGTGTT 3')³.
   2. Generieren Sie eine Standardkurve für wAlbB und RPS6.
      1. Extrahieren Sie DNA aus PMD-18T (ein spezieller Vektor für die effiziente Klonierung von PCR-Produkten (TA-Klonierung)) Rekombinantes Plasmid mit WSP - und RPS6-Genfragmenten (Supplemental File) und messen Sie die DNA-Konzentration des Plasmids (siehe Materialtabelle).
      2. Wandeln Sie die DNA-Konzentration des Plasmids mit Eq (1) in die Kopienzahlkonzentration um.
         Plasmid-Kopiennummer = (1)
      3. Verdünnen Sie die Plasmidkopienzahl von 10¹ auf 10⁸ mit Reinstwasser und legen Sie 3 Replikate für jeden Konzentrationsgradienten fest.
      4. Führen Sie eine qPCR-Verstärkung mit TB Green und einem real-time PCR-System durch (siehe Materialtabelle) und zeichnen Sie die Ergebnisse jeder Reaktion auf. Verwenden Sie den Wert Ct, um eine Standardkurve zu entwickeln. Analysieren Sie die DNA in einem Gesamtreaktionsvolumen von 20 μL, umfassend 7 μL ddH₂O, 10,4 μL TB Green (siehe Materialtabelle), 1 μL DNA-Vorlage (bereitgestellt durch Schritt 3) und 0,8 μL Vorwärts- und Rückwärtsprimer (10 μM). Verwenden Sie die folgenden Reaktionsbedingungen: anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 5 min, gefolgt von 40 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 10 s und Glühen bei 60 °C für 35 s.
      5. Berechnen Sie die WSP- und RPS6-Genkopienzahlen in den Zellen gemäß der etablierten Standardkurve und die Wolbachia-relative Dichte anhand der Kopierzahl von wsp/RPS6. Analysieren Sie die Daten mit einem unabhängigen Stichproben-t-Test.
3. Western-Blot-Analyse des Wolbachia-Proteins
   1. Proteinextraktion
      1. Sammeln Sie 2 × 10⁷ Aa23- und Aa23-T-Zellen von der Sechs-Well-Platte (aus Schritt 2) in einem Mikrozentrifugenröhrchen, waschen Sie sie dreimal mit PBS und zentrifugieren Sie sie bei 100 × g für 5 min bei 4 °C.
      2. Es werden 1 ml Lysate mit RIPA-Lysepuffer (50 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1 % Triton X-100, 1 % Natriumdesoxycholat, 0,1 % Natriumdodecylsulfat [SDS], 2 mM Natriumpyrophosphat, 25 mM β-Glycerophosphat, 1 mM EDTA, 1 mM Na₃VO₄, 0,5 μg/ml Leupeptin) und PMSF (Endkonzentration 1 mM) hergestellt.
      3. Geben Sie 200 μL Lysepuffer in das Zellpellet und halten Sie es 30 Minuten auf Eis. Die Lysate bei 12.000 × g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand entfernen.
   2. Ermitteln Sie die WSP-Konzentration des Überstands mit einem Bicinchoninsäure (BCA)-Protein-Assay-Kit (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   3. Laden Sie gleiche Mengen Protein auf ein 15% SDS-PAGE Gel [10% destilliertes Wasser; 50% (30% Acr-Bis (29:1), 38% 1 M Tris, pH 8,8; 1% (10% SDS), 1% (10% Ammoniumpersulfat), 0,04% TEMED].
   4. Übertragen Sie das Protein auf Nitrocellulosemembranen, blockieren Sie die Membranen mit 5% Magermilch für 2 h ^26,27 bei Raumtemperatur und waschen Sie die Membranen dann dreimal mit TBST (1 ml Tween²⁰ in 1 L TBS) (siehe Materialtabelle).
   5. Inkubieren Sie die Membranen über Nacht bei 4 °C mit 100 μL polyklonalem Anti-WSP-Antikörper (intern hergestellt, siehe Ergänzungsdatei)), hergestellt durch Verdünnung des primären Antikörpers mit 5% Magermilch (1:12.000).
   6. Waschen Sie den primären Antikörper dreimal mit TBST.
   7. Die Membranen in 100 μL Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierten Sekundärantikörper auf einem Shaker für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
   8. Waschen Sie die Membranen dreimal mit TBST und mischen Sie 20 μL Lösung A (HRP-Substratluminol-Reagenz) und 20 μL Lösung B (HRP-Substratperoxid-Reagenz) im Chemilumineszenz-Detektionskit im Verhältnis 1:1. Tauchen Sie die gesamte Membran gleichzeitig in die Lumineszenzlösung ein und beobachten Sie die Signale mit einem multifunktionalen Bildgebungssystem.
4. Immunfluoreszenzlokalisation des Wolbachia-Proteins
   1. Inkubieren Sie 5 × 10 5_Aa23- und Aa23-T-Zellen bei 28 °C auf einer konfokalen Laser-Petrischale mit einer Dicke von 0,17 mm am Boden unter einer CO 2-Atmosphäre von⁵% für 3 bis 4 Tage ^7,24. Warten Sie, bis die Zelle zu 60% -70% zusammenfließt, und waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS.
   2. Fixieren Sie die Zellen für 20 min bei 4 ° C in 1 ml 4% (w / v) Paraformaldehyd in PBS.
   3. Waschen Sie die festen Zellen mit PBST (0,2% v/v Triton X-100 in PBS) für 5 min und waschen Sie die Zellen erneut zweimal mit PBS.
   4. Die Objektträger für 1 h bei 37 °C in 1 ml 3% (w/v) Rinderserumalbumin in PBS inkubieren.
   5. Inkubieren Sie die Objektträger über Nacht in 100 μL Maus-Anti-WSP-Polyklonal-Antikörper (intern hergestellt) und Mausserum (1:1.000 Verdünnung in PBS) in einer Nassbox (es kann Feuchtigkeit aufrechterhalten und verhindern, dass Feuchtigkeit verdunstet) bei 4 ° C.
   6. Entfernen Sie die Dias aus der nassen Box und bringen Sie sie auf Raumtemperatur zurück; Waschen Sie sie dreimal mit PBS und entfernen Sie die PBS.
      HINWEIS: Ab Schritt 4.4.7 müssen alle Vorgänge vor Licht geschützt werden.
   7. Bebrüten Sie die Objektträger mit 100 μL eines Alexa Fluor 488-konjugierten Ziegen-Anti-Maus-Antikörpers (1:2.000 Verdünnung in PBS) bei 37 °C für 30 min.
   8. Inkubieren Sie die Probenobjektträger mit 50 μL 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI verdünnt in PBS auf 10 μg/ml, bindet stark an DNA) bei 37 °C für 5 min und waschen Sie sie dann dreimal mit PBS.
   9. Beobachten Sie die Immunfärbung unter einem konfokalen Mikroskop.
      1. Schalten Sie die Stromversorgung und den Laser ein.
      2. Schalten Sie die normalen und Quecksilberlampen des Mikroskops ein.
      3. Starten Sie das System und führen Sie die Betriebssoftware aus. Legen Sie einen Tropfen Zedernöl auf die Objektträger, legen Sie die Objektträger auf den Mikroskoptisch und bewegen Sie den Tisch an die entsprechende Position.
      4. Klicken Sie auf die Beobachtungsschaltfläche der Quecksilberlampe in der Software, öffnen Sie den Auslöser der Quecksilberlampe und beobachten Sie die Probe unter einem umgekehrten Mikroskop, um zu fokussieren.
      5. Verwenden Sie das manuelle Bedienfeld , um grüne und blaue Fluoreszenz auszuwählen, um Fluoreszenzfotos unter 100-facher Vergrößerung aufzunehmen.
      6. Schalten Sie die Beobachtungstaste für die Quecksilberlampe aus und beginnen Sie mit der Aufnahme von Bildern.
      7. Um eine gute Bildqualität zu gewährleisten, scannen Sie nach Scangröße (512 Pixel x 512 Pixel). Passen Sie die Scangröße an, um klare Bilder zu erhalten (1.024 Pixel x 1.024 Pixel).
      8. Führen Sie eine Rauschunterdrückung durch, wenn die Hintergrundgeräusche zu hoch sind.
      9. Stoppen Sie das Scannen und speichern Sie die Bilder.
      10. Schalten Sie die Quecksilberlampe und die Laser aus.
      11. Wischen Sie das Ziel mit 75% Alkohol ab und senken Sie das Ziel auf die niedrigste Position.
      12. Schalten Sie den Verschluss und das Mikroskop aus.
      13. Nachdem das Instrument abgekühlt ist, bedecken Sie es mit der Staubschutzabdeckung.

Ergebnisse

Bevor Wolbachia nachgewiesen wurde, wurden Aa23- und Aa23-T-Zellen unter einem Lichtmikroskop beobachtet, um morphologische Unterschiede zwischen den beiden Zelllinien zu bestimmen. Aa23- und Aa23-T-Zellen haben mindestens zwei Zellmorphologien, aber keinen offensichtlichen morphologischen Unterschied zwischen den beiden Zelltypen (Abbildung 1). Hier wurden Aa23-Zellen als Modellsystem verwendet, um eine Wolbachia-Infektion mit vier Methoden zu erkennen. Ei...

Diskussion

Der Nachweis einer intrazellulären Wolbachia-Infektion ist essentiell für die Untersuchung von Wolbachia-Wirt-Interaktionen und die Bestätigung einer erfolgreichen Transfektion von Zellen mit neuartigen Stämmen. In diesem Protokoll wurden vier Methoden verwendet, um eine intrazelluläre Wolbachia-Infektion auf Nukleinsäure- und Proteinebene erfolgreich nachzuweisen. Diese vier experimentellen Methoden bestätigten und verbesserten die Nachweisgenauigkeit der Wolbachia-Infektion vo...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope	Zeiss		SteREO Discovery V8
Petri dish	Fisher Scietific	FB0875713
Pipette	Pipetman	F167380	P10
inSituX platform
Analysis software	In-house developed
Cerium doped yttrium aluminum garnet	MSE Supplies		Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates
Chip holder	In-house developed
Control software	In-house developed
Immersion oil	Cargille Laboratories	16482	Type A low viscosity 150 cSt
inSituX platform	In-house developed
IR light source	Thorlabs Incorporated	LED1085L	LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18
Outer ring	In-house developed
Pump lasers	Thorlabs Incorporated	LD785-SE400	785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode
Raspberry Pi	Raspberry Pi Fundation
Retaining ring	Thorlabs Incorporated	SM1RR	SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts
Seedless quartz crystal	University Wafers, Inc.	U01-W2-L-190514	25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X
Shim	In-house developed
X-ray beam stop	In-house developed