原位 冷冻切片斑马鱼胚胎中的杂交结合免疫组织化学

摘要

该协议描述了如何通过结合斑马鱼胚胎切片的 原位 杂交和免疫组织化学来获取图像。在冷冻切片之前进行 原位 杂交，然后进行抗体染色。如果抗体缺乏，检测斑马鱼中两个基因的表达模式是有用的。

摘要

作为一种脊椎动物，斑马鱼已被广泛用于生物学研究。斑马鱼和人类具有很高的遗传同源性，这使其可以用作人类疾病的模型。基因功能研究基于基因表达模式的检测。尽管免疫组织化学提供了一种测定蛋白表达的有效方法，但斑马鱼中市售抗体的数量有限，限制了成本分配的应用。 原位 杂交广泛用于斑马鱼胚胎中以检测mRNA表达。该协议描述了如何通过结合斑马鱼胚胎切片的 原位 杂交和免疫组织化学来获取图像。在冷冻切片之前进行 原位 杂交，然后进行抗体染色。原 位 杂交后进行免疫组织化学和单次冷冻切片成像。该方案有助于揭示两个基因的表达模式，首先通过 原位 转录本检测，然后通过针对同一部分中蛋白质的免疫组织化学。

引言

斑马鱼是用于发育和遗传学研究的强大脊椎动物模型^1,2。斑马鱼和人类具有很高的遗传同源性（70%的基因与人类基因组共享），这使其可以用作人类疾病的模型³。在斑马鱼中，检测两个基因的表达模式及其空间关系是很常见的。免疫组织化学于 1941 年首次用于通过应用 FITC 标记的抗体来检测感染组织中的病原体⁴.组织切片中的靶蛋白首先用一抗标记，然后用针对一抗宿主物种免疫球蛋白的二抗标记切片。抗体染色是检测蛋白质定位的可靠方法，可在细胞内水平上提供高光学分辨率。然而，斑马鱼中可用的抗体数量非常有限。最近的一项研究表明，大约有112,000种抗体可供小鼠使用;然而，很少有抗体被证明在斑马鱼⁵中是可靠的。

相反，在斑马鱼中，原位杂交已被广泛用于基因表达模式分析。该方法在1980^年代6,7首次用于评估果蝇胚胎中的基因表达，从那时起，该技术得到了不断发展和改进。最初，放射性标记的DNA探针用于检测mRNA转录本;然而，空间分辨率相对较低，并且存在放射性引起的潜在健康风险。随后，原位杂交依赖于用地高辛（DIG）或荧光素（Fluo）标记的RNA探针，这些探针与碱性磷酸酶（AP）偶联或通过荧光酪胺信号放大（TSA^）检测8,9。尽管TSA已被用于检测两个或三个基因，但RNA探针的DIG标记和抗DIG AP偶联抗体仍然是高度敏感，稳定且广泛使用的原位杂交方法。因此，商业化抗体与DIG标记的原位探针相结合，有助于深入了解一个基因的蛋白质定位和表达。

由于光学分辨率低，整个胚胎无法揭示基因之间的空间关系，即使斑马鱼胚胎小而透明¹⁰。因此，切片对于在细胞内水平上分析基因的表达模式是必要的。冷冻切片已广泛用于斑马鱼，因为它易于操作并且可以有效地保存抗原。因此，斑马鱼冷冻切片中的 原位 杂交结合免疫组织化学为分析两个基因的表达模式提供了一种强有力的方法。 原位 杂交和免疫组织化学的组合已应用于斑马鱼¹¹。然而，蛋白酶K处理用于以牺牲抗原完整性为代价来增强探针穿透。为了克服这一限制，该方案使用加热来诱导抗原修复。该方案不仅适用于不同阶段的胚胎和不同厚度的组织切片（14μm头部切片和20μm脊髓切片），而且还通过使用在两个器官中表达的基因进行了验证，包括头部和脊髓。

本文将介绍如何在冷冻切片中结合斑马鱼胚胎的 原位 杂交和抗体染色。通过使用许多 原位 杂交 - 免疫组织化学组合，包括针对两个不同神经元的 原位 杂交探针，证明了该协议的多功能性。该方法适用于检测不同区域和不同年龄胚胎的mRNA和蛋白质，以及两个基因的表达模式。

研究方案

所有动物方案均由南通大学机构动物护理和使用委员会批准（编号S20191210-402）。

1. 斑马鱼胚胎的采集

1. 在收集卵的前一天晚上在繁殖池中设置一对斑马鱼，一条是转基因斑马鱼，另一条是AB野生型斑马鱼（Tg （foxP2:egfp-caax） X AB野生型或 Tg （hb9:egfp） X AB野生型）（见 材料表）。使用对角线塑料隔板将公头和母头分开，以防止物理接触。第二天，将养殖箱的上部装入装满淡水的干净下部，并拆下养殖箱的隔板。让鱼交配10-20分钟，并在它们沉入繁殖池底部后收集卵。
2. 在含有亚甲蓝（1mL的0.05%亚甲蓝在1L E3胚胎培养基中）的E3胚胎培养基（参见 材料表）中培养胚胎，温度为28.5°C。
3. 在受精后24小时（hpf）用苯硫脲（PTU，见 材料表）处理胚胎以防止色素形成。
   注意:实验中使用任何性别的动物。

2. 原位 杂交

注意:步骤2.1-2.11中使用的水是焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的水（见 材料表）。

1. 用0.5-1mL新鲜的4%多聚甲醛（PFA，参见 材料表）在4°C的1.5mL微量离心管中固定~10个胚胎过夜12-14小时。
   注意: 原位 杂交方案从先前发表的文献¹²略有修改。PFA必须在使用后一周内新鲜制备并在4°C下储存或在-20°C下储存一个月。 原 位 杂交中的所有后续步骤均使用 1.5 mL 微量离心管进行。
2. 使用镊子去除仅年龄超过 48 hpf 的胚胎的皮肤。
   注意:去除皮肤以促进RNA探针渗透到年龄超过48 hpf的胚胎的躯干区域。
3. 通过在含有0.1%吐温-20的1x磷酸盐缓冲盐水中分别用25%，50%和75%甲醇洗涤胚胎（PBST，参见 材料表）逐渐脱水5分钟在室温下。然后，在室温下用100%甲醇洗涤胚胎5分钟。将胚胎在-20°C的100%甲醇中孵育至少过夜12-14小时。
   注意:脱水胚胎可以在-20°C的100%甲醇中储存6个月。
4. 通过在室温下依次用75%，50%和25%甲醇在PBST中洗涤5分钟来逐渐使胚胎再水化。在室温下用PBST洗涤胚胎三次，每次5分钟。
5. 在室温下用PBST中的10μg/ mL蛋白酶K（参见 材料表）消化胚胎（见 表1）。
6. 用PBST洗涤胚胎5分钟。执行此洗涤步骤三次。
7. 在室温下将洗涤的胚胎在4%PFA中重新固定15分钟。
   注意:此步骤停止消化，因为PFA使蛋白酶K失活。 确保样品轻轻混合以将所有胚胎暴露于PFA;试管可以放置在它们的侧面，以将胚胎均匀分布在溶液中。这种PFA不必是新鲜的（可以冷藏长达2周）。
8. 用PBST洗涤胚胎三次，每次洗涤时孵育5分钟。
9. 通过在65°C下与预杂交溶液（preHYB，参见 材料表）孵育5分钟来进行胚胎的预杂交。用杂交溶液（HYB，参见 材料表）代替preHYB，并在HYB中预杂交至少4小时。
   注意:在进行预杂交之前，将溶液预热至65°C。 甲酰胺（见 材料表）用于维持组织的形状和结构。甲酰胺还可以防止非同源片段在低温下结合。
10. 在加入胚胎之前，在HYB中加热探针（Insm1a或5-HT2C）在95°C下5分钟。使用浓度为 1 μg/mL HYB 的探头。在不让胚胎与空气接触的情况下尽可能多地去除预HYB，并将HYB中的预热探针添加到装有胚胎的管中。
    注意:标记的RNA探针可用于与胚胎中的靶mRNA序列杂交。因此，该探针可用于检测目的基因的表达和mRNA的位置。
11. 让探针在50-70°C下杂交过夜（12-14小时）。
    注意:不同探头的杂交温度不同。
12. 第二天，用移液管吸出探针溶液并将其储存在-20°C的管中，以便可以多次重复使用。
13. 按如下方式清洗胚胎:
    1. 在65°C下用100%HYB洗涤胚胎15分钟。
    2. 在含有0.1%吐温-20（SSCT，参见 材料表）的2x标准盐水柠檬酸盐中依次用75%，50%和25%HYB洗涤胚胎15分钟。
    3. 在65°C下在2x SSCT中洗涤胚胎15分钟。
    4. 在65°C下在0.2x SSCT中洗涤胚胎15分钟。
14. 在室温下在含有0.02%吐温-20（MABT，参见 材料表）的马来酸缓冲液中洗涤胚胎两次10分钟。
15. 在室温下用2%封闭溶液-1封闭杂交和洗涤的胚胎至少2小时（参见 材料表）。
16. 用抗地高辛AP（1:4,000稀释度，参见 材料表）在新鲜的2%封闭溶液-1中替换封闭溶液-1，并在4°C下摇匀12-14小时。
17. 在室温下在MABT中洗涤胚胎四次30分钟。
    注意:在第三次洗涤期间从冰箱中取出BM紫色（请参阅 材料表），并在随后的洗涤中偶尔摇晃。
18. 在NTMT（0.1M Tris-HCl，0.1M NaCl，1%吐温-20，参见 材料表）中洗涤胚胎两次10分钟。
19. 使用移液器从胚胎中取出尽可能多的NTMT。用BM紫色AP底物替换，并在室温下在黑暗中染色胚胎。每30分钟监测一次颜色变化，以控制染色程度。
    注意:具体染色时间不同，需要根据每个探头进行调整。在37°C孵育胚胎可以加速反应。在4°C孵育胚胎可以增加反应时间，并且可以在一夜之间完成。
20. 一旦发展到所需程度，用NTMT短暂冲洗两次来停止反应。 原位 杂交后，用PBST冲洗胚胎三次20分钟。

3. 嵌入

1. 将胚胎浸入1x PBS（参见 材料表）中的5%蔗糖中，在4°C下过夜12-14小时。
2. 将覆盖胚胎的溶液在1x PBS中更换为15%蔗糖，并在4°C孵育过夜12-16小时。
3. 将覆盖胚胎的溶液在1x PBS中更换为30%蔗糖，并在4°C下孵育1-2天。
   注意:在该溶液中孵育，直到胚胎沉入管底部。
4. 用最佳切割温度 （OCT） 介质填充冷冻机（参见 材料表）。用OCT培养基将30%蔗糖中的胚胎转移到冷冻体中。搅拌它们以从胚胎中去除蔗糖。
5. 将胚胎转移到新的冷冻体中用于组织，并用OCT培养基轻轻填充，避免形成气泡。
6. 浸没每个胚胎，将其推到冷冻模具的底部，并将每个胚胎放置在所需的方向（背腹或侧）。将胚胎保持在一条直线上。
   注意:强烈建议在每个冷冻体中仅放置一个胚胎（见 材料表）。
7. 将嵌入的胚胎放入干冰乙醇浴中的冷冻模具中。
8. 在-80°C下储存至少过夜12-14小时。
   注意:低温模具可以在-80°C下保存至少一个月。

4. 冷冻切片

1. 使用低温恒温器将冷冻切片设置为-20°C。
2. 从低温管中取出试样块并将其放入低温恒温器中。将OCT培养基放在冷冻卡盘的底部，并将块放在顶部。
3. 确保试样块与剃须刀片平行。小心地修剪掉标本周围多余的OCT培养基。
4. 使用低温恒温器切成 12-20 μm 厚的部分。快速将切片转移到载玻片上，使每张载玻片有 3-4 个切片。让样品达到室温，并将切片储存在-80°C的密封载玻片盒中以备后用。

5. 免疫染色

注意:对切片进行GFP染色。

1. 用PBS清洗包含切片的载玻片5分钟。
2. 将柠檬酸盐缓冲液加热至在微波炉中沸腾。
3. 将载玻片放入缓冲液中并继续加热以使溶液接近沸腾约20分钟。
   注意:此步骤有助于抗原修复。即使在高温下，组织也能保持完整，通过防止组织折叠、损坏或脱落来提高染色质量。
4. 在下一步之前，让样品慢慢冷却至室温。沥干多余的溶液，用纸巾小心地擦干每个部分周围的区域，并用防水笔（见 材料表）在该部分周围画一个圆圈，以形成疏水屏障。注意不要干燥组织切片。
5. 用PBS洗涤载玻片两次，每次洗涤时孵育10分钟。
6. 在室温下在封闭溶液-2（参见 材料表）中封闭2小时。
7. 每张载玻片移取一抗溶液（小鼠单克隆α-GFP，1:250，参见 材料表），并将载玻片在4°C的免疫组织化学湿盒中孵育过夜。
8. 用PBS洗涤载玻片三次，每次洗涤时孵育10分钟。
9. 排出多余的 PBS。将载玻片与适当的二抗（1:400，参见 材料表）在室温下在PBS中孵育1小时。
10. 用PBS洗涤载玻片三次，每次洗涤时孵育10分钟。
11. 排出多余的PBS，将安装介质移液到载玻片上，然后用载玻片盖玻片安装。

结果

该协议可用于同时检查一种mRNA和一种蛋白质的表达模式。图 1 显示了实验性工作流程。5-HT2C受体是由神经递质血清素（5-羟色胺，5-HT）结合的5-HT受体的亚型。它广泛分布在中枢神经系统（CNS）中，可以显着调节多种大脑功能，包括食欲，情绪，焦虑和生殖行为¹³。5-HT2C在CNS中的表达由转基因系Tg（foxp2:egfp-caax）检测，其中foxP2神经元由荧光素?...

讨论

该协议提出了原位杂交和免疫组织化学的组合，这是斑马鱼胚胎共定位实验的重要一步。该方法是同时分析一种mRNA和一种蛋白质的简单有效的方法。对斑马鱼胚胎进行原位杂交和抗体染色。与之前发表的几种方案14,15,16相比^，免疫荧光和免疫组织化学用于探索蛋白质表达。很少有斑马鱼特异性抗体经过适当验证，...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 secondary antibody	Invitrogen	A21202
Anti-Digoxigenin AP Fab fragments	Roche	11093274910
Anti-GFP antibody	Millipore	MAB3580
Blocking reagent	Roche	11096176001
Blocking solution-1	made in lab	N/A	Dissolve the blocking reagent in 1X MAB to a final concentration of 10% (wt/vol). Autoclave and store at -20 °C before use.
Blocking solution-2	made in lab	N/A	0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS
BM purple	Roche	11442074001
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	B2064
CaCl2	Sigma	C5670
Citrate buffer	Leagene	IH0305
Citric acid	Sigma	C2404
Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm	Head Biotechnology	H4566
DEPC-Treated Water	Sangon Biotech	B501005
Digital camera, fluorescence microscope	Nikon	NI-SSR 931479
E3 embryo medium	made in lab	N/A	5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4
Formamide	Invitrogen	AM9342
Goat serum	Sigma	G9023
Heparin sodium salt	J&K Scientific	542858
HYB	made in lab	N/A	preHYB plus 50 µg/mL heparin sodium salt, 100 µg/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt
Immunohistochemical wet box	Mkbio	MH10002
KCl	Sigma	P5405
Low profile leica blades	Leica	819
MABT (1x)	made in lab	N/A	0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5
Maleic acid	Sigma	M0375
Methanol	J&K Scientific	116481
Methylene blue	Macklin	M859248
MgSO4	Sigma	M2643
NaCl	Sigma	S5886
NTMT	made in lab	N/A	0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20
OCT medium	Tissue-Tek	4583
PAP pen	Enzo Life Sciences	ADI-950-233
Paraformaldehyde, 4%	Abbexa	abx082483	made in lab in 1x PBS
PBST (1x)	made in lab	N/A	1x PBS plus 0.1% Tween-20
Phenylthiourea	Merck	103-85-5
Phosphate-buffered saline (10x)	Invitrogen	AM9624
preHYB	made in lab	N/A	50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20
Proteinase K	Roche	1092766
Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt	Sigma	R3629
RNase-free 1.5 mL tubes	Ambion	AM12400
SSC (20x)	Invitrogen	AM9770
SSCT (0.2x)	made in lab	N/A	0.2x SSC plus 0.1% Tween-20
SSCT (1x)	made in lab	N/A	1x SSC plus 0.1% Tween-20
Sucrose	Invitrogen	15503022
Triton X-100	Sigma	T9284
Tween-20	Sigma	P1379
Zebrafish	Laboratory Animal Center of Nantong University	N/A