その場で 凍結切片ゼブラフィッシュ胚における免疫組織化学と組み合わせたハイブリダイゼーション

要約

このプロトコルでは、ゼブラフィッシュ胚切片の in situ ハイブリダイゼーションと免疫組織化学を組み合わせて画像を取得する方法について説明します。凍結切片の前に in situ ハイブリダイゼーションを行い、続いて抗体染色を行った。ゼブラフィッシュの2つの遺伝子の発現パターンを検出することは、抗体が不足している場合に有用です。

要約

脊椎動物として、ゼブラフィッシュは生物学的研究で広く使用されています。ゼブラフィッシュとヒトは高い遺伝的相同性を共有しているため、ヒトの病気のモデルとして使用できます。遺伝子機能研究は、遺伝子発現パターンの検出に基づいています。免疫組織化学はタンパク質発現をアッセイする強力な方法を提供しますが、ゼブラフィッシュの市販抗体の数が限られているため、共染色の適用が制限されます。 in situ ハイブリダイゼーションは、mRNA発現を検出するためにゼブラフィッシュ胚において広く使用されている。このプロトコルでは、ゼブラフィッシュ胚切片の in situ ハイブリダイゼーションと免疫組織化学を組み合わせて画像を取得する方法について説明します。凍結切片の前に in situ ハイブリダイゼーションを行い、続いて抗体染色を行った。免疫組織化学および単一凍結切片のイメージングは、 in situ ハイブリダイゼーション後に実施した。このプロトコルは、最初に in situ 転写産物検出によって、次に同じセクションのタンパク質に対する免疫組織化学によって、2つの遺伝子の発現パターンを解明するのに役立ちます。

概要

ゼブラフィッシュは、発生と遺伝学の研究のための強力な脊椎動物モデルです^1,2。ゼブラフィッシュとヒトは高い遺伝的相同性を共有しており(遺伝子の70%がヒトゲノムと共有されています)、ヒトの病気のモデルとして使用できます³。ゼブラフィッシュでは、2つの遺伝子の発現パターンとそれらの空間的関係を検出することは非常に一般的です。免疫組織化学は、FITC標識抗体を適用して感染組織内の病原体を検出するために1941年に最初に使用されました⁴。組織切片の標的タンパク質は、最初に一次抗体で標識され、次に切片は一次抗体の宿主種免疫グロブリンに対する二次抗体で標識されます。抗体染色は、タンパク質の局在を検出するための堅牢なアプローチであり、細胞内レベルで高い光学分解能を提供します。しかし、ゼブラフィッシュでは利用可能な抗体の数は非常に限られています。最近の研究では、約112,000の抗体がマウス用に市販されていることを示しています。しかしながら、ゼブラフィッシュ⁵において信頼性が実証されている抗体はほとんどない。

代わりに、ゼブラフィッシュでは、in situハイブリダイゼーションが遺伝子発現パターン解析に広く適用されている。この方法は、1980^年代にショウジョウバエ胚の遺伝子発現を評価するために最初に使用され^6,7、^それ以来、この技術は継続的に開発および改良されてきました。当初、放射性標識されたDNAプローブを使用してmRNA転写物を検出しました。しかし、空間分解能は比較的低く、放射能によって引き起こされる潜在的な健康リスクがありました。その後、in situハイブリダイゼーションは、アルカリホスファターゼ(AP)に結合するか、蛍光チラミドシグナル増幅(TSA)によって検出されるジゴキシゲニン(DIG)またはフルオレセイン(Fluo)で標識されたRNAプローブに依存しています^8,9。TSAは2つまたは3つの遺伝子の検出に使用されてきましたが、RNAプローブと抗DIG AP結合抗体のDIG標識は依然として高感度で安定しており、in situハイブリダイゼーションに広く使用されているアプローチです。したがって、DIG標識in situプローブと組み合わせた市販された抗体は、タンパク質の局在と1つの遺伝子の発現に関する洞察を提供するのに有用です。

ゼブラフィッシュの胚は小さく透明であるにもかかわらず、全マウント胚は光学分解能が低いため、遺伝子間の空間的関係を明らかにすることはできません¹⁰。そのため、細胞内レベルで遺伝子の発現パターンを解析するためには切片作成が必要です。凍結切開は、実行が容易で抗原を効果的に保存できるため、ゼブラフィッシュで広く使用されています。したがって、ゼブラフィッシュ凍結切片における免疫組織化学と組み合わせた in situ ハイブリダイゼーションは、2つの遺伝子の発現パターンを分析するための強力な方法を提供します。 in situ ハイブリダイゼーションと免疫組織化学の組み合わせがゼブラフィッシュ¹¹に適用されています。しかし、プロテイナーゼK処理は、抗原の完全性を犠牲にしてプローブの浸透を促進するために使用されました。この制限を克服するために、このプロトコルは加熱を使用して抗原賦活化を誘導します。このプロトコルは、さまざまなステージの胚やさまざまな厚さの組織切片(14μmの頭部切片と20μmの脊髄切片)に適用できるだけでなく、頭部と脊髄を含む2つの臓器で発現する遺伝子を使用して検証されています。

この記事では、凍結切片におけるゼブラフィッシュ胚における in situ ハイブリダイゼーションと抗体染色を組み合わせる方法について説明します。このプロトコルの汎用性は、2つの異なるニューロンに対するin situ ハイブリダイゼーションプローブを含む、多数の in situ ハイブリダイゼーション-免疫組織化学の組み合わせを使用することによって実証されます。この方法は、異なる領域および異なる年齢の胚におけるmRNAおよびタンパク質、ならびに2つの遺伝子の発現パターンを検出するのに適している。

プロトコル

すべての動物プロトコルは、南通大学の施設動物管理および使用委員会(No.S20191210-402)によって承認されました。

1. ゼブラフィッシュ胚の採取

1. 卵を採取する前夜に、トランスジェニックゼブラフィッシュとAB野生型ゼブラフィッシュ(Tg (foxP2:egfp-caax)X AB野生型または Tg (hb9:egfp)X AB野生型)のゼブラフィッシュのペアを飼育タンクに設置します( 材料表を参照)。斜めのプラスチック製の仕切りを使用してオスとメスを分離し、物理的なアクセスを防ぎます。翌日、真水で満たされた清潔な下部に飼育タンクの上部をはめ込み、飼育タンクの仕切りを取り外します。魚を10〜20分間交尾させ、飼育タンクの底に沈んだ後に卵を集めます。
2. メチレンブルー(1 LのE3胚培地に1 mLの0.05%メチレンブルー)を含むE3胚培地( 材料表を参照)で胚を28.5°Cで培養します。
3. 受精後24時間(hpf)の胚をフェニルチオ尿素(PTU、 材料表を参照)で処理して、色素形成を防ぎます。
   注:実験には、性別を問わず動物が使用されます。

2. in situ ハイブリダイゼーション

注意: 手順2.1〜2.11で使用する水は、ピロ炭酸ジエチル(DEPC)処理水です( 材料表を参照)。

1. ~10個の胚を0.5-1 mLの新鮮な4%パラホルムアルデヒド(PFA、 材料表参照)で1.5 mLの微量遠心管に4°Cで一晩12-14時間固定します。
   注: in situ ハイブリダイゼーションのプロトコルは、以前に公開された文献¹²からわずかに変更されています。PFAは、新たに調製し、使用後1週間以内に4°Cで、または-20°Cで1か月間保存する必要があります。 in situ ハイブリダイゼーションにおける以下の全ての工程を、1.5mLマイクロフュージチューブを用いて行った。
2. ピンセットを使用して、48 hpfより古い胚のみの皮膚を取り除きます。
   注:皮膚は、48 hpfより古い胚の体幹領域へのRNAプローブの浸透を促進するために除去されます。
3. 0.1%Tween-20を含む1xリン酸緩衝生理食塩水(PBST、 材料表を参照)で25%、50%、および75%メタノールで室温でそれぞれ5分間洗浄することにより、胚を徐々に脱水します。その後、胚を室温で100%メタノール中で5分間洗浄する。胚を100%メタノール中で-20°Cで少なくとも一晩12〜14時間インキュベートします。
   注:脱水胚は、-20°Cで100%メタノールに6か月間保存できます。
4. 75%、50%、および25%メタノールでPBSTで室温でそれぞれ5分間連続して洗浄することにより、胚を徐々に再水和します。胚をPBSTで室温でそれぞれ5分間3回洗浄します。
5. 室温のPBST中で10 μg/mLプロテイナーゼK( 材料表を参照)で胚を消化します( 表1を参照)。
6. 胚をPBSTで5分間洗浄します。この洗浄工程を3回行う。
7. 洗浄した胚を4%PFAに室温で15分間再固定します。
   注:PFAはプロテイナーゼKを不活性化するため、このステップは消化を停止します。 サンプルが穏やかに混合され、すべての胚がPFAにさらされていることを確認します。チューブをそれらの側面に配置して、溶液中の胚を均等に分配することができる。このPFAは新鮮である必要はありません(最大2週間冷蔵できます)。
8. 胚をPBSTで3回洗浄し、各洗浄中に5分間インキュベートします。
9. プレハイブリダイゼーション溶液(preHYB、 材料表参照)とともに65°Cで5分間インキュベートすることにより、胚のプレハイブリダイゼーションを行う。preHYBをハイブリダイゼーション溶液(HYB、 材料表を参照)に置き換え、HYB中で少なくとも4時間プレハイブリダイズします。
   注:プレハイブリダイゼーションを進める前に、溶液を65°Cに予熱してください。 ホルムアミド( 材料表を参照)は、組織の形状と構造を維持するために使用されます。ホルムアミドはまた、低温での非相同フラグメントの結合を防止する。
10. プローブ(Insm1aまたは5-HT2C)をHYB中で95°Cで5分間加熱してから、胚に添加します。プローブは 1 μg/mL HYB で使用してください。胚が空気に触れないようにできるだけ多くのpreHYBを取り除き、胚を含むチューブにHYBで予熱されたプローブを追加します。
    注:標識RNAプローブを使用して、胚内の標的mRNA配列とハイブリダイズすることができます。したがって、プローブは、目的の遺伝子の発現およびmRNAの位置を検出するために使用することができる。
11. プローブを50〜70°Cで一晩(12〜14時間)ハイブリダイズさせます。
    注:ハイブリダイゼーション温度はプローブによって異なります。
12. 翌日、プローブ溶液をピペットで吸引し、-20°Cのチューブに保存して、何度も再利用できるようにします。
13. 次のように胚を洗います。
    1. 胚を100%HYBで65°Cで15分間洗浄します。
    2. 胚を75%、50%、および25%HYBで、0.1%Tween-20を含む2x標準生理食塩水(SSCT、 材料表を参照)で65°Cでそれぞれ15分間順番に洗浄します。
    3. 胚を65°Cの2x SSCTで15分間洗浄します。
    4. 胚を0.2x SSCT中、65°Cで15分間洗浄します。
14. 胚を0.02%Tween-20を含むマレイン酸緩衝液(MABT、 材料表参照)中で室温で10分間2回洗浄する。
15. ハイブリダイズおよび洗浄した胚を、2%ブロッキング溶液-1で室温で少なくとも2時間ブロックします( 材料の表を参照)。
16. ブロッキング溶液-1をアンチジゴキシゲニンAP(1:4,000希釈、 材料表を参照)と新鮮な2%ブロッキング溶液-1に交換し、4°Cで12〜14時間一晩振とうします。
17. 胚を室温のMABT中で30分間4回洗浄する。
    注意: 3回目の洗浄中にBMパープル( 材料表を参照)を冷蔵庫から取り出し、その後の洗浄中に時々振ってください。
18. 胚をNTMTで10分間2回洗浄します(0.1 M Tris-HCl、0.1 M NaCl、1%Tween-20、 材料表を参照)。
19. ピペットを使用して、胚からできるだけ多くのNTMTを除去します。BMパープルAP基質と交換し、暗所で室温で胚を染色します。30分ごとに色の変化を監視して、染色の程度を制御します。
    注意: 特定の染色時間は異なり、各プローブに応じて調整する必要があります。胚を37°Cでインキュベートすると、反応を促進することができます。胚を4°Cでインキュベートすると、反応時間が長くなり、一晩で行うことができます。
20. 所望の程度に発達させたら、NTMTで2回短時間すすぎ、反応を停止させる。 in situ ハイブリダイゼーション後、胚をPBSTで20分間3回すすぐ。

3. 埋め込み

1. 胚を1x PBS中の5%スクロース( 材料表を参照)に4°Cで12〜14時間一晩浸します。
2. 胚を覆う溶液を1x PBS中の15%スクロースに変更し、4°Cで12〜16時間一晩インキュベートします。
3. 胚を覆う溶液を1x PBS中の30%スクロースに変更し、4°Cで1〜2日間インキュベートします。
   注:胚がチューブの底に沈むまで、この溶液でインキュベートします。
4. 極低温に最適な切削温度(OCT)媒体を充填します( 材料表を参照)。30%スクロース中の胚をOCT培地で凍結培地に移す。それらをかき混ぜて胚からスクロースを取り除きます。
5. 胚を組織用の新しいクライオモールドに移し、気泡の形成を避けながらOCT培地で静かに満たします。
6. 各胚を沈め、クライオモールドの底に押し込み、各胚を目的の方向(背腹側または側方)に配置します。胚を直線に保ちます。
   注:各クライオモルドに1つの胚のみを配置することを強くお勧めします( 材料表を参照)。
7. 埋め込まれた胚をドライアイスエタノール浴中のクライオモールドに入れる。
8. -80°Cで少なくとも一晩12〜14時間保管してください。
   注:クライオモールドは、-80°Cで少なくとも1か月間保持できます。

4.凍結セクション

1. クライオスタットを用いて凍結切片を-20°Cに設定する。
2. 試料ブロックをクライオモールドから取り出し、クライオスタットに入れます。冷やしたチャックのベースにOCT培地を置き、ブロックを上に置きます。
3. 試験片ブロックがかみそりの刃と平行であることを確認してください。試料の周りの余分なOCT培地を慎重に取り除きます。
4. クライオスタットを使用して厚さ12〜20μmの切片に切断します。各スライドに3〜4個のセクションがあるように、セクションをスライドガラスにすばやく転送します。サンプルを室温に到達させ、後で使用するために-80°Cの密閉スライドボックスにセクションを保管します。

5. 免疫染色

注:GFP染色は切片に対して行われます。

1. 切片を含むスライドをPBSで5分間洗浄します。
2. クエン酸緩衝液を電子レンジで沸騰するまで加熱する。
3. スライドをバッファーに入れ、加熱を続けて溶液を約20分間沸騰近くに保つ。
   注:このステップは抗原賦活化に役立ちます。組織は高温でも無傷のままであり、組織の折り畳み、損傷、または剥離を防ぐことにより、染色品質を向上させます。
4. 次のステップに進む前に、サンプルをゆっくりと室温まで冷まします。余分な溶液を排出し、各セクションの周囲をティッシュで慎重に乾燥させ、撥水性ペン( 材料の表を参照)でセクションの周りに円を描き、疎水性バリアを形成します。組織切片を乾燥させないように注意してください。
5. スライドをPBSで2回洗浄し、各洗浄中に10分間インキュベートします。
6. 室温でブロッキング溶液-2( 材料表を参照)で2時間ブロックします。
7. スライドにつき一次抗体溶液(マウスモノクローナルα-GFP、1:250、 材料表参照)をピペットで送り、スライドを免疫組織化学的ウェットボックス中で4°Cで一晩インキュベートします。
8. スライドをPBSで3回洗浄し、各洗浄中に10分間インキュベートします。
9. 余分なPBSを排出します。スライドを適切な二次抗体(1:400、 材料表を参照)とともに、PBS中で室温で1時間インキュベートします。
10. スライドをPBSで3回洗浄し、各洗浄中に10分間インキュベートします。
11. 余分なPBSを排出し、封入剤をスライドにピペットで移し、スライドカバースリップで取り付けます。

結果

このプロトコルは、1つのmRNAと1つのタンパク質の発現パターンを同時に調べるために使用できます。図1に実験ワークフローを示します。5-HT2C受容体は、神経伝達物質セロトニン(5-ヒドロキシトリプタミン、5-HT)によって結合された5-HT受容体のサブタイプです。中枢神経系(CNS)に広く分布しており、食欲、気分、不安、生殖行動など、さまざまな脳機能を大幅に調節する?...

ディスカッション

このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚の共局在実験における重要なステップであるin situハイブリダイゼーションと免疫組織化学の組み合わせを提案しています。この方法は、1つのmRNAと1つのタンパク質を同時に分析するための簡単で効率的な方法として機能します。in situハイブリダイゼーションおよび抗体染色をゼブラフィッシュ胚に対して行った。以前に公開されたいく?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 secondary antibody	Invitrogen	A21202
Anti-Digoxigenin AP Fab fragments	Roche	11093274910
Anti-GFP antibody	Millipore	MAB3580
Blocking reagent	Roche	11096176001
Blocking solution-1	made in lab	N/A	Dissolve the blocking reagent in 1X MAB to a final concentration of 10% (wt/vol). Autoclave and store at -20 °C before use.
Blocking solution-2	made in lab	N/A	0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS
BM purple	Roche	11442074001
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	B2064
CaCl2	Sigma	C5670
Citrate buffer	Leagene	IH0305
Citric acid	Sigma	C2404
Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm	Head Biotechnology	H4566
DEPC-Treated Water	Sangon Biotech	B501005
Digital camera, fluorescence microscope	Nikon	NI-SSR 931479
E3 embryo medium	made in lab	N/A	5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4
Formamide	Invitrogen	AM9342
Goat serum	Sigma	G9023
Heparin sodium salt	J&K Scientific	542858
HYB	made in lab	N/A	preHYB plus 50 µg/mL heparin sodium salt, 100 µg/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt
Immunohistochemical wet box	Mkbio	MH10002
KCl	Sigma	P5405
Low profile leica blades	Leica	819
MABT (1x)	made in lab	N/A	0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5
Maleic acid	Sigma	M0375
Methanol	J&K Scientific	116481
Methylene blue	Macklin	M859248
MgSO4	Sigma	M2643
NaCl	Sigma	S5886
NTMT	made in lab	N/A	0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20
OCT medium	Tissue-Tek	4583
PAP pen	Enzo Life Sciences	ADI-950-233
Paraformaldehyde, 4%	Abbexa	abx082483	made in lab in 1x PBS
PBST (1x)	made in lab	N/A	1x PBS plus 0.1% Tween-20
Phenylthiourea	Merck	103-85-5
Phosphate-buffered saline (10x)	Invitrogen	AM9624
preHYB	made in lab	N/A	50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20
Proteinase K	Roche	1092766
Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt	Sigma	R3629
RNase-free 1.5 mL tubes	Ambion	AM12400
SSC (20x)	Invitrogen	AM9770
SSCT (0.2x)	made in lab	N/A	0.2x SSC plus 0.1% Tween-20
SSCT (1x)	made in lab	N/A	1x SSC plus 0.1% Tween-20
Sucrose	Invitrogen	15503022
Triton X-100	Sigma	T9284
Tween-20	Sigma	P1379
Zebrafish	Laboratory Animal Center of Nantong University	N/A