その場で 凍結切片ゼブラフィッシュ胚における免疫組織化学と組み合わせたハイブリダイゼーション

要約

このプロトコルでは、ゼブラフィッシュ胚切片の in situ ハイブリダイゼーションと免疫組織化学を組み合わせて画像を取得する方法について説明します。凍結切片の前に in situ ハイブリダイゼーションを行い、続いて抗体染色を行った。ゼブラフィッシュの2つの遺伝子の発現パターンを検出することは、抗体が不足している場合に有用です。

要約

脊椎動物として、ゼブラフィッシュは生物学的研究で広く使用されています。ゼブラフィッシュとヒトは高い遺伝的相同性を共有しているため、ヒトの病気のモデルとして使用できます。遺伝子機能研究は、遺伝子発現パターンの検出に基づいています。免疫組織化学はタンパク質発現をアッセイする強力な方法を提供しますが、ゼブラフィッシュの市販抗体の数が限られているため、共染色の適用が制限されます。 in situ ハイブリダイゼーションは、mRNA発現を検出するためにゼブラフィッシュ胚において広く使用されている。このプロトコルでは、ゼブラフィッシュ胚切片の in situ ハイブリダイゼーションと免疫組織化学を組み合わせて画像を取得する方法について説明します。凍結切片の前に in situ ハイブリダイゼーションを行い、続いて抗体染色を行った。免疫組織化学および単一凍結切片のイメージングは、 in situ ハイブリダイゼーション後に実施した。このプロトコルは、最初に in situ 転写産物検出によって、次に同じセクションのタンパク質に対する免疫組織化学によって、2つの遺伝子の発現パターンを解明するのに役立ちます。

概要

ゼブラフィッシュは、発生と遺伝学の研究のための強力な脊椎動物モデルです^1,2。ゼブラフィッシュとヒトは高い遺伝的相同性を共有しており(遺伝子の70%がヒトゲノムと共有されています)、ヒトの病気のモデルとして使用できます³。ゼブラフィッシュでは、2つの遺伝子の発現パターンとそれらの空間的関係を検出することは非常に一般的です。免疫組織化学は、FITC標識抗体を適用して感染組織内の病原体を検出するために1941年に最初に使用されました⁴。組織切片の標的タンパク質は、最初に一次抗体で標識され、次に切片は一次抗体の宿主種免疫グロブリンに対する二次抗体で標識されます。抗体染色は、タンパク質の局在を検出するための堅牢なアプローチであり、細胞内レベルで高い光学分解能を提供します。しかし、ゼブラフィッシュでは利用可能な抗体の数は非常に限られています。最近の研究では、約112,000の抗体がマウス用に市販されていることを示しています。しかしながら、ゼブラフィッシュ⁵において信頼性が実証されている抗体はほとんどない。

代わりに、ゼブラフィッシュでは、in situハイブリダイゼーションが遺伝子発現パターン解析に広く適用され....

プロトコル

すべての動物プロトコルは、南通大学の施設動物管理および使用委員会(No.S20191210-402)によって承認されました。

1. ゼブラフィッシュ胚の採取

1. 卵を採取する前夜に、トランスジェニックゼブラフィッシュとAB野生型ゼブラフィッシュ(Tg (foxP2:egfp-caax)X AB野生型または Tg (hb9:egfp)X AB野生型)のゼブラフィッシュのペアを飼育タンクに設置します( 材料表を参照)。斜めのプラスチック製の仕切りを使用してオスとメスを分離し、物理的なアクセスを防ぎます。翌日、真水で満たされた清潔な下部に飼育タンクの上部をはめ込み、飼育タンクの仕切りを取り外します。魚を10〜20分間交尾させ、飼育タンクの底に沈んだ後に卵を集めます。
2. メチレンブルー(1 LのE3胚培地に1 mLの0.05%メチレンブルー)を含むE3胚培地( 材料表を参照)で胚を28.5°Cで培養します。
3. 受精後24時間(hpf)の胚をフェニルチオ尿素(PTU、 材料表を参照)で処理して、色素形成を防ぎます。
   注:実験には、性別を問わず動物が使用されます。

結果

このプロトコルは、1つのmRNAと1つのタンパク質の発現パターンを同時に調べるために使用できます。図1に実験ワークフローを示します。5-HT2C受容体は、神経伝達物質セロトニン(5-ヒドロキシトリプタミン、5-HT)によって結合された5-HT受容体のサブタイプです。中枢神経系(CNS)に広く分布しており、食欲、気分、不安、生殖行動など、さまざまな脳機能を大幅に調節する?.......

ディスカッション

このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚の共局在実験における重要なステップであるin situハイブリダイゼーションと免疫組織化学の組み合わせを提案しています。この方法は、1つのmRNAと1つのタンパク質を同時に分析するための簡単で効率的な方法として機能します。in situハイブリダイゼーションおよび抗体染色をゼブラフィッシュ胚に対して行った。以前に公開されたいく?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 secondary antibody	Invitrogen	A21202
Anti-Digoxigenin AP Fab fragments	Roche	11093274910
Anti-GFP antibody	Millipore	MAB3580
Blocking solution	made in lab	N/A	0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS
BM purple	Roche	11442074001
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	B2064
CaCl2	Sigma	C5670
Citrate buffer	Leagene	IH0305
Citric acid	Sigma	C2404
Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm	Head Biotechnology	H4566
DEPC-Treated Water	Sangon Biotech	B501005
Digital camera, fluorescence microscope	Nikon	NI-SSR 931479
E3 embryo medium	made in lab	N/A	5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4
Formamide	Invitrogen	AM9342
Goat serum	Sigma	G9023
Heparin sodium salt	J&K Scientific	542858
HYB	made in lab	N/A	preHYB plus 50 µg/mL heparin sodium salt, 100 µg/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt
Immunohistochemical wet box	Mkbio	MH10002
KCl	Sigma	P5405
Low profile leica blades	Leica	819
MABT (1x)	made in lab	N/A	0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5
Maleic acid	Sigma	M0375
Methanol	J&K Scientific	116481
Methylene blue	Macklin	M859248
MgSO4	Sigma	M2643
NaCl	Sigma	S5886
NTMT	made in lab	N/A	0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20
OCT medium	Tissue-Tek	4583
PAP pen	Enzo Life Sciences	ADI-950-233
Paraformaldehyde, 4%	Abbexa	abx082483	made in lab in 1x PBS
PBST (1x)	made in lab	N/A	1x PBS plus 0.1% Tween-20
Phenylthiourea	Merck	103-85-5
Phosphate-buffered saline (10x)	Invitrogen	AM9624
preHYB	made in lab	N/A	50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20
Proteinase K	Roche	1092766
Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt	Sigma	R3629
RNase-free 1.5 mL tubes	Ambion	AM12400
SSC (20x)	Invitrogen	AM9770
SSCT (0.2x)	made in lab	N/A	0.2x SSC plus 0.1% Tween-20
SSCT (1x)	made in lab	N/A	1x SSC plus 0.1% Tween-20
Sucrose	Invitrogen	15503022
Triton X-100	Sigma	T9284
Tween-20	Sigma	P1379
Zebrafish	Laboratory Animal Center of Nantong University	N/A