In Situ Kriyokesitli Zebra Balığı Embriyolarında İmmünohistokimya ile Kombine Hibridizasyon

Özet

Bu protokol, zebra balığı embriyonik kesitlerinin in situ hibridizasyonu ve immünohistokimyasını birleştirerek görüntülerin nasıl elde edileceğini açıklar. Kriyoseksiyondan önce in situ hibridizasyon yapıldı, bunu takiben antikor boyaması yapıldı. Zebra balığında iki genin ekspresyon kalıplarını, antikorların yetersizliği varsa tespit etmek yararlıdır.

Özet

Bir omurgalı olarak, zebra balığı biyolojik çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Zebra balığı ve insanlar, insan hastalıkları için bir model olarak kullanılmasına izin veren yüksek genetik homolojiyi paylaşırlar. Gen fonksiyon çalışması, gen ekspresyon paternlerinin tespitine dayanmaktadır. İmmünohistokimya, protein ekspresyonunu test etmek için güçlü bir yol sunsa da, zebra balığında ticari olarak temin edilebilen sınırlı sayıda antikor, costaining uygulamasını kısıtlamaktadır. In situ hibridizasyon, zebra balığı embriyolarında mRNA ekspresyonunu tespit etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu protokol, zebra balığı embriyo kesitleri için in situ hibridizasyon ve immünohistokimyayı birleştirerek görüntülerin nasıl elde edileceğini açıklamaktadır. Kriyoseksiyondan önce in situ hibridizasyon yapıldı, bunu takiben antikor boyaması yapıldı. İmmünohistokimya ve tek kriyokesimin görüntülenmesi in situ hibridizasyon sonrası yapıldı. Protokol, iki genin ekspresyon paternini, önce in situ transkript tespiti ve daha sonra aynı bölümdeki bir proteine karşı immünohistokimya ile çözmeye yardımcı olur.

Giriş

Zebra balığı, gelişim ve genetik çalışmaları için güçlü bir omurgalı modelidir ^1,2. Zebra balığı ve insanlar yüksek genetik homolojiyi paylaşırlar (genlerin% 70'i insan genomu ile paylaşılır), bu da insan hastalıkları için bir model olarak kullanılmasına izin verir³. Zebra balığında, iki genin ekspresyon kalıplarını ve mekansal ilişkilerini tespit etmek oldukça yaygındır. İmmünohistokimya ilk olarak 1941'de FITC etiketli antikorlar⁴ uygulayarak enfekte dokulardaki patojenleri tespit etmek için kullanılmıştır. Doku bölümündeki hedef protein ilk önce birincil bir antikor ile etiketlenir ve bölüm daha sonra birincil antikorun konakçı türü immünoglobuline karşı ikincil bir antikor ile etiketlenir. Antikor boyama, hücre içi düzeyde yüksek optik çözünürlük sunan proteinlerin lokalizasyonunu tespit etmek için sağlam bir yaklaşımdır. Bununla birlikte, zebra balıklarında mevcut antikorların sayısı çok sınırlıdır. Son zamanlarda yapılan bir çalışma, fareler için yaklaşık 112.000 antikorun ticari olarak mevcut olduğunu göstermektedir; Bununla birlikte, zebra balığı^5'te çok az antikorun güvenilir olduğu gösterilmiştir.

Bunun yerine, zebra balıklarında, in situ hibridizasyon, gen ekspresyon paterni analizi için yaygın olarak uygulanmıştır. Bu yöntem ilk olarak 1980'lerde Drosophila embriyolarında gen ekspresyonunu değerlendirmek için kullanılmıştır ^6,7 ve o zamandan beri bu teknoloji sürekli olarak geliştirilmiş ve iyileştirilmiştir. Başlangıçta, mRNA transkriptlerini tespit etmek için radyoaktif işaretli DNA probları kullanıldı; Bununla birlikte, uzamsal çözünürlük nispeten düşüktü ve radyoaktivitenin neden olduğu potansiyel sağlık riskleri vardı. Daha sonra, in situ hibridizasyon, alkali fosfataza (AP) konjuge edilen veya floresan tiramid sinyal amplifikasyonu (TSA) ile tespit edilen digoxigenin (^{DIG) veya} floresein (Fluo) ile etiketlenmiş RNA problarına ^dayanır8,9. TSA, iki veya üç geni tespit etmek için kullanılmasına rağmen, RNA problarının DIG etiketlemesi ve antiDIG AP-konjuge antikor, in situ hibridizasyon için hala oldukça hassas, kararlı ve yaygın olarak kullanılan yaklaşımlardır. Bu nedenle, DIG etiketli in situ problarla birleştirilen ticarileştirilmiş antikorlar, protein lokalizasyonu ve bir genin ekspresyonu hakkında fikir vermek için yararlıdır.

Tam montajlı embriyolar, zebra balığı embriyoları küçük ve şeffaf¹⁰ olmasına rağmen, düşük optik çözünürlük nedeniyle genler arasındaki uzamsal ilişkiyi ortaya çıkaramazlar. Bu nedenle, hücre içi düzeyde genlerin ekspresyon kalıplarını analiz etmek için kesitleme gereklidir. Kriyoseksiyon, zebra balıklarında yaygın olarak kullanılmaktadır, çünkü gerçekleştirilmesi kolaydır ve antijeni etkili bir şekilde koruyabilir. Bu nedenle, zebra balığı kriyoseksiyonlarında immünohistokimya ile kombine edilen in situ hibridizasyon, iki genin ekspresyon modellerini analiz etmek için güçlü bir yol sunar. Zebra balığı^11'e in situ hibridizasyon ve immünohistokimyanın bir kombinasyonu uygulanmıştır. Bununla birlikte, proteinaz K tedavisi, antijen bütünlüğü pahasına prob penetrasyonunu arttırmak için kullanılmıştır. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, bu protokol antijen alımını indüklemek için ısıtma kullanır. Bu protokol sadece farklı aşamalardaki embriyolara ve çeşitli kalınlıklardaki doku kesitlerine (14 μm kafa bölümleri ve 20 μm omurilik bölümleri) uygulanamaz, aynı zamanda baş ve omurilik de dahil olmak üzere iki organda eksprese edilen genler kullanılarak doğrulanmıştır.

Bu makalede, zebra balığı embriyolarında kriyoseksiyonlarda in situ hibridizasyon ve antikor boyamanın nasıl birleştirileceği anlatılacaktır. Bu protokolün çok yönlülüğü, iki farklı nöron için in situ hibridizasyon probları da dahil olmak üzere bir dizi in situ hibridizasyon-immünohistokimya kombinasyonu kullanılarak gösterilmiştir. Bu yöntem, farklı bölgelerdeki mRNA ve proteini ve farklı yaşlardaki embriyoları ve ayrıca iki genin ekspresyon modellerini tespit etmek için uygundur.

Protokol

Tüm hayvan protokolleri Nantong Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır (No. S20191210-402).

1. Zebra balığı embriyolarının toplanması

1. Yumurtaların toplanmasından önceki gece üreme tanklarında bir çift zebra balığı kurun, biri transgenik zebra balığı ve diğeri AB vahşi tip zebra balığı (Tg (foxP2: egfp-caax) X AB vahşi tip veya Tg (hb9: egfp) X AB vahşi tipi) (Malzeme Tablosuna bakınız). Fiziksel erişimi engellemek için erkek ve dişiyi ayırmak için çapraz bir plastik bölücü kullanın. Ertesi gün, üreme tankının üst kısmını tatlı suyla dolu temiz bir alt kısma yerleştirin ve üreme tankının bölücüsünü çıkarın. Balıkların 10-20 dakika çiftleşmesine izin verin ve üreme tankının dibine battıktan sonra yumurtaları toplayın.
2. 28.5 °C'de metilen mavisi (1 L E3 embriyo ortamında 1 mL% 0.05 metilen mavisi) içeren E3 embriyo ortamındaki embriyoları kültürleyin ( Materyaller Tablosuna bakınız).
3. Pigment oluşumunu önlemek için embriyoları döllenmeden (hpf) 24 saat sonra feniltiyoüre (PTU, Malzeme Tablosuna bakınız) ile tedavi edin.
   NOT: Deneylerde her iki cinsiyetten hayvanlar kullanılır.

2. In situ hibridizasyon

NOT: Adım 2.1-2.11 için kullanılan su, dietil pirokarbonat (DEPC) ile arıtılmış sudur ( Malzemeler Tablosuna bakınız).

1. 0.5-1 mL taze% 4 paraformaldehit (PFA, Malzeme Tablosuna bakınız) içeren ~ 10 embriyoyu, 12-14 saat boyunca gece boyunca 4 ° C'de 1.5 mL'lik bir mikrofüj tüpünde sabitleyin.
   NOT: In situ hibridizasyon protokolü daha önce yayınlanmış literatür^12'den biraz değiştirilmiştir. PFA, kullanımdan sonraki bir hafta içinde 4 ° C'de veya -20 ° C'de bir ay boyunca taze olarak hazırlanmalı ve saklanmalıdır. İn situ hibridizasyonda aşağıdaki tüm adımlar 1.5 mL mikrofüj tüpler kullanılarak gerçekleştirildi.
2. Sadece 48 hpf'den eski embriyoların derisini çıkarmak için cımbız kullanın.
   NOT: RNA problarının 48 hpf'den eski embriyoların gövde bölgesine nüfuz etmesini kolaylaştırmak için deri çıkarılır.
3. Embriyoları, oda sıcaklığında her biri 5 dakika boyunca% 0.1 Ara-20 içeren 1x fosfat tamponlu salin içinde% 25,% 50 ve% 75 metanol ile yıkayarak kademeli olarak dehidrate edin (PBST, Malzeme Tablosuna bakınız). Daha sonra, embriyoları oda sıcaklığında% 100 metanol içinde 5 dakika yıkayın. Embriyoları -20 ° C'de% 100 metanol içinde en az 12-14 saat boyunca en az bir gece boyunca inkübe edin.
   NOT: Susuz bırakılan embriyolar 6 ay boyunca -20 °C'de %100 metanol içinde saklanabilir.
4. PBST'de her biri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca art arda %75, %50 ve %25 metanol ile yıkayarak embriyoları kademeli olarak yeniden sulandırın. Embriyoyu PBST ile üç kez oda sıcaklığında her biri 5 dakika boyunca yıkayın.
5. Embriyoları PBST'de oda sıcaklığında 10 μg / mL proteinaz K ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile sindirin (bakınız Tablo 1).
6. Embriyoları PBST ile 5 dakika yıkayın. Bu yıkama adımını üç kez gerçekleştirin.
7. Yıkanmış embriyoları oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 4 PFA'da sabitleyin.
   NOT: Bu adım sindirimi durdurur, çünkü PFA proteinaz K'yı inaktive eder. Tüpler, embriyoları çözelti içinde eşit olarak dağıtmak için yanlarına yerleştirilebilir. Bu PFA'nın taze olması gerekmez (2 haftaya kadar soğutulabilir).
8. Embriyoyu PBST ile üç kez yıkayın, her yıkama sırasında 5 dakika inkübe edin.
9. Prehibridizasyon çözeltisi (preHYB, Malzeme Tablosuna bakınız) ile 5 dakika boyunca 65 ° C'de inkübe ederek embriyoların prehibridizasyonunu gerçekleştirin. PreHYB'yi hibridizasyon çözeltisi ile değiştirin (HYB, Malzeme Tablosuna bakın) ve HYB'de en az 4 saat prehibridize edin.
   NOT: Prehibridizasyona geçmeden önce, çözeltileri önceden 65 ° C'ye ısıtın. Formamid ( Malzeme Tablosuna bakınız) dokunun şeklini ve yapısını korumak için kullanılır. Formamid ayrıca homolog olmayan parçaların düşük sıcaklıklarda bağlanmasını önler.
10. Probu (Insm1a veya 5-HT2C) embriyolara eklemeden önce 95 ° C'de 5 dakika boyunca HYB'de ısıtın. Probu 1 μg/mL HYB'de kullanın. Embriyoların hava ile temas etmesine izin vermeden mümkün olduğunca fazla preHYB çıkarın ve embriyoları içeren tüpe HYB'de önceden ısıtılmış prob ekleyin.
    NOT: Embriyolarda hedef mRNA dizisi ile hibridize etmek için etiketli bir RNA probu kullanılabilir. Bu nedenle, prob, ilgilenilen bir genin ekspresyonunu ve mRNA'nın yerini tespit etmek için kullanılabilir.
11. Probun gece boyunca (12-14 saat) 50-70 ° C'de melezleşmesine izin verin.
    NOT: Hibridizasyon sıcaklığı farklı problar için farklılık gösterir.
12. Ertesi gün, prob çözeltisini bir pipetle aspire edin ve -20 ° C'de bir tüpte saklayın, böylece birçok kez tekrar kullanılabilir.
13. Embriyoları aşağıdaki gibi yıkayın:
    1. Embriyoları 65 °C'de %100 HYB ile 15 dakika yıkayın.
    2. Embriyoları, her biri 65 ° C'de 15 dakika boyunca% 0.1 Ara-20 (SSCT, Malzeme Tablosuna bakınız) içeren 2x standart salin sitrat içinde% 75,% 50 ve% 25 HYB ile sırayla yıkayın.
    3. Embriyoları 65 ° C'de 2x SSCT'de 15 dakika boyunca yıkayın.
    4. Embriyoları 65 ° C'de 0.2x SSCT'de 15 dakika boyunca yıkayın.
14. Embriyoları oda sıcaklığında% 0.02 Tween-20 (MABT, Malzeme Tablosuna bakınız) içeren maleik asit tamponunda 10 dakika boyunca iki kez yıkayın.
15. Hibridize edilmiş ve yıkanmış embriyoları oda sıcaklığında en az 2 saat boyunca %2 bloke edici çözelti-1 ile bloke edin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
16. Blokaj çözeltisi-1'i antidigoxigenin AP (1:4.000 seyreltme, Malzeme Tablosuna bakınız) ile %2'lik yeni bir bloke edici çözelti-1 içinde değiştirin ve 4 °C'de 12-14 saat boyunca gece boyunca çalkalayın.
17. Embriyoları oda sıcaklığında MABT'de 30 dakika boyunca dört kez yıkayın.
    NOT: Üçüncü yıkama sırasında BM morunu ( Malzeme Tablosuna bakınız) buzdolabından çıkarın ve sonraki yıkamalarda ara sıra çalkalayın.
18. Embriyoları NTMT'de 10 dakika boyunca iki kez yıkayın (0.1 M Tris-HCl, 0.1 M NaCl,% 1 Ara-20, Malzeme Tablosuna bakınız).
19. Embriyolardan mümkün olduğunca fazla NTMT'yi çıkarmak için bir pipet kullanın. BM mor AP substratı ile değiştirin ve embriyoları karanlıkta oda sıcaklığında boyayın. Boyama derecesini kontrol etmek için her 30 dakikada bir renk değişikliklerini izleyin.
    NOT: Özel boyama süresi farklıdır ve her bir proba göre ayarlanması gerekir. Embriyoların 37 ° C'de inkübe edilmesi reaksiyonu hızlandırabilir. Embriyoların 4 ° C'de inkübe edilmesi reaksiyon süresini artırabilir ve gece boyunca yapılabilir.
20. İstenilen ölçüde geliştirildikten sonra, NTMT ile iki kez kısa bir süre durulayarak reaksiyonu durdurun. In situ hibridizasyondan sonra, embriyoları PBST ile 20 dakika boyunca üç kez durulayın.

3. Gömme

1. Embriyoları, 4 ° C'de 12-14 saat boyunca gece boyunca% 5 sakkaroza 1x PBS'ye ( Malzeme Tablosuna bakınız) daldırın.
2. Embriyoları kapsayan çözeltiyi 1x PBS'de% 15 sakkaroz olarak değiştirin ve 4 ° C'de 12-16 saat boyunca gece boyunca inkübe edin.
3. Embriyoları kaplayan çözeltiyi 1x PBS'de% 30 sakkaroz olarak değiştirin ve 4 ° C'de 1-2 gün inkübe edin.
   NOT: Embriyolar tüpün dibine batana kadar bu çözeltide inkübe edin.
4. Bir kriyomoldu optimum kesme sıcaklığı (OCT) ortamıyla doldurun ( Malzeme Tablosuna bakın). Embriyoları% 30 sakkaroz içinde OCT ortamı ile kriyomusta aktarın. Sakkarozu embriyolardan çıkarmak için onları karıştırın.
5. Embriyoları doku için yeni bir kriyomusta aktarın ve kabarcık oluşumunu önleyerek OCT ortamıyla yavaşça doldurun.
6. Her embriyoyu batırın, kriyomoldun dibine itin ve her embriyoyu istenen yöne (dorsal-ventral veya lateral) yerleştirin. Embriyoları düz bir çizgide tutun.
   NOT: Her kriyomold içine sadece bir embriyo yerleştirilmesi şiddetle tavsiye edilir ( Malzeme Tablosuna bakınız).
7. Gömülü embriyoları kuru bir buz etanol banyosunda kriyomoldlara yerleştirin.
8. -80 ° C'de en az bir gece boyunca 12-14 saat saklayın.
   NOT: Kriyomoldlar en az bir ay boyunca -80 °C'de tutulabilir.

4. Kriyokesim

1. Bir kriyostat kullanarak kriyokesitleri -20 ° C'ye ayarlayın.
2. Numune bloğunu kriyomusttan çıkarın ve kriyostata yerleştirin. OCT ortamını soğutulmuş aynanın tabanına yerleştirin ve bloğu üstüne yerleştirin.
3. Numune bloğunun tıraş bıçağına paralel olduğundan emin olun. Numunenin etrafındaki fazla OCT ortamını dikkatlice kesin.
4. Bir kriyostat kullanarak 12-20 μm kalınlığında kesitler halinde kesin. Her slaytta 3-4 bölüm olması için bölümleri hızlı bir şekilde cam slaytlara aktarın. Numunelerin oda sıcaklığına ulaşmasına izin verin ve bölümleri daha sonra kullanmak üzere -80 ° C'de kapalı bir sürgü kutusunda saklayın.

5. İmmün boyama

NOT: Kesitlerde GFP boyama işlemi yapılır.

1. Bölümleri içeren slaytları PBS ile 5 dakika boyunca yıkayın.
2. Sitrat tamponunu mikrodalgada kaynatmak için ısıtın.
3. Slaytları tampona yerleştirin ve çözeltiyi yaklaşık 20 dakika kaynamaya yakın tutmak için ısıtmaya devam edin.
   NOT: Bu adım antijen alımına yardımcı olur. Doku, yüksek sıcaklıklarda bile bozulmadan kalır, bu da dokuların katlanmasını, hasar görmesini veya ayrılmasını önleyerek lekelenme kalitesini artırır.
4. Bir sonraki adımdan önce numunelerin yavaşça oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Fazla çözeltiyi boşaltın, her bölümün etrafındaki alanı bir parça doku ile dikkatlice kurutun ve hidrofobik bir bariyer oluşturmak için bölümün etrafına su itici bir kalemle ( Malzeme Tablosuna bakınız) bir daire çizin. Doku bölümlerini kurutmamaya dikkat edin.
5. Slaytları PBS ile iki kez yıkayın, her yıkama sırasında 10 dakika inkübe edin.
6. Oda sıcaklığında blokaj çözeltisi-2'de 2 saat boyunca bloke edin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
7. Slayt başına pipet birincil antikor çözeltisi (fare monoklonal α-GFP, 1:250, Malzeme Tablosuna bakınız) ve slaytları gece boyunca 4 °C'de immünohistokimyasal ıslak bir kutuda inkübe edin.
8. Slaytları PBS ile üç kez yıkayın, her yıkama sırasında 10 dakika inkübe edin.
9. Fazla PBS'yi boşaltın. Slaytları PBS'de oda sıcaklığında 1 saat boyunca uygun ikincil antikorla (1:400, Malzeme Tablosuna bakınız) inkübe edin.
10. Slaytları PBS ile üç kez yıkayın, her yıkama sırasında 10 dakika inkübe edin.
11. Fazla PBS'yi boşaltın, montaj ortamını slaytın üzerine pipet edin ve bir sürgü kapak kayması ile monte edin.

Sonuçlar

Bu protokol, bir mRNA ve bir proteinin ekspresyon paternini aynı anda incelemek için kullanılabilir. Şekil 1'de deneysel iş akışı gösterilmektedir. 5-HT2C reseptörü, nörotransmitter serotonin (5-hidroksitriptamin, 5-HT) tarafından bağlanan 5-HT reseptörünün bir alt tipidir. Merkezi sinir sisteminde (CNS) yaygın olarak dağılmıştır ve iştah, ruh hali, anksiyete ve üreme davranışı dahil olmak üzere çeşitli beyin fonksiyonlarını önemli ölçüde düzenleyebilir<...

Tartışmalar

Bu protokol, zebra balığı embriyoları üzerindeki kolokalizasyon deneylerinde önemli bir adım olan in situ hibridizasyon ve immünohistokimyanın bir kombinasyonunu önermektedir. Bu yöntem, bir mRNA ve bir proteini aynı anda analiz etmenin kolay ve etkili bir yolu olarak hizmet eder. Zebra balığı embriyolarında in situ hibridizasyon ve antikor boyama yapıldı. Daha önce^14,15,16 yayınlanan çeşitli protokollerin aksine^,

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 secondary antibody	Invitrogen	A21202
Anti-Digoxigenin AP Fab fragments	Roche	11093274910
Anti-GFP antibody	Millipore	MAB3580
Blocking reagent	Roche	11096176001
Blocking solution-1	made in lab	N/A	Dissolve the blocking reagent in 1X MAB to a final concentration of 10% (wt/vol). Autoclave and store at -20 °C before use.
Blocking solution-2	made in lab	N/A	0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS
BM purple	Roche	11442074001
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	B2064
CaCl2	Sigma	C5670
Citrate buffer	Leagene	IH0305
Citric acid	Sigma	C2404
Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm	Head Biotechnology	H4566
DEPC-Treated Water	Sangon Biotech	B501005
Digital camera, fluorescence microscope	Nikon	NI-SSR 931479
E3 embryo medium	made in lab	N/A	5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4
Formamide	Invitrogen	AM9342
Goat serum	Sigma	G9023
Heparin sodium salt	J&K Scientific	542858
HYB	made in lab	N/A	preHYB plus 50 µg/mL heparin sodium salt, 100 µg/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt
Immunohistochemical wet box	Mkbio	MH10002
KCl	Sigma	P5405
Low profile leica blades	Leica	819
MABT (1x)	made in lab	N/A	0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5
Maleic acid	Sigma	M0375
Methanol	J&K Scientific	116481
Methylene blue	Macklin	M859248
MgSO4	Sigma	M2643
NaCl	Sigma	S5886
NTMT	made in lab	N/A	0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20
OCT medium	Tissue-Tek	4583
PAP pen	Enzo Life Sciences	ADI-950-233
Paraformaldehyde, 4%	Abbexa	abx082483	made in lab in 1x PBS
PBST (1x)	made in lab	N/A	1x PBS plus 0.1% Tween-20
Phenylthiourea	Merck	103-85-5
Phosphate-buffered saline (10x)	Invitrogen	AM9624
preHYB	made in lab	N/A	50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20
Proteinase K	Roche	1092766
Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt	Sigma	R3629
RNase-free 1.5 mL tubes	Ambion	AM12400
SSC (20x)	Invitrogen	AM9770
SSCT (0.2x)	made in lab	N/A	0.2x SSC plus 0.1% Tween-20
SSCT (1x)	made in lab	N/A	1x SSC plus 0.1% Tween-20
Sucrose	Invitrogen	15503022
Triton X-100	Sigma	T9284
Tween-20	Sigma	P1379
Zebrafish	Laboratory Animal Center of Nantong University	N/A