На месте Гибридизация в сочетании с иммуногистохимией в криосекционированных эмбрионах рыбок данио-рерио

Резюме

В этом протоколе описывается, как получить изображения путем объединения гибридизации in situ и иммуногистохимии эмбриональных срезов рыбок данио. Гибридизация in situ проводилась перед криосекцией с последующим окрашиванием антителами. Полезно обнаружить паттерны экспрессии двух генов у рыбок данио, если антител не хватает.

Аннотация

Как позвоночные, рыбки данио-рерио широко используются в биологических исследованиях. Рыбки данио-рерио и люди имеют высокую генетическую гомологию, что позволяет использовать его в качестве модели заболеваний человека. Исследование функции генов основано на обнаружении паттернов экспрессии генов. Хотя иммуногистохимия предлагает мощный способ анализа экспрессии белка, ограниченное количество коммерчески доступных антител у рыбок данио-рерио ограничивает применение окрашивания. Гибридизация in situ широко используется у эмбрионов рыбок данио-рерио для обнаружения экспрессии мРНК. В этом протоколе описывается, как получить изображения путем комбинирования гибридизации in situ и иммуногистохимии для срезов эмбрионов рыбок данио. Гибридизация in situ проводилась перед криосекцией с последующим окрашиванием антителами. Иммуногистохимия и визуализация одной криосекции были выполнены после гибридизации in situ . Протокол полезен для разгадки паттерна экспрессии двух генов, сначала путем обнаружения транскрипта in situ , а затем путем иммуногистохимии против белка в том же участке.

Введение

Рыбки данио-рерио являются мощной моделью позвоночных для изучения развития и генетики ^1,2. Рыбки данио-рерио и люди имеют высокую генетическую гомологию (70% генов являются общими с геномом человека), что позволяет использовать его в качестве модели для болезней человека³. У рыбок данио-рерио довольно часто обнаруживаются паттерны экспрессии двух генов и их пространственные отношения. Иммуногистохимия была впервые использована в 1941 году для обнаружения патогенов в инфицированных тканях путем применения антител, меченных FITC⁴. Белок-мишень в тканевом срезе сначала помечают первичным антителом, а затем срез помечают вторичным антителом против иммуноглобулина-хозяина первичного антитела. Окрашивание антител — это надежный подход к обнаружению локализации белков, который обеспечивает высокое оптическое разрешение на внутриклеточном уровне. Тем не менее, количество доступных антител очень ограничено у рыбок данио. Недавнее исследование показывает, что около 112 000 антител коммерчески доступны для мышей; Тем не менее, было продемонстрировано, что очень немногие антитела являются надежными у рыбок^{данио-рерио 5}.

Вместо этого у рыбок данио-рерио гибридизация in situ широко применяется для анализа паттернов экспрессии генов. Этот метод был впервые использован для оценки экспрессии генов у эмбрионов дрозофилы в 1980-х годах^6,7, и с тех пор эта технология постоянно развивалась и совершенствовалась. Первоначально для обнаружения транскриптов мРНК использовались ДНК-зонды с радиоактивной меткой; Однако пространственное разрешение было относительно низким, и существовали потенциальные риски для здоровья, вызванные радиоактивностью. Впоследствии гибридизация in situ опирается на РНК-зонды, меченные дигоксигенином (DIG) или флуоресцеином (Fluo), которые конъюгированы с щелочной фосфатазой (AP) или обнаруживаются с помощью флуоресцентного усиления тирамидного сигнала (TSA)^8,9. Несмотря на то, что TSA используется для обнаружения двух или трех генов, маркировка DIG РНК-зондов и антиDIG-конъюгированные антитела AP по-прежнему являются высокочувствительными, стабильными и широко используемыми подходами для гибридизации in situ. Таким образом, коммерциализированные антитела в сочетании с DIG-меченными зондами in situ полезны для понимания локализации белка и экспрессии одного гена.

Цельные эмбрионы не могут выявить пространственную связь между генами из-за низкого оптического разрешения, даже несмотря на то, что эмбрионы рыбок данио-рерио маленькие и прозрачные¹⁰. Следовательно, секционирование необходимо для анализа паттернов экспрессии генов на внутриклеточном уровне. Криосекция широко используется у рыбок данио, поскольку она проста в выполнении и может эффективно сохранять антиген. Таким образом, гибридизация in situ в сочетании с иммуногистохимией в криосекциях рыбок данио-рерио предлагает мощный способ анализа паттернов экспрессии двух генов. Комбинация гибридизации in situ и иммуногистохимии была применена к рыбкам данио-рерио¹¹. Однако лечение протеиназой К использовалось для усиления проникновения зонда за счет целостности антигена. Чтобы преодолеть это ограничение, этот протокол использует нагревание, чтобы вызвать извлечение антигена. Этот протокол применим не только к эмбрионам разных стадий и срезам тканей различной толщины (срезы головы 14 мкм и срезы спинного мозга 20 мкм), но также был проверен с использованием генов, экспрессируемых в двух органах, включая головной и спинной мозг.

В этой статье будет описано, как сочетать гибридизацию in situ и окрашивание антител у эмбрионов рыбок данио-рерио в криосекциях. Универсальность этого протокола демонстрируется с помощью ряда комбинаций гибридизации и иммуногистохимии in situ, включая зонды гибридизации in situ для двух разных нейронов. Этот метод подходит для обнаружения мРНК и белка в разных регионах и эмбрионах разного возраста, а также паттернов экспрессии двух генов.

протокол

Все протоколы на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Университета Наньтун (No S20191210-402).

1. Коллекция эмбрионов рыбок данио-рерио

1. За ночь до сбора яиц поместите пару рыбок данио-рерио в аквариумы для размножения, одну из которых - трансгенную рыбку данио-рерио, а другую - рыбку данио-рерио дикого типа AB (Tg (foxP2: egfp-caax) X AB дикого типа или Tg (hb9: egfp) X дикого типа AB) (см. Таблицу материалов). Используйте диагональный пластиковый разделитель, чтобы разделить мужчину и женщину, чтобы исключить физический доступ. На следующий день поместите верхнюю часть резервуара для размножения в чистую нижнюю часть, заполненную пресной водой, и снимите разделитель резервуара для размножения. Дайте рыбе спариться в течение 10-20 минут и соберите икру после того, как она опустится на дно аквариума для разведения.
2. Культивируют эмбрионы в среде эмбриона Е3 (см. Таблицу материалов), содержащей метиленовый синий (1 мл 0,05% метиленового синего в 1 л среды эмбриона Е3) при 28,5 °C.
3. Обработайте эмбрионы через 24 часа после оплодотворения фенилтиомочевиной (ПТУ, см. Таблицу материалов) для предотвращения образования пигмента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В экспериментах используются животные обоего пола.

2. Гибридизация in situ

ПРИМЕЧАНИЕ: Вода, используемая для этапов 2.1-2.11, представляет собой воду, обработанную диэтилпирокарбонатом (DEPC) (см. Таблицу материалов).

1. Зафиксируйте ~ 10 эмбрионов 0,5-1 мл свежего 4% параформальдегида (PFA, см. Таблицу материалов) в микропробирке объемом 1,5 мл при 4 ° C на ночь в течение 12-14 часов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол гибридизации in situ немного изменен по сравнению с ранее опубликованной литературой¹². PFA должен быть свежеприготовленным и храниться при температуре 4 ° C в течение одной недели использования или в течение одного месяца при -20 ° C. Все последующие этапы гибридизации in situ выполнялись с использованием микропробирок объемом 1,5 мл.
2. Используйте пинцет для удаления кожи только у эмбрионов старше 48 лет.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кожа удаляется для облегчения проникновения РНК-зондов в область ствола эмбрионов старше 48 hpf.
3. Постепенно обезвоживайте эмбрионы, промывая 25%, 50% и 75% метанолом в 1x фосфатно-буферном физиологическом растворе, содержащем 0,1% Tween-20 последовательно (PBST, см. Таблицу материалов) в течение 5 мин каждый при комнатной температуре. Затем промойте эмбрионы в течение 5 минут в 100% метаноле при комнатной температуре. Инкубируют эмбрионы в 100% метаноле при -20 °C, по крайней мере, в течение ночи в течение 12-14 часов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обезвоженные эмбрионы можно хранить в 100% метаноле при -20 ° C в течение 6 месяцев.
4. Постепенно регидратируйте эмбрионы, промывая 75%, 50% и 25% метанола в PBST последовательно в течение 5 минут каждый при комнатной температуре. Промойте эмбрион трижды PBST в течение 5 минут каждый при комнатной температуре.
5. Переваривают эмбрионы протеиназой K 10 мкг/мл (см. Таблицу материалов) в PBST при комнатной температуре (см. Таблицу 1).
6. Промойте эмбрионы препаратом PBST в течение 5 минут. Выполните этот шаг стирки три раза.
7. Зафиксируйте промытые эмбрионы в 4% PFA в течение 15 минут при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг останавливает пищеварение, потому что PFA инактивирует протеиназу K. Убедитесь, что образец аккуратно перемешан, чтобы подвергнуть все эмбрионы воздействию PFA; Трубки могут быть размещены на боку, чтобы равномерно распределить эмбрионы в растворе. Этот PFA не обязательно должен быть свежим (его можно хранить в холодильнике до 2 недель).
8. Промойте эмбрион три раза PBST, инкубируя в течение 5 минут во время каждого мытья.
9. Проводят прегибридизацию эмбрионов путем инкубации с прегибридизационным раствором (preHYB, см. Таблицу материалов) при 65 ° C в течение 5 мин. Замените preHYB гибридизационным раствором (HYB, см. Таблицу материалов) и проведите прегибридизацию в течение не менее 4 ч в HYB.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем приступить к прегибридизации, предварительно нагрейте растворы до 65 °C. Формамид (см. Таблицу материалов) используется для поддержания формы и структуры ткани. Формамид также предотвращает связывание негомологичных фрагментов при низких температурах.
10. Нагрейте зонд (Insm1a или 5-HT2C) в HYB в течение 5 минут при 95 ° C перед добавлением к эмбрионам. Используйте зонд в концентрации 1 мкг/мл HYB. Удалите как можно больше preHYB, не позволяя эмбрионам вступать в контакт с воздухом, и добавьте предварительно нагретый зонд в HYB в пробирку, содержащую эмбрионы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Меченый РНК-зонд можно использовать для гибридизации с целевой последовательностью мРНК у эмбрионов. Таким образом, зонд может быть использован для обнаружения экспрессии интересующего гена и местоположения мРНК.
11. Дайте зонду гибридизоваться в течение ночи (12-14 ч) при 50-70 ° C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Температура гибридизации различается для разных зондов.
12. На следующий день аспирируйте раствор зонда пипеткой и храните его в пробирке при температуре -20 °C, чтобы его можно было использовать многократно.
13. Промывают эмбрионы следующим образом:
    1. Промойте эмбрионы в течение 15 минут со 100% HYB при 65 ° C.
    2. Промывают эмбрионы последовательно 75%, 50% и 25% HYB в 2x стандартном физиологическом растворе, содержащем 0,1% Tween-20 (SSCT, см. Таблицу материалов) в течение 15 мин каждый при 65 ° C.
    3. Промойте эмбрионы в течение 15 минут в 2x SSCT при 65 ° C.
    4. Промывают эмбрионы в течение 15 мин в 0,2x SSCT при 65 °C.
14. Промойте эмбрионы два раза в течение 10 мин в буфере малеиновой кислоты, содержащем 0,02% Tween-20 (MABT, см. Таблицу материалов) при комнатной температуре.
15. Гибридизованные и промытые эмбрионы блокируют не менее 2 ч при комнатной температуре 2% блокирующим раствором-1 (см. Таблицу материалов).
16. Замените блокирующий раствор-1 антидигоксигенином АП (разведение 1:4000, см. Таблицу материалов) в свежем 2% блокирующем растворе-1 и встряхните в течение ночи в течение 12-14 ч при 4 °C.
17. Промойте эмбрионы четыре раза в течение 30 мин в МАБТ при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выньте BM purple (см. Таблицу материалов) из холодильника во время третьей стирки и время от времени встряхивайте его во время последующих стирок.
18. Промойте эмбрионы два раза в течение 10 мин в NTMT (0,1 М Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 1% Tween-20, см. Таблицу материалов).
19. Используйте пипетку, чтобы удалить как можно больше NTMT из эмбрионов. Замените БМ фиолетовым субстратом AP и окрасьте эмбрионы при комнатной температуре в темноте. Следите за изменением цвета каждые 30 минут, чтобы контролировать степень окрашивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конкретное время окрашивания отличается и должно быть отрегулировано в соответствии с каждым зондом. Инкубация эмбрионов при 37 ° C может ускорить реакцию. Инкубация эмбрионов при 4 ° C может увеличить время реакции и может быть выполнена в течение ночи.
20. Как только он разовьется до желаемой степени, остановите реакцию, кратковременно промыв NTMT два раза. После гибридизации in situ трижды промывают эмбрионы PBST в течение 20 мин.

3. Встраивание

1. Погрузить эмбрионы в 5% сахарозу в 1x PBS (см. Таблицу материалов) на ночь на 12-14 ч при 4 °C.
2. Замените раствор, покрывающий эмбрионы, на 15% сахарозы в 1x PBS и инкубируйте в течение ночи в течение 12-16 ч при 4 ° C.
3. Замените раствор, покрывающий эмбрионы, на 30% сахарозы в 1x PBS и инкубируйте в течение 1-2 дней при 4 ° C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубируйте в этом растворе до тех пор, пока эмбрионы не опустятся на дно пробирки.
4. Заполните криомолд средой с оптимальной температурой резки (OCT) (см. Таблицу материалов). Перенесите эмбрионы в 30% сахарозе в криомолд со средой ОКТ. Перемешайте их, чтобы удалить сахарозу из эмбрионов.
5. Перенесите эмбрионы в новый криомолд для ткани и аккуратно заполните его средой ОКТ, избегая образования пузырьков.
6. Погрузите каждый эмбрион, подталкивая его к нижней части криоформы, и поместите каждый эмбрион в желаемую ориентацию (дорсально-вентральную или латеральную). Держите эмбрионы по прямой линии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется помещать только один эмбрион в каждый криомолд (см. Таблицу материалов).
7. Поместите внедренные эмбрионы в криоформы в ванну с сухим льдом.
8. Хранить при температуре -80 °C не менее чем на ночь в течение 12-14 часов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Криоформы можно хранить при температуре -80 °C не менее одного месяца.

4. Криосекция

1. Установите криосекцию с помощью криостата на -20 °C.
2. Извлеките блок образцов из криомолда и поместите его в криостат. Поместите OCT medium на основание охлажденного патрона и поместите блок сверху.
3. Убедитесь, что блок образцов параллелен лезвию бритвы. Аккуратно срежьте излишки среды OCT вокруг образца.
4. Разрезают на срезы толщиной 12-20 мкм с помощью криостата. Быстро перенесите секции на предметные стекла так, чтобы на каждом слайде было 3-4 секции. Дайте образцам нагреться до комнатной температуры и храните их в герметичном скользящем ящике при температуре -80 °C для последующего использования.

5. Иммуноокрашивание

ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание GFP выполняется на срезах.

1. Промойте предметные стекла, содержащие секции, PBS в течение 5 мин.
2. Нагрейте цитратный буфер до кипения в микроволновой печи.
3. Поместите предметные стекла в буфер и продолжайте нагревать, чтобы раствор оставался на уровне кипения в течение примерно 20 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг помогает в извлечении антигена. Ткань остается неповрежденной даже при высоких температурах, что улучшает качество окрашивания, предотвращая складывание, повреждение или отслоение тканей.
4. Дайте образцам медленно остыть до комнатной температуры перед следующим этапом. Слейте излишки раствора, тщательно высушите область вокруг каждого участка кусочком ткани и нарисуйте круг вокруг участка водоотталкивающей ручкой (см. Таблицу материалов), чтобы сформировать гидрофобный барьер. Будьте осторожны, чтобы не пересушить участки ткани.
5. Промойте предметные стекла два раза с помощью PBS, инкубируя в течение 10 минут во время каждой стирки.
6. Блок в течение 2 ч в блокирующем растворе-2 (см. Таблицу материалов) при комнатной температуре.
7. Раствор первичного антитела пипеткой (мышиный моноклональный α-GFP, 1:250, см. Таблицу материалов) на предметное стекло и инкубируйте предметные стекла в иммуногистохимическом влажном боксе при 4 ° C в течение ночи.
8. Промойте предметные стекла три раза с помощью PBS, инкубируя в течение 10 минут во время каждой стирки.
9. Слейте излишки PBS. Инкубируют предметные стекла с соответствующим вторичным антителом (1:400, см. Таблицу материалов) в течение 1 ч при комнатной температуре в PBS.
10. Промойте предметные стекла три раза с помощью PBS, инкубируя в течение 10 минут во время каждой стирки.
11. Слейте излишки PBS, нанесите монтажную среду пипеткой на предметное стекло и установите с помощью защитного стекла.

Результаты

Этот протокол может быть использован для одновременного изучения паттерна экспрессии одной мРНК и одного белка. На рисунке 1 показан экспериментальный рабочий процесс. Рецептор 5-HT2C является подтипом рецептора 5-HT, связанного нейротрансмиттером серотонином (5-гидроксит...

Обсуждение

Этот протокол предлагает комбинацию гибридизации in situ и иммуногистохимии, что является важным шагом в экспериментах по колокализации эмбрионов рыбок данио. Этот метод служит простым и эффективным способом одновременного анализа одной мРНК и одного белка. Гибридизацию in situ и...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 secondary antibody	Invitrogen	A21202
Anti-Digoxigenin AP Fab fragments	Roche	11093274910
Anti-GFP antibody	Millipore	MAB3580
Blocking reagent	Roche	11096176001
Blocking solution-1	made in lab	N/A	Dissolve the blocking reagent in 1X MAB to a final concentration of 10% (wt/vol). Autoclave and store at -20 °C before use.
Blocking solution-2	made in lab	N/A	0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS
BM purple	Roche	11442074001
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	B2064
CaCl2	Sigma	C5670
Citrate buffer	Leagene	IH0305
Citric acid	Sigma	C2404
Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm	Head Biotechnology	H4566
DEPC-Treated Water	Sangon Biotech	B501005
Digital camera, fluorescence microscope	Nikon	NI-SSR 931479
E3 embryo medium	made in lab	N/A	5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4
Formamide	Invitrogen	AM9342
Goat serum	Sigma	G9023
Heparin sodium salt	J&K Scientific	542858
HYB	made in lab	N/A	preHYB plus 50 µg/mL heparin sodium salt, 100 µg/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt
Immunohistochemical wet box	Mkbio	MH10002
KCl	Sigma	P5405
Low profile leica blades	Leica	819
MABT (1x)	made in lab	N/A	0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5
Maleic acid	Sigma	M0375
Methanol	J&K Scientific	116481
Methylene blue	Macklin	M859248
MgSO4	Sigma	M2643
NaCl	Sigma	S5886
NTMT	made in lab	N/A	0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20
OCT medium	Tissue-Tek	4583
PAP pen	Enzo Life Sciences	ADI-950-233
Paraformaldehyde, 4%	Abbexa	abx082483	made in lab in 1x PBS
PBST (1x)	made in lab	N/A	1x PBS plus 0.1% Tween-20
Phenylthiourea	Merck	103-85-5
Phosphate-buffered saline (10x)	Invitrogen	AM9624
preHYB	made in lab	N/A	50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20
Proteinase K	Roche	1092766
Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt	Sigma	R3629
RNase-free 1.5 mL tubes	Ambion	AM12400
SSC (20x)	Invitrogen	AM9770
SSCT (0.2x)	made in lab	N/A	0.2x SSC plus 0.1% Tween-20
SSCT (1x)	made in lab	N/A	1x SSC plus 0.1% Tween-20
Sucrose	Invitrogen	15503022
Triton X-100	Sigma	T9284
Tween-20	Sigma	P1379
Zebrafish	Laboratory Animal Center of Nantong University	N/A