Sul posto Ibridazione combinata con immunoistochimica in embrioni di zebrafish criosezionati

Riepilogo

Questo protocollo descrive come ottenere immagini combinando l'ibridazione in situ e l'immunoistochimica delle sezioni embrionali di zebrafish. L'ibridazione in situ è stata eseguita prima della criosezione, seguita dalla colorazione anticorpale. È utile rilevare i modelli di espressione di due geni nel pesce zebra se c'è una scarsità di anticorpi.

Abstract

Come vertebrato, il pesce zebra è stato ampiamente utilizzato negli studi biologici. Il pesce zebra e gli esseri umani condividono un'elevata omologia genetica, che ne consente l'uso come modello per le malattie umane. Lo studio della funzione genica si basa sulla rilevazione dei modelli di espressione genica. Sebbene l'immunoistochimica offra un modo potente per saggiare l'espressione proteica, il numero limitato di anticorpi disponibili in commercio nel pesce zebra limita l'applicazione del costaining. L'ibridazione in situ è ampiamente utilizzata negli embrioni di zebrafish per rilevare l'espressione di mRNA. Questo protocollo descrive come ottenere immagini combinando ibridazione in situ e immunoistochimica per sezioni di embrioni di zebrafish. L'ibridazione in situ è stata eseguita prima della criosezione, seguita dalla colorazione anticorpale. L'immunoistochimica e l'imaging di una singola criosezione sono stati eseguiti dopo l'ibridazione in situ . Il protocollo è utile per svelare il modello di espressione di due geni, prima mediante il rilevamento di trascritti in situ e poi mediante immunoistochimica contro una proteina nella stessa sezione.

Introduzione

Il pesce zebra è un potente modello di vertebrato per studi di sviluppo e genetica ^1,2. Il pesce zebra e l'uomo condividono un'elevata omologia genetica (il 70% dei geni sono condivisi con il genoma umano), che ne consente l'uso come modello per le malattie umane³. Nel pesce zebra, è abbastanza comune rilevare i modelli di espressione di due geni e la loro relazione spaziale. L'immunoistochimica è stata utilizzata per la prima volta nel 1941 per rilevare agenti patogeni nei tessuti infetti applicando anticorpi marcati con FITC⁴. La proteina bersaglio nella sezione del tessuto viene prima marcata con un anticorpo primario e la sezione viene quindi etichettata con un anticorpo secondario contro l'immunoglobulina della specie ospite dell'anticorpo primario. La colorazione anticorpale è un approccio robusto per rilevare la localizzazione delle proteine, che offre un'elevata risoluzione ottica a livello intracellulare. Tuttavia, il numero di anticorpi disponibili è molto limitato nel pesce zebra. Uno studio recente mostra che circa 112.000 anticorpi sono disponibili in commercio per i topi; Tuttavia, pochissimi anticorpi si sono dimostrati affidabili nel pesce zebra⁵.

Invece, nel pesce zebra, l'ibridazione in situ è stata ampiamente applicata per l'analisi del pattern di espressione genica. Questo metodo è stato utilizzato per la prima volta per valutare l'espressione genica negli embrioni di Drosophila nel 1980^6,7, e da allora^, questa tecnologia è stata continuamente sviluppata e migliorata. Inizialmente, sono state utilizzate sonde di DNA radiomarcate per rilevare trascritti di mRNA; Tuttavia, la risoluzione spaziale era relativamente bassa e c'erano potenziali rischi per la salute causati dalla radioattività. Successivamente, l'ibridazione in situ si basa sulle sonde di RNA marcate con digoxigenina (DIG) o fluoresceina (Fluo), che sono coniugate alla fosfatasi alcalina (AP) o rilevate mediante amplificazione del segnale fluorescente della tiramido (TSA)^8,9. Sebbene la TSA sia stata utilizzata per rilevare due o tre geni, l'etichettatura DIG delle sonde di RNA e degli anticorpi antiDIG coniugati con AP sono ancora approcci altamente sensibili, stabili e ampiamente utilizzati per l'ibridazione in situ. Pertanto, gli anticorpi commercializzati combinati con sonde in situ marcate con DIG sono utili per fornire informazioni sulla localizzazione delle proteine e sull'espressione di un gene.

Gli embrioni interi non possono rivelare la relazione spaziale tra i geni a causa della bassa risoluzione ottica, anche se gli embrioni di zebrafish sono piccoli e trasparenti¹⁰. Quindi, il sezionamento è necessario per analizzare i modelli di espressione dei geni a livello intracellulare. La criosezione è stata ampiamente utilizzata nel pesce zebra in quanto è facile da eseguire e può preservare efficacemente l'antigene. Pertanto, l'ibridazione in situ combinata con l'immunoistochimica nelle criosezioni del pesce zebra offre un modo potente per analizzare i modelli di espressione di due geni. Una combinazione di ibridazione in situ e immunoistochimica è stata applicata al pesce zebra¹¹. Tuttavia, il trattamento con proteinasi K è stato utilizzato per migliorare la penetrazione della sonda a scapito dell'integrità dell'antigene. Per superare questa limitazione, questo protocollo utilizza il riscaldamento per indurre il recupero dell'antigene. Questo protocollo non è applicabile solo a embrioni di diversi stadi e sezioni di tessuto di vari spessori (sezioni della testa da 14 μm e sezioni del midollo spinale da 20 μm), ma è stato anche verificato utilizzando geni espressi in due organi, tra cui la testa e il midollo spinale.

Questo articolo descriverà come combinare l'ibridazione in situ e la colorazione anticorpale negli embrioni di zebrafish nelle criosezioni. La versatilità di questo protocollo è dimostrata utilizzando una serie di combinazioni di ibridazione in situ-immunoistochimica, comprese le sonde di ibridazione in situ per due diversi neuroni. Questo metodo è adatto per rilevare mRNA e proteine in diverse regioni ed embrioni di età diverse, nonché i modelli di espressione di due geni.

Protocollo

Tutti i protocolli sugli animali sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Nantong (n. S20191210-402).

1. Raccolta di embrioni di zebrafish

1. Sistemare una coppia di zebrafish in vasche di riproduzione la sera prima della raccolta delle uova, uno un pesce zebra transgenico e l'altro un pesce zebra selvatico AB (Tg (foxP2:egfp-caax) X AB wild-type o Tg (hb9:egfp) X AB wild-type) (vedi la tabella dei materiali). Utilizzare un divisorio diagonale di plastica per separare il maschio e la femmina per precludere l'accesso fisico. Il giorno seguente, montare la parte superiore della vasca di riproduzione in una parte inferiore pulita piena di acqua dolce e rimuovere il divisorio della vasca di allevamento. Lasciare che il pesce si accoppia per 10-20 minuti e raccogliere le uova dopo che sono affondate sul fondo della vasca di riproduzione.
2. Coltura degli embrioni in terreno embrionale E3 (vedere la tabella dei materiali) contenente blu di metilene (1 mL di blu di metilene allo 0,05% in 1 L di terreno embrionale E3) a 28,5 °C.
3. Trattare gli embrioni a 24 ore dopo la fecondazione (hpf) con feniltiourea (PTU, vedere la tabella dei materiali) per prevenire la formazione di pigmento.
   NOTA: Gli animali di entrambi i sessi sono usati negli esperimenti.

2. Ibridazione in situ

NOTA: L'acqua utilizzata per le fasi 2.1-2.11 è acqua trattata con dietil pirocarbonato (DEPC) (vedere la tabella dei materiali).

1. Fissare ~10 embrioni con 0,5-1 mL di paraformaldeide fresca al 4% (PFA, vedi la Tabella dei Materiali) in una provetta microfuge da 1,5 mL a 4 °C per una notte per 12-14 ore.
   NOTA: Il protocollo per l'ibridazione in situ è leggermente modificato rispetto alla letteratura precedentemente pubblicata¹². Il PFA deve essere preparato di fresco e conservato a 4 °C entro una settimana dall'uso o per un mese a -20 °C. Tutte le fasi successive dell'ibridazione in situ sono state eseguite utilizzando provette microfughe da 1,5 ml.
2. Utilizzare una pinzetta per rimuovere la pelle solo degli embrioni di età superiore a 48 hpf.
   NOTA: La pelle viene rimossa per facilitare la penetrazione delle sonde di RNA nella regione del tronco degli embrioni di età superiore a 48 hpf.
3. Disidratare gradualmente gli embrioni lavando con il 25%, 50% e 75% di metanolo in 1x soluzione salina tamponata con fosfato contenente lo 0,1% di Tween-20 successivamente (PBST, vedere la tabella dei materiali) per 5 minuti ciascuno a temperatura ambiente. Quindi, lavare gli embrioni per 5 minuti in metanolo al 100% a temperatura ambiente. Incubare gli embrioni in metanolo al 100% a -20 °C per almeno una notte per 12-14 ore.
   NOTA: Gli embrioni disidratati possono essere conservati al 100% in metanolo a -20 °C per 6 mesi.
4. Reidratare gradualmente gli embrioni lavando con metanolo al 75%, 50% e 25% in PBST successivamente per 5 minuti ciascuno a temperatura ambiente. Lavare l'embrione tre volte con PBST per 5 minuti ciascuno a temperatura ambiente.
5. Digerire gli embrioni con 10 μg/mL di proteinasi K (vedere la Tabella dei Materiali) in PBST a temperatura ambiente (vedere Tabella 1).
6. Lavare gli embrioni con PBST per 5 minuti. Eseguire questa fase di lavaggio tre volte.
7. Rifissare gli embrioni lavati in PFA al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: Questo passaggio interrompe la digestione perché PFA inattiva la proteinasi K. Assicurarsi che il campione sia miscelato delicatamente per esporre tutti gli embrioni al PFA; I tubi possono essere posizionati sui loro lati per distribuire uniformemente gli embrioni nella soluzione. Questo PFA non deve essere fresco (può essere refrigerato per un massimo di 2 settimane).
8. Lavare l'embrione tre volte con PBST, incubando per 5 minuti durante ogni lavaggio.
9. Eseguire la preibridazione degli embrioni mediante incubazione con soluzione di preibridazione (preHYB, vedere la tabella dei materiali) a 65 °C per 5 minuti. Sostituire preHYB con una soluzione di ibridazione (HYB, vedere la tabella dei materiali) e preibridare per almeno 4 ore in HYB.
   NOTA: Prima di procedere con la preibridazione, preriscaldare le soluzioni a 65 °C. La formammide (vedi la tabella dei materiali) viene utilizzata per mantenere la forma e la struttura del tessuto. La formammide impedisce anche il legame di frammenti non omologhi a basse temperature.
10. Riscaldare la sonda (Insm1a o 5-HT2C) in HYB per 5 minuti a 95 °C prima di aggiungerla agli embrioni. Utilizzare la sonda a 1 μg/mL HYB. Rimuovere quanto più preHYB possibile senza lasciare che gli embrioni entrino in contatto con l'aria e aggiungere la sonda preriscaldata in HYB alla provetta contenente gli embrioni.
    NOTA: Una sonda di RNA marcata può essere utilizzata per ibridarsi con una sequenza di mRNA bersaglio negli embrioni. Pertanto, la sonda può essere utilizzata per rilevare l'espressione di un gene di interesse e la posizione dell'mRNA.
11. Lasciare ibridare la sonda durante la notte (12-14 h) a 50-70 °C.
    NOTA: la temperatura di ibridazione differisce per le diverse sonde.
12. Il giorno successivo, aspirare la soluzione della sonda con una pipetta e conservarla in un tubo a -20 °C in modo che possa essere riutilizzata più volte.
13. Lavare gli embrioni come segue:
    1. Lavare gli embrioni per 15 minuti con 100% HYB a 65 °C.
    2. Lavare gli embrioni in sequenza con HYB al 75%, 50% e 25% in 2x citrato salino standard contenente 0,1% di Tween-20 (SSCT, vedere la tabella dei materiali) per 15 minuti ciascuno a 65 °C.
    3. Lavare gli embrioni per 15 minuti in 2x SSCT a 65 °C.
    4. Lavare gli embrioni per 15 minuti in 0,2x SSCT a 65 °C.
14. Lavare gli embrioni due volte per 10 minuti in tampone di acido maleico contenente 0,02% Tween-20 (MABT, vedere la tabella dei materiali) a temperatura ambiente.
15. Bloccare gli embrioni ibridati e lavati per almeno 2 ore a temperatura ambiente con soluzione bloccante al 2% 1 (vedere la tabella dei materiali).
16. Sostituire la soluzione bloccante-1 con antidigoxigenina AP (diluizione 1:4.000, vedere la tabella dei materiali) in una nuova soluzione bloccante al 2%-1 e agitare per una notte per 12-14 ore a 4 °C.
17. Lavare gli embrioni quattro volte per 30 minuti in MABT a temperatura ambiente.
    NOTA: Rimuovere il BM purple (vedere la tabella dei materiali) dal frigorifero durante il terzo lavaggio e agitarlo di tanto in tanto durante i lavaggi successivi.
18. Lavare gli embrioni due volte per 10 minuti in NTMT (0,1 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 1% Tween-20, vedere la tabella dei materiali).
19. Utilizzare una pipetta per rimuovere quanto più NTMT possibile dagli embrioni. Sostituire con il substrato AP viola BM e colorare gli embrioni a temperatura ambiente al buio. Monitorare i cambiamenti di colore ogni 30 minuti per controllare il grado di tintura.
    NOTA: Il tempo di tintura specifico è diverso e deve essere regolato in base a ciascuna sonda. L'incubazione degli embrioni a 37 °C può accelerare la reazione. L'incubazione degli embrioni a 4 °C può aumentare il tempo di reazione e può essere effettuata durante la notte.
20. Una volta sviluppato nella misura desiderata, interrompere la reazione risciacquando brevemente con NTMT due volte. Dopo l'ibridazione in situ , sciacquare gli embrioni con PBST tre volte per 20 minuti.

3. Incorporamento

1. Immergere gli embrioni in saccarosio al 5% in 1x PBS (vedi la tabella dei materiali) durante la notte per 12-14 ore a 4 °C.
2. Cambiare la soluzione che copre gli embrioni al 15% di saccarosio in 1x PBS e incubare per una notte per 12-16 ore a 4 °C.
3. Cambiare la soluzione che copre gli embrioni al 30% di saccarosio in 1x PBS e incubare per 1-2 giorni a 4 °C.
   NOTA: Incubare in questa soluzione fino a quando gli embrioni affondano sul fondo del tubo.
4. Riempire un criomold con un mezzo a temperatura di taglio ottimale (OCT) (vedere la tabella dei materiali). Trasferire gli embrioni in saccarosio al 30% al criomold con terreno OCT. Mescolarli per rimuovere il saccarosio dagli embrioni.
5. Trasferire gli embrioni in un nuovo criomold per tessuto e riempirlo delicatamente con mezzo OCT, evitando la formazione di bolle.
6. Immergere ogni embrione, spingendolo verso il fondo del criostampo, e posizionare ogni embrione nell'orientamento desiderato (dorsale-ventrale o laterale). Mantieni gli embrioni in linea retta.
   NOTA: Si raccomanda vivamente di posizionare un solo embrione in ogni criomold (vedere la tabella dei materiali).
7. Posizionare gli embrioni incorporati in criostampi in un bagno di etanolo ghiacciato secco.
8. Conservare a -80 °C almeno per una notte per 12-14 h.
   NOTA: I criomuffi possono essere mantenuti a -80 °C per almeno un mese.

4. Criosezione

1. Impostare le criosezioni con un criostato a -20 °C.
2. Rimuovere il blocco del campione dal criomold e posizionarlo nel criostato. Posizionare il mezzo OCT sulla base del mandrino refrigerato e posizionare il blocco sopra.
3. Assicurarsi che il blocco del campione sia parallelo alla lama del rasoio. Tagliare con cura il mezzo OCT in eccesso attorno al campione.
4. Tagliare in sezioni spesse 12-20 μm usando un criostato. Trasferire rapidamente le sezioni su vetrini in modo che ogni diapositiva abbia 3-4 sezioni. Lasciare che i campioni raggiungano la temperatura ambiente e conservare le sezioni in una scatola di scorrimento sigillata a -80 °C per un uso successivo.

5. Immunocolorazione

NOTA: la colorazione GFP viene eseguita sulle sezioni.

1. Lavare i vetrini contenenti le sezioni con PBS per 5 min.
2. Riscaldare il tampone citrato a ebollizione in un forno a microonde.
3. Posizionare i vetrini nel tampone e continuare a riscaldare per mantenere la soluzione vicino all'ebollizione per circa 20 minuti.
   NOTA: questo passaggio aiuta nel recupero dell'antigene. Il tessuto rimane intatto anche ad alte temperature, il che migliora la qualità della colorazione prevenendo il piegamento, il danneggiamento o il distacco dei tessuti.
4. Lasciare raffreddare lentamente i campioni a temperatura ambiente prima della fase successiva. Scolare la soluzione in eccesso, asciugare accuratamente l'area intorno a ciascuna sezione con un pezzo di tessuto e disegnare un cerchio attorno alla sezione con una penna idrorepellente (vedere la tabella dei materiali) per formare una barriera idrofobica. Fare attenzione a non asciugare le sezioni di tessuto.
5. Lavare i vetrini due volte con PBS, incubando per 10 minuti durante ogni lavaggio.
6. Bloccare per 2 ore in soluzione bloccante-2 (vedere la tabella dei materiali) a temperatura ambiente.
7. Pipettare la soluzione di anticorpi primari (monoclonale di topo α-GFP, 1:250, vedere la tabella dei materiali) per vetrino e incubare i vetrini in una scatola umida immunoistochimica a 4 °C durante la notte.
8. Lavare i vetrini tre volte con PBS, incubando per 10 minuti durante ogni lavaggio.
9. Drenare il PBS in eccesso. Incubare i vetrini con l'anticorpo secondario appropriato (1:400, vedere la Tabella dei Materiali) per 1 ora a temperatura ambiente in PBS.
10. Lavare i vetrini tre volte con PBS, incubando per 10 minuti durante ogni lavaggio.
11. Scaricare il PBS in eccesso, pipettare il mezzo di montaggio sul vetrino e montare con una slitta di copertura della slitta.

Risultati

Questo protocollo può essere utilizzato per esaminare simultaneamente il modello di espressione di un mRNA e di una proteina. Nella Figura 1 viene illustrato il flusso di lavoro sperimentale. Il recettore 5-HT2C è un sottotipo del recettore 5-HT legato dal neurotrasmettitore serotonina (5-idrossitriptamina, 5-HT). È ampiamente distribuito nel sistema nervoso centrale (SNC) e può regolare significativamente una varietà di funzioni cerebrali, tra cui appetito, umore, ansia e comportamento...

Discussione

Questo protocollo propone una combinazione di ibridazione in situ e immunoistochimica, un passo importante negli esperimenti di colocalizzazione su embrioni di zebrafish. Questo metodo serve come un modo semplice ed efficiente per analizzare simultaneamente un mRNA e una proteina. L'ibridazione in situ e la colorazione anticorpale sono state eseguite su embrioni di zebrafish. In contrasto con diversi protocolli pubblicati in precedenza^14,15,16,<...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 secondary antibody	Invitrogen	A21202
Anti-Digoxigenin AP Fab fragments	Roche	11093274910
Anti-GFP antibody	Millipore	MAB3580
Blocking reagent	Roche	11096176001
Blocking solution-1	made in lab	N/A	Dissolve the blocking reagent in 1X MAB to a final concentration of 10% (wt/vol). Autoclave and store at -20 °C before use.
Blocking solution-2	made in lab	N/A	0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS
BM purple	Roche	11442074001
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	B2064
CaCl2	Sigma	C5670
Citrate buffer	Leagene	IH0305
Citric acid	Sigma	C2404
Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm	Head Biotechnology	H4566
DEPC-Treated Water	Sangon Biotech	B501005
Digital camera, fluorescence microscope	Nikon	NI-SSR 931479
E3 embryo medium	made in lab	N/A	5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4
Formamide	Invitrogen	AM9342
Goat serum	Sigma	G9023
Heparin sodium salt	J&K Scientific	542858
HYB	made in lab	N/A	preHYB plus 50 µg/mL heparin sodium salt, 100 µg/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt
Immunohistochemical wet box	Mkbio	MH10002
KCl	Sigma	P5405
Low profile leica blades	Leica	819
MABT (1x)	made in lab	N/A	0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5
Maleic acid	Sigma	M0375
Methanol	J&K Scientific	116481
Methylene blue	Macklin	M859248
MgSO4	Sigma	M2643
NaCl	Sigma	S5886
NTMT	made in lab	N/A	0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20
OCT medium	Tissue-Tek	4583
PAP pen	Enzo Life Sciences	ADI-950-233
Paraformaldehyde, 4%	Abbexa	abx082483	made in lab in 1x PBS
PBST (1x)	made in lab	N/A	1x PBS plus 0.1% Tween-20
Phenylthiourea	Merck	103-85-5
Phosphate-buffered saline (10x)	Invitrogen	AM9624
preHYB	made in lab	N/A	50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20
Proteinase K	Roche	1092766
Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt	Sigma	R3629
RNase-free 1.5 mL tubes	Ambion	AM12400
SSC (20x)	Invitrogen	AM9770
SSCT (0.2x)	made in lab	N/A	0.2x SSC plus 0.1% Tween-20
SSCT (1x)	made in lab	N/A	1x SSC plus 0.1% Tween-20
Sucrose	Invitrogen	15503022
Triton X-100	Sigma	T9284
Tween-20	Sigma	P1379
Zebrafish	Laboratory Animal Center of Nantong University	N/A