현장 Cryosectioned Zebrafish 배아에서 면역조직화학과 결합된 혼성화

요약

이 프로토콜은 제브라피쉬 배아 절편의 현장 혼성화와 면역조직화학을 결합하여 이미지를 얻는 방법을 설명합니다. 저온 절개 전에 제자리 하이브리드화를 수행한 후 항체 염색을 수행했습니다. 항체가 부족한 경우 제브라피쉬에서 두 유전자의 발현 패턴을 감지하는 것이 유용합니다.

초록

척추 동물로서 제브라 피쉬는 생물학적 연구에 널리 사용되었습니다. 제브라피쉬와 인간은 높은 유전적 상동성을 공유하여 인간 질병의 모델로 사용할 수 있습니다. 유전자 기능 연구는 유전자 발현 패턴의 검출을 기반으로 합니다. 면역조직화학은 단백질 발현을 분석하는 강력한 방법을 제공하지만, 제브라피쉬에서 상업적으로 이용 가능한 항체의 수가 제한되어 있어 코스테인의 적용이 제한됩니다. 제브라피쉬 배아에서 mRNA 발현을 검출하기 위해 제자리 하이브리드화( in situ hybridization)가 널리 사용됩니다. 이 프로토콜은 제브라피쉬 배아 섹션에 대한 현장 혼성화와 면역조직화학을 결합하여 이미지를 얻는 방법을 설명합니다. 저온 절개 전에 제자리 하이브리드화를 수행한 후 항체 염색을 수행했습니다. 면역조직화학 및 단일 cryosection의 이미징은 in situ hybridization 후에 수행되었습니다. 이 프로토콜은 먼저 현장 전사체 검출에 의해 두 유전자의 발현 패턴을 밝히는 데 도움이 되며, 그 다음에는 동일한 섹션의 단백질에 대한 면역조직화학에 의해 도움이 됩니다.

서문

제브라피쉬는 발달 및 유전학 연구를 위한 강력한 척추동물 모델입니다 ^1,2. 제브라피쉬와 인간은 높은 유전적 상동성(유전자의 70%가 인간 게놈과 공유됨)을 공유하여 인간 질병의 모델로 사용할 수 있습니다³. 제브라피쉬에서는 두 유전자의 발현 패턴과 공간적 관계를 감지하는 것이 일반적입니다. 면역조직화학(Immunohistochemistry)은 1941년에 FITC 표지 항체를 적용하여 감염된 조직에서 병원체를 검출하기 위해 처음 사용되었다⁴. 조직 섹션의 표적 단백질은 먼저 1차 항체로 표지되고, 그 다음에는 1차 항체의 숙주 종인 면역글로불린에 대한 2차 항체로 표지됩니다. 항체 염색은 단백질의 국소화를 검출하는 강력한 접근 방식으로, 세포 내 수준에서 높은 광학 분해능을 제공합니다. 그러나 제브라피쉬에서 사용할 수 있는 항체의 수는 매우 제한적입니다. 최근 연구에 따르면 약 112,000 개의 항체가 생쥐에 상업적으로 이용 가능합니다. 그러나 Zebrafish⁵에서 신뢰할 수 있는 것으로 입증된 항체는 거의 없습니다.

대신, 제브라피쉬에서 in situ 하이브리드화는 유전자 발현 패턴 분석에 널리 적용되었습니다. 이 방법은 1980년대^초파리 배아의 유전자 발현을 평가하기 위해 처음 사용되었으며, ^6,7, 그 이후로 이 기술은 지속적으로 개발되고 개선되었습니다. 초기에, 방사성 표지 DNA 프로브는 mRNA 전사체를 검출하기 위해 사용되었다; 그러나 공간 해상도는 상대적으로 낮았고 방사능으로 인한 잠재적인 건강 위험이 있었습니다. 그 후, 현장 하이브리드화는 디곡시제닌(DIG) 또는 플루오레세인(Fluo)으로 표지된 RNA 프로브에 의존하며, 이는 알칼리성 포스파타제(AP)에 접합되거나 형광 티라마이드 신호 증폭(TSA)에 의해 검출됩니다^8,9. TSA가 2개 또는 3개의 유전자를 검출하는 데 사용되었지만 RNA 프로브의 DIG 라벨링 및 antiDIG AP 접합 항체는 여전히 고감도, 안정적이며 현장 혼성화를 위해 널리 사용되는 접근 방식입니다. 따라서 DIG 표지된 in situ 프로브와 결합된 상용화된 항체는 단백질 국소화 및 한 유전자의 발현에 대한 통찰력을 제공하는 데 유용합니다.

전체 마운트 배아는 낮은 광학 해상도로 인해 유전자 간의 공간적 관계를 밝힐 수 없지만, 제브라피쉬 배아는 작고 투명합니다¹⁰. 따라서 세포 내 수준에서 유전자의 발현 패턴을 분석하기 위해서는 절편이 필요합니다. Cryosectioning은 수행하기 쉽고 항원을 효과적으로 보존할 수 있기 때문에 제브라피쉬에서 널리 사용되었습니다. 따라서 제브라피쉬 냉동절편의 면역조직화학과 결합된 현장 혼성화는 두 유전자의 발현 패턴을 분석하는 강력한 방법을 제공합니다. 제브라피쉬¹¹에 제자리 혼성화와 면역조직화학의 조합이 적용되었습니다. 그러나, 프로테이나제 K 처리는 항원 완전성을 희생시키면서 프로브 침투를 향상시키기 위해 사용되었다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 이 프로토콜은 항원 회수를 유도하기 위해 가열을 사용한다. 이 프로토콜은 다양한 두께의 다른 단계 및 조직 절편(14μm 머리 절편 및 20μm 척수 절편)의 배아에 적용할 수 있을 뿐만 아니라 두부와 척수를 포함한 두 기관에서 발현되는 유전자를 사용하여 검증되었습니다.

이 기사에서는 cryosections에서 제브라피쉬 배아에서 in situ hybridization과 항체 염색을 결합하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜의 다양성은 두 개의 서로 다른 뉴런에 대한 in situ 하이브리드화 프로브를 포함하여 다수의 in situ 하이브리드 화-면역조직화학 조합을 사용하여 입증됩니다. 이 방법은 서로 다른 영역과 다른 연령의 배아에서 mRNA와 단백질을 검출하는 데 적합하며 두 유전자의 발현 패턴을 검출하는 데 적합합니다.

프로토콜

모든 동물 프로토콜은 난퉁 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(No. S20191210-402)의 승인을 받았습니다.

1. 제브라 피쉬 배아 수집

1. 알을 채취하기 전날 밤에 번식 탱크에 한 쌍의 제브라피쉬를 설치하는데, 하나는 형질전환 제브라피쉬이고 다른 하나는 AB 야생형 제브라피쉬(Tg (foxP2:egfp-caax) X AB 야생형 또는 Tg (hb9:egfp) X AB 야생형)(재료 표 참조). 대각선 플라스틱 칸막이를 사용하여 남성과 여성을 분리하여 물리적 접근을 차단하십시오. 다음날 사육 탱크의 상부를 깨끗한 물로 채워진 깨끗한 하부에 끼우고 사육 탱크의 칸막이를 제거합니다. 물고기 짝짓기를 10-20분 동안 그대로 두고 번식 탱크 바닥에 가라앉은 알을 모으십시오.
2. 28.5°C에서 메틸렌 블루(1L의 E3 배아 배지에 0.05% 메틸렌 블루 1mL)를 함유하는 E3 배아 배지( 재료 표 참조)에서 배아를 배양합니다.
3. 수정 후 24시간(hpf)의 배아를 페닐티오우레아(PTU, 재료 표 참조)로 처리하여 색소 형성을 방지합니다.
   참고: 남녀 동물이 실험에 사용됩니다.

2. 현장 하이브리드화

알림: 2.1-2.11단계에 사용된 물은 디에틸 피로카보네이트(DEPC) 처리수입니다( 재료 표 참조).

1. ~10개의 배아를 0.5-1mL의 신선한 4% 파라포름알데히드(PFA, 재료 표 참조)로 1.5mL 미세분리기 튜브에 4°C에서 하룻밤 동안 12-14시간 동안 고정합니다.
   참고: 계내 혼성화를 위한 프로토콜은 이전에 발표된 문헌¹²에서 약간 수정되었습니다. PFA는 사용 후 1주일 이내에 또는 -20°C에서 1개월 동안 신선하게 준비하여 4°C에서 보관해야 합니다. 계내 하이브리드화의 모든 다음 단계는 1.5mL 마이크로소지 튜브를 사용하여 수행되었습니다.
2. 핀셋을 사용하여 48hpf보다 오래된 배아의 피부만 제거합니다.
   참고: 48hpf보다 오래된 배아의 몸통 영역으로 RNA 프로브가 침투하는 것을 촉진하기 위해 피부를 제거합니다.
3. 실온에서 각각 5분 동안 0.1% Tween-20을 함유하는 1x 인산염 완충 식염수(PBST, 재료 표 참조)에서 25%, 50% 및 75% 메탄올로 세척하여 배아를 점진적으로 탈수시킵니다. 이어서, 실온에서 100% 메탄올로 5분 동안 배아를 세척한다. 배아를 -20°C에서 100% 메탄올에서 적어도 12-14시간 동안 하룻밤 동안 배양합니다.
   참고: 탈수된 배아는 -20°C에서 100% 메탄올에 6개월 동안 보관할 수 있습니다.
4. 실온에서 각각 5분 동안 PBST에서 75%, 50% 및 25% 메탄올로 연속적으로 세척하여 배아를 점진적으로 재수화합니다. 배아를 실온에서 각각 5분 동안 PBST로 3회 세척한다.
5. 실온에서 PBST에서 10μg/mL proteinase K( 재료 표 참조)로 배아를 분해합니다( 표 1 참조).
6. 배아를 PBST로 5분 동안 세척합니다. 이 세척 단계를 세 번 수행하십시오.
7. 세척된 배아를 실온에서 15분 동안 4% PFA에 다시 고정합니다.
   참고: 이 단계는 PFA가 프로테이나제 K를 비활성화하기 때문에 소화를 중지합니다. 샘플이 부드럽게 혼합되어 모든 배아가 PFA에 노출되도록 합니다. 튜브를 측면에 배치하여 용액에 배아를 고르게 분배할 수 있습니다. 이 PFA는 신선할 필요가 없습니다(최대 2주 동안 냉장 보관할 수 있음).
8. 배아를 PBST로 세 번 세척하고 각 세척 동안 5분 동안 배양합니다.
9. 65°C에서 5분 동안 프리하이브리드화 용액(preHYB, 재료 표 참조)과 함께 배양하여 배아의 프리하이브리드화를 수행합니다. preHYB를 하이브리드화 용액(HYB, 재료 표 참조)으로 교체하고 HYB에서 최소 4시간 동안 프리하이브리드화합니다.
   알림: 사전 혼성화를 진행하기 전에 용액을 65°C로 예열합니다. 포름 아미드 ( 재료 표 참조)는 조직의 모양과 구조를 유지하는 데 사용됩니다. 포름아미드는 또한 저온에서 비상동 단편의 결합을 방지합니다.
10. 배아에 추가하기 전에 HYB에서 프로브(Insm1a 또는 5-HT2C)를 95°C에서 5분 동안 가열합니다. 1μg/mL HYB에서 프로브를 사용하십시오. 배아가 공기와 접촉하지 않도록 가능한 한 많은 preHYB를 제거하고 HYB의 예열 프로브를 배아가 들어 있는 튜브에 추가합니다.
    참고: 표지된 RNA 프로브를 사용하여 배아의 표적 mRNA 서열과 혼성화할 수 있습니다. 따라서, 상기 프로브는 관심 유전자의 발현 및 mRNA의 위치를 검출하는데 사용될 수 있다.
11. 프로브가 50-70°C에서 하룻밤(12-14시간) 혼성화되도록 합니다.
    참고: 하이브리드화 온도는 프로브마다 다릅니다.
12. 다음날 피펫으로 프로브 용액을 흡인하고 -20°C의 튜브에 보관하여 여러 번 재사용할 수 있도록 합니다.
13. 다음과 같이 배아를 씻으십시오.
    1. 65°C에서 100% HYB로 15분 동안 배아를 세척한다.
    2. 배아를 65°C에서 각각 15분 동안 0.1% Tween-20(SSCT, 재료 표 참조)을 함유하는 2x 표준 식염수 시트레이트에서 75%, 50% 및 25% HYB로 순차적으로 세척합니다.
    3. 배아를 65°C에서 2x SSCT로 15분 동안 세척합니다.
    4. 65°C에서 0.2x SSCT로 15분 동안 배아를 세척합니다.
14. 실온에서 0.02% Tween-20(MABT, 재료 표 참조)을 함유하는 말레산 완충액에서 10분 동안 배아를 2회 세척합니다.
15. 혼성화되고 세척된 배아를 2% 차단 용액-1로 실온에서 최소 2시간 동안 차단합니다( 재료 표 참조).
16. 블로킹 용액-1을 새로운 2% 블로킹 용액-1에서 안티디곡시제닌 AP(1:4,000 희석, 재료 표 참조)로 교체하고 4°C에서 12-14시간 동안 밤새 흔들어 줍니다.
17. 실온에서 MABT에서 30 분 동안 배아를 4 번 씻으십시오.
    알림: 세 번째 세탁 시 냉장고에서 BM 보라색( 재료 표 참조)을 꺼내고 이후 세탁 시 가끔 흔들어주세요.
18. 배아를 NTMT(0.1 M Tris-HCl, 0.1 M NaCl, 1% Tween-20, 재료 표 참조)에서 10분 동안 2회 세척합니다.
19. 피펫을 사용하여 배아에서 가능한 한 많은 NTMT를 제거하십시오. BM 보라색 AP 기질로 교체하고 어둠 속에서 실온에서 배아를 염색합니다. 염색 정도를 제어하기 위해 30분마다 색상 변화를 모니터링합니다.
    알림: 특정 염색 시간이 다르며 각 프로브에 따라 조정해야 합니다. 배아를 37°C에서 배양하면 반응을 가속화할 수 있습니다. 4°C에서 배아를 배양하면 반응 시간을 늘릴 수 있으며 밤새 수행할 수 있습니다.
20. 원하는 정도로 현상되면 NTMT로 두 번 짧게 헹구어 반응을 중지합니다. in situ 하이브리드화 후 배아를 PBST로 20분 동안 세 번 헹굽니다.

3. 임베딩

1. 배아를 1x PBS 중의 5% 수크로오스에 담그고( 재료 표 참조) 4°C에서 12-14시간 동안 밤새도록 합니다.
2. 배아를 덮는 용액을 1x PBS에서 15% 자당으로 변경하고 4°C에서 12-16시간 동안 밤새 배양합니다.
3. 배아를 덮고 있는 용액을 1x PBS 중 30% 수크로오스로 바꾸고 4°C에서 1-2일 동안 배양한다.
   참고: 배아가 튜브 바닥으로 가라앉을 때까지 이 용액에서 배양합니다.
4. 극저온 몰드를 최적 절단 온도(OCT) 매체로 채웁니다( 재료 표 참조). 30% 자당의 배아를 OCT 배지를 사용하여 cryomold로 옮깁니다. 배아에서 자당을 제거하기 위해 저어줍니다.
5. 배아를 조직을 위해 새로운 cryomold로 옮기고 기포의 형성을 피하면서 OCT 배지로 부드럽게 채 웁니다.
6. 각 배아를 담그고 극저온 몰드의 바닥으로 밀어 넣고 각 배아를 원하는 방향(등-복부 또는 측면)으로 놓습니다. 배아를 일직선으로 유지하십시오.
   참고: 각 cryomold에 하나의 배아만 배치하는 것이 좋습니다( 재료 표 참조).
7. 드라이아이스 에탄올 욕조의 극저온 몰드에 내장된 배아를 놓습니다.
8. -80 °C에서 하룻밤 이상 12-14시간 동안 보관하십시오.
   참고: 극저온 몰드는 -80°C에서 최소 한 달 동안 보관할 수 있습니다.

4. 냉동 절편

1. 저온 유지 장치를 사용하여 극저온 절편을 -20°C로 설정합니다.
2. cryomold에서 표본 블록을 제거하고 cryostat에 넣습니다. 식힌 척 바닥에 OCT 배지를 놓고 그 위에 블록을 놓습니다.
3. 시편 블록이 면도날과 평행한지 확인합니다. 표본 주변의 과도한 OCT 배지를 조심스럽게 잘라냅니다.
4. 저온 유지 장치를 사용하여 12-20 μm 두께의 섹션으로 자릅니다. 섹션을 유리 슬라이드로 빠르게 전송하여 각 슬라이드에 3-4 개의 섹션이 있도록합니다. 샘플이 실온에 도달하도록 하고 나중에 사용할 수 있도록 -80°C의 밀봉된 슬라이드 박스에 섹션을 보관합니다.

5. 면역염색

참고: GFP 염색은 절편에서 수행됩니다.

1. 절편이 포함된 슬라이드를 PBS로 5분 동안 세척합니다.
2. 구연산염 완충액을 전자레인지에 끓입니다.
3. 슬라이드를 버퍼에 넣고 약 20분 동안 용액이 거의 끓는 상태를 유지하도록 계속 가열합니다.
   참고: 이 단계는 항원 검색에 도움이 됩니다. 조직은 고온에서도 손상되지 않은 상태로 유지되어 조직의 접힘, 손상 또는 박리를 방지하여 염색 품질을 향상시킵니다.
4. 다음 단계 전에 샘플을 실온으로 천천히 식히십시오. 과잉 용액을 배출하고 티슈 조각으로 각 섹션 주변을 조심스럽게 건조시킨 다음 발수성 펜 ( 재료 표 참조)으로 섹션 주위에 원을 그려 소수성 장벽을 형성합니다. 조직 부분이 건조하지 않도록 주의하십시오.
5. 슬라이드를 PBS로 2회 세척하고, 각 세척 동안 10분 동안 인큐베이션한다.
6. 실온에서 블로킹 용액-2( 재료 표 참조)에서 2시간 동안 블럭합니다.
7. 슬라이드 당 1차 항체 용액(마우스 단일클론 α-GFP, 1:250, 표 참조)을 피펫으로 하고, 슬라이드를 면역조직화학 습윤 상자에서 하룻밤 동안 4°C에서 배양한다.
8. 슬라이드를 PBS로 3회 세척하고, 각 세척 동안 10분 동안 인큐베이션한다.
9. 초과 PBS를 배출하십시오. 적절한 2차 항체(1:400, 재료 표 참조)와 함께 슬라이드를 PBS의 실온에서 1시간 동안 인큐베이션합니다.
10. 슬라이드를 PBS로 3회 세척하고, 각 세척 동안 10분 동안 인큐베이션한다.
11. 여분의 PBS를 배출하고 마운팅 매체를 슬라이드에 피펫팅한 다음 슬라이드 커버슬립으로 장착합니다.

결과

이 프로토콜은 하나의 mRNA와 하나의 단백질의 발현 패턴을 동시에 검사하는 데 사용할 수 있습니다. 그림 1은 실험 워크플로를 보여줍니다. 5-HT2C 수용체는 신경전달물질인 세로토닌(5-hydroxytryptamine, 5-HT)에 의해 결합된 5-HT 수용체의 아형이다. 중추신경계(CNS)에 널리 분포되어 있으며 식욕, 기분, 불안, 생식 행동 등 다양한 뇌 기능을 크게 조절할 수 있다¹³. CN...

토론

이 프로토콜은 제브라피쉬 배아에 대한 colocalization 실험에서 중요한 단계인 현장 혼성화와 면역조직화학의 조합을 제안합니다. 이 방법은 하나의 mRNA와 하나의 단백질을 동시에 분석하는 쉽고 효율적인 방법입니다. 제브라피쉬 배아에 대해 제자리 하이브리드화 및 항체 염색을 수행했습니다. 이전에 발표된 여러 프로토콜과 대조적으로^14,15,16<...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 secondary antibody	Invitrogen	A21202
Anti-Digoxigenin AP Fab fragments	Roche	11093274910
Anti-GFP antibody	Millipore	MAB3580
Blocking reagent	Roche	11096176001
Blocking solution-1	made in lab	N/A	Dissolve the blocking reagent in 1X MAB to a final concentration of 10% (wt/vol). Autoclave and store at -20 °C before use.
Blocking solution-2	made in lab	N/A	0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS
BM purple	Roche	11442074001
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	B2064
CaCl2	Sigma	C5670
Citrate buffer	Leagene	IH0305
Citric acid	Sigma	C2404
Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm	Head Biotechnology	H4566
DEPC-Treated Water	Sangon Biotech	B501005
Digital camera, fluorescence microscope	Nikon	NI-SSR 931479
E3 embryo medium	made in lab	N/A	5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4
Formamide	Invitrogen	AM9342
Goat serum	Sigma	G9023
Heparin sodium salt	J&K Scientific	542858
HYB	made in lab	N/A	preHYB plus 50 µg/mL heparin sodium salt, 100 µg/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt
Immunohistochemical wet box	Mkbio	MH10002
KCl	Sigma	P5405
Low profile leica blades	Leica	819
MABT (1x)	made in lab	N/A	0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5
Maleic acid	Sigma	M0375
Methanol	J&K Scientific	116481
Methylene blue	Macklin	M859248
MgSO4	Sigma	M2643
NaCl	Sigma	S5886
NTMT	made in lab	N/A	0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20
OCT medium	Tissue-Tek	4583
PAP pen	Enzo Life Sciences	ADI-950-233
Paraformaldehyde, 4%	Abbexa	abx082483	made in lab in 1x PBS
PBST (1x)	made in lab	N/A	1x PBS plus 0.1% Tween-20
Phenylthiourea	Merck	103-85-5
Phosphate-buffered saline (10x)	Invitrogen	AM9624
preHYB	made in lab	N/A	50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20
Proteinase K	Roche	1092766
Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt	Sigma	R3629
RNase-free 1.5 mL tubes	Ambion	AM12400
SSC (20x)	Invitrogen	AM9770
SSCT (0.2x)	made in lab	N/A	0.2x SSC plus 0.1% Tween-20
SSCT (1x)	made in lab	N/A	1x SSC plus 0.1% Tween-20
Sucrose	Invitrogen	15503022
Triton X-100	Sigma	T9284
Tween-20	Sigma	P1379
Zebrafish	Laboratory Animal Center of Nantong University	N/A