In situ Hibridación combinada con inmunohistoquímica en embriones crioseccionados de pez cebra

Resumen

Este protocolo describe cómo obtener imágenes combinando hibridación in situ e inmunohistoquímica de secciones embrionarias de pez cebra. La hibridación in situ se realizó antes de la criosección, seguida de tinción de anticuerpos. Es útil detectar los patrones de expresión de dos genes en el pez cebra si hay escasez de anticuerpos.

Resumen

Como vertebrado, el pez cebra ha sido ampliamente utilizado en estudios biológicos. El pez cebra y los humanos comparten una alta homología genética, lo que permite su uso como modelo para enfermedades humanas. El estudio de la función génica se basa en la detección de patrones de expresión génica. Aunque la inmunohistoquímica ofrece una forma poderosa de evaluar la expresión de proteínas, el número limitado de anticuerpos disponibles comercialmente en el pez cebra restringe la aplicación de costaining. La hibridación in situ es ampliamente utilizada en embriones de pez cebra para detectar la expresión de ARNm. Este protocolo describe cómo obtener imágenes combinando hibridación in situ e inmunohistoquímica para secciones de embriones de pez cebra. La hibridación in situ se realizó antes de la criosección, seguida de tinción de anticuerpos. La inmunohistoquímica y la imagen de una sola criosección se realizaron después de la hibridación in situ . El protocolo es útil para desentrañar el patrón de expresión de dos genes, primero mediante la detección de transcripción in situ y luego mediante inmunohistoquímica contra una proteína en la misma sección.

Introducción

El pez cebra es un poderoso modelo vertebrado para estudios de desarrollo y genética ^1,2. El pez cebra y los humanos comparten una alta homología genética (el 70% de los genes son compartidos con el genoma humano), lo que permite su uso como modelo para enfermedades humanas³. En el pez cebra, es bastante común detectar los patrones de expresión de dos genes y su relación espacial. La inmunohistoquímica se utilizó por primera vez en 1941 para detectar patógenos en tejidos infectados mediante la aplicación de anticuerpos marcados con FITC⁴. La proteína diana en la sección de tejido se marca primero con un anticuerpo primario, y la sección se marca con un anticuerpo secundario contra la inmunoglobulina de la especie huésped del anticuerpo primario. La tinción de anticuerpos es un enfoque robusto para detectar la localización de proteínas, que ofrece una alta resolución óptica a nivel intracelular. Sin embargo, el número de anticuerpos disponibles es muy limitado en el pez cebra. Un estudio reciente muestra que aproximadamente 112,000 anticuerpos están disponibles comercialmente para ratones; Sin embargo, se ha demostrado que muy pocos anticuerpos son confiables en el pez cebra⁵.

En cambio, en el pez cebra, la hibridación in situ se ha aplicado ampliamente para el análisis de patrones de expresión génica. Este método se utilizó por primera vez para evaluar la expresión génica en embriones de Drosophila en la década de 1980^6,7, y desde entonces^, esta tecnología se ha desarrollado y mejorado continuamente. Inicialmente, se utilizaron sondas de ADN radiomarcadas para detectar transcripciones de ARNm; Sin embargo, la resolución espacial era relativamente baja y había riesgos potenciales para la salud causados por la radiactividad. Posteriormente, la hibridación in situ se basa en las sondas de ARN marcadas con digoxigenina (DIG) o fluoresceína (Fluo), que se conjugan con fosfatasa alcalina (AP) o se detectan mediante amplificación de señal de tiramida fluorescente (TSA)^8,9. Aunque TSA se ha utilizado para detectar dos o tres genes, el marcado DIG de sondas de ARN y el anticuerpo conjugado antiDIG AP siguen siendo enfoques altamente sensibles, estables y ampliamente utilizados para la hibridación in situ. Por lo tanto, los anticuerpos comercializados combinados con sondas in situ marcadas con DIG son útiles para proporcionar información sobre la localización de proteínas y la expresión de un gen.

Los embriones de montaje entero no pueden revelar la relación espacial entre los genes debido a la baja resolución óptica, a pesar de que los embriones de pez cebra son pequeños y transparentes¹⁰. Por lo tanto, la sección es necesaria para analizar los patrones de expresión de los genes a nivel intracelular. La criosección ha sido ampliamente utilizada en el pez cebra, ya que es fácil de realizar y puede preservar eficazmente el antígeno. Por lo tanto, la hibridación in situ combinada con inmunohistoquímica en criosecciones de pez cebra ofrece una forma poderosa de analizar los patrones de expresión de dos genes. Se ha aplicado una combinación de hibridación in situ e inmunohistoquímica al pez cebra¹¹. Sin embargo, el tratamiento con proteinasa K se utilizó para mejorar la penetración de la sonda a expensas de la integridad del antígeno. Para superar esta limitación, este protocolo utiliza el calentamiento para inducir la recuperación de antígenos. Este protocolo no solo es aplicable a embriones de diferentes estadios y secciones de tejido de diversos grosores (secciones de cabeza de 14 μm y secciones de médula espinal de 20 μm), sino que también se ha verificado mediante el uso de genes expresados en dos órganos, incluyendo la cabeza y la médula espinal.

Este artículo describirá cómo combinar la hibridación in situ y la tinción de anticuerpos en embriones de pez cebra en criosecciones. La versatilidad de este protocolo se demuestra mediante el uso de una serie de combinaciones de hibridación-inmunohistoquímica in situ, incluidas las sondas de hibridación in situ para dos neuronas diferentes. Este método es adecuado para detectar ARNm y proteínas en diferentes regiones y embriones de diferentes edades, así como los patrones de expresión de dos genes.

Protocolo

Todos los protocolos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Nantong (No. S20191210-402).

1. Recolección de embriones de pez cebra

1. Coloque un par de peces cebra en tanques de reproducción la noche antes de que se recolecten los huevos, uno un pez cebra transgénico y el otro un pez cebra de tipo salvaje AB (Tg (foxP2: egfp-caax) X AB tipo salvaje o Tg (hb9: egfp) X AB tipo salvaje) (consulte la Tabla de materiales). Use un divisor de plástico diagonal para separar al macho y a la hembra para impedir el acceso físico. Al día siguiente, coloque la parte superior del tanque de cría en una parte inferior limpia llena de agua dulce y retire el divisor del tanque de reproducción. Deje que los peces se apareen durante 10-20 minutos y recoja los huevos después de que se hayan hundido en el fondo del tanque de reproducción.
2. Cultivar los embriones en medio embrionario E3 (véase la Tabla de materiales) que contengan azul de metileno (1 ml de azul de metileno al 0,05% en 1 L de medio embrionario E3) a 28,5 °C.
3. Tratar los embriones a las 24 h después de la fertilización (hpf) con feniltiourea (PTU, consulte la Tabla de materiales) para prevenir la formación de pigmento.
   NOTA: Los animales de ambos sexos se utilizan en experimentos.

2. Hibridación in situ

NOTA: El agua utilizada para los pasos 2.1-2.11 es agua tratada con pirocarbonato de dietilo (DEPC) (consulte la Tabla de materiales).

1. Fijar ~10 embriones con 0.5-1 ml de paraformaldehído fresco al 4% (PFA, ver la Tabla de materiales) en un tubo de microfuga de 1.5 ml a 4 °C durante la noche durante 12-14 h.
   NOTA: El protocolo para la hibridación in situ se modifica ligeramente de la literatura publicada anteriormente¹². El PFA debe prepararse y almacenarse a 4 °C en el plazo de una semana de uso o durante un mes a -20 °C. Todos los siguientes pasos en la hibridación in situ se realizaron utilizando tubos de microfuga de 1,5 ml.
2. Use pinzas para eliminar la piel de embriones mayores de 48 hpf.
   NOTA: La piel se extrae para facilitar la penetración de sondas de ARN en la región del tronco de embriones mayores de 48 hpf.
3. Deshidratar gradualmente los embriones lavándolos con metanol al 25%, 50% y 75% en 1x solución salina tamponada con fosfato que contenga 0,1% de Tween-20 sucesivamente (PBST, consulte la Tabla de materiales) durante 5 minutos cada uno a temperatura ambiente. Luego, lave los embriones durante 5 minutos en metanol 100% a temperatura ambiente. Incubar los embriones en metanol al 100% a -20 °C durante al menos toda la noche durante 12-14 h.
   NOTA: Los embriones deshidratados se pueden almacenar en 100% de metanol a -20 °C durante 6 meses.
4. Rehidratar gradualmente los embriones lavando con 75%, 50% y 25% de metanol en PBST sucesivamente durante 5 min cada uno a temperatura ambiente. Lave el embrión tres veces con PBST durante 5 minutos cada una a temperatura ambiente.
5. Digerir los embriones con 10 μg/ml de proteinasa K (ver la Tabla de materiales) en PBST a temperatura ambiente (ver Tabla 1).
6. Lavar los embriones con PBST durante 5 min. Realice este paso de lavado tres veces.
7. Vuelva a fijar los embriones lavados en PFA al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente.
   NOTA: Este paso detiene la digestión porque la PFA inactiva la proteinasa K. Asegúrese de que la muestra se mezcle suavemente para exponer todos los embriones a PFA; Los tubos se pueden colocar de lado para distribuir uniformemente los embriones en la solución. Este PFA no tiene que ser fresco (se puede refrigerar hasta por 2 semanas).
8. Lave el embrión tres veces con PBST, incubando durante 5 minutos durante cada lavado.
9. Realizar la prehibridación de los embriones incubando con solución de prehibridación (preHYB, ver la Tabla de materiales) a 65 °C durante 5 min. Reemplace preHYB con solución de hibridación (HYB, consulte la Tabla de materiales) y prehibridar durante al menos 4 h en HYB.
   NOTA: Antes de proceder con la prehibridación, precaliente las soluciones a 65 °C. La formamida (ver la Tabla de materiales) se utiliza para mantener la forma y la estructura del tejido. La formamida también evita la unión de fragmentos no homólogos a bajas temperaturas.
10. Calentar la sonda (Insm1a o 5-HT2C) en HYB durante 5 min a 95 °C antes de añadirla a los embriones. Utilice la sonda a 1 μg/ml HYB. Retire la mayor cantidad posible de preHYB sin dejar que los embriones entren en contacto con el aire, y agregue una sonda precalentada en HYB al tubo que contiene los embriones.
    NOTA: Se puede utilizar una sonda de ARN marcada para hibridar con una secuencia de ARNm objetivo en los embriones. Por lo tanto, la sonda se puede utilizar para detectar la expresión de un gen de interés y la ubicación del ARNm.
11. Dejar que la sonda se hibridue durante la noche (12-14 h) a 50-70 °C.
    NOTA: La temperatura de hibridación difiere para diferentes sondas.
12. Al día siguiente, aspire la solución de la sonda con una pipeta y guárdela en un tubo a -20 °C para que pueda reutilizarse muchas veces.
13. Lave los embriones de la siguiente manera:
    1. Lavar los embriones durante 15 min con 100% HYB a 65 °C.
    2. Lave los embriones secuencialmente con 75%, 50% y 25% de HYB en 2x citrato salino estándar que contenga 0,1% de Tween-20 (SSCT, consulte la Tabla de materiales) durante 15 minutos cada uno a 65 °C.
    3. Lavar los embriones durante 15 min en 2x SSCT a 65 °C.
    4. Lavar los embriones durante 15 min en 0,2x SSCT a 65 °C.
14. Lave los embriones dos veces durante 10 minutos en tampón de ácido maleico que contenga 0.02% de Tween-20 (MABT, consulte la Tabla de materiales) a temperatura ambiente.
15. Bloquear los embriones hibridados y lavados durante al menos 2 h a temperatura ambiente con una solución bloqueante al 2%-1 (ver la Tabla de materiales).
16. Reemplace la solución bloqueante-1 con antidigoxigenina AP (dilución 1:4,000, ver la Tabla de materiales) en una solución de bloqueo fresca al 2%-1 y agite durante la noche durante 12-14 h a 4 °C.
17. Lave los embriones cuatro veces durante 30 minutos en MABT a temperatura ambiente.
    NOTA: Retire el BM púrpura (consulte la Tabla de materiales) del refrigerador durante el tercer lavado y agítelo ocasionalmente durante los lavados posteriores.
18. Lave los embriones dos veces durante 10 minutos en NTMT (0,1 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 1% Tween-20, consulte la Tabla de materiales).
19. Use una pipeta para eliminar la mayor cantidad posible de NTMT de los embriones. Reemplácelo con sustrato AP púrpura BM y tiñe los embriones a temperatura ambiente en la oscuridad. Controle los cambios de color cada 30 minutos para controlar el grado de teñido.
    NOTA: El tiempo de teñido específico es diferente y debe ajustarse de acuerdo con cada sonda. La incubación de los embriones a 37 °C puede acelerar la reacción. La incubación de los embriones a 4 °C puede aumentar el tiempo de reacción y se puede hacer durante la noche.
20. Una vez que se desarrolle en la medida deseada, detenga la reacción enjuagando brevemente con NTMT dos veces. Después de la hibridación in situ , enjuague los embriones con PBST tres veces durante 20 min.

3. Incrustación

1. Sumerja los embriones en sacarosa al 5% en 1x PBS (consulte la Tabla de materiales) durante la noche durante 12-14 h a 4 °C.
2. Cambiar la solución que cubre los embriones al 15% de sacarosa en 1x PBS e incubar durante la noche durante 12-16 h a 4 °C.
3. Cambiar la solución que cubre los embriones al 30% de sacarosa en 1x PBS e incubar durante 1-2 días a 4 °C.
   NOTA: Incubar en esta solución hasta que los embriones se hundan hasta el fondo del tubo.
4. Llene un criomold con un medio de temperatura de corte óptima (OCT) (consulte la Tabla de materiales). Transferir los embriones en sacarosa al 30% al criomold con medio OCT. Revuélvalos para eliminar la sacarosa de los embriones.
5. Transfiera los embriones a un nuevo criomold para tejido y llénelo suavemente con medio OCT, evitando la formación de burbujas.
6. Sumerge cada embrión, empujándolo hacia el fondo del criomolde, y coloca cada embrión en la orientación deseada (ya sea dorsal-ventral o lateral). Mantenga los embriones en línea recta.
   NOTA: Se recomienda encarecidamente colocar solo un embrión en cada criomold (consulte la Tabla de materiales).
7. Coloque los embriones incrustados en criomoldes en un baño de etanol de hielo seco.
8. Conservar a -80 °C al menos durante la noche durante 12-14 h.
   NOTA: Los criomoldes se pueden mantener a -80 °C durante al menos un mes.

4. Criosección

1. Ajuste las criosecciones con un criostato a -20 °C.
2. Retire el bloque de muestras del criomold y colóquelo en el criostato. Coloque el medio OCT en la base del mandril refrigerado y coloque el bloque encima.
3. Asegúrese de que el bloque de muestras esté paralelo a la hoja de afeitar. Recorte cuidadosamente el exceso de medio OCT alrededor de la muestra.
4. Cortar en secciones de 12-20 μm de espesor utilizando un criostato. Transfiera rápidamente las secciones a diapositivas de vidrio para que cada diapositiva tenga 3-4 secciones. Deje que las muestras alcancen la temperatura ambiente y guarde las secciones en una caja portaobjetos sellada a -80 °C para su uso posterior.

5. Inmunotinción

NOTA: La tinción GFP se realiza en las secciones.

1. Lave las diapositivas que contienen las secciones con PBS durante 5 minutos.
2. Calentar el tampón de citrato a ebullición en un microondas.
3. Coloque los portaobjetos en el tampón y continúe calentando para mantener la solución cerca de ebullición durante aproximadamente 20 minutos.
   NOTA: Este paso ayuda en la recuperación de antígenos. El tejido permanece intacto incluso a altas temperaturas, lo que mejora la calidad de la tinción al evitar el plegamiento, el daño o el desprendimiento de los tejidos.
4. Deje que las muestras se enfríen lentamente a temperatura ambiente antes del siguiente paso. Drene el exceso de solución, seque cuidadosamente el área alrededor de cada sección con un trozo de tejido y dibuje un círculo alrededor de la sección con una pluma repelente al agua (consulte la Tabla de materiales) para formar una barrera hidrófoba. Tenga cuidado de no secar las secciones de tejido.
5. Lave los portaobjetos dos veces con PBS, incubando durante 10 minutos durante cada lavado.
6. Bloquear durante 2 h en solución de bloqueo-2 (ver la Tabla de materiales) a temperatura ambiente.
7. Pipetear solución de anticuerpos primarios (α-GFP monoclonal de ratón, 1:250, véase la tabla de materiales) por portaobjetos e incubar los portaobjetos en una caja húmeda inmunohistoquímica a 4 °C durante la noche.
8. Lave los portaobjetos tres veces con PBS, incubando durante 10 minutos durante cada lavado.
9. Drenar el exceso de PBS. Incubar los portaobjetos con el anticuerpo secundario apropiado (1:400, ver la Tabla de materiales) durante 1 h a temperatura ambiente en PBS.
10. Lave los portaobjetos tres veces con PBS, incubando durante 10 minutos durante cada lavado.
11. Drene el exceso de PBS, pipete el medio de montaje en la corredera y monte con un cubreobjetos deslizante.

Resultados

Este protocolo se puede utilizar para examinar simultáneamente el patrón de expresión de un ARNm y una proteína. La figura 1 muestra el flujo de trabajo experimental. El receptor 5-HT2C es un subtipo del receptor 5-HT unido por el neurotransmisor serotonina (5-hidroxitriptamina, 5-HT). Está ampliamente distribuida en el sistema nervioso central (SNC) y puede regular significativamente una variedad de funciones cerebrales, incluyendo el apetito, el estado de ánimo, la ansiedad y el comp...

Discusión

Este protocolo propone una combinación de hibridación in situ e inmunohistoquímica, un paso importante en los experimentos de colocalización en embriones de pez cebra. Este método sirve como una forma fácil y eficiente de analizar simultáneamente un ARNm y una proteína. La hibridación in situ y la tinción de anticuerpos se realizaron en embriones de pez cebra. En contraste con varios protocolos publicados anteriormente^14,15,16,

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 secondary antibody	Invitrogen	A21202
Anti-Digoxigenin AP Fab fragments	Roche	11093274910
Anti-GFP antibody	Millipore	MAB3580
Blocking reagent	Roche	11096176001
Blocking solution-1	made in lab	N/A	Dissolve the blocking reagent in 1X MAB to a final concentration of 10% (wt/vol). Autoclave and store at -20 °C before use.
Blocking solution-2	made in lab	N/A	0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS
BM purple	Roche	11442074001
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	B2064
CaCl2	Sigma	C5670
Citrate buffer	Leagene	IH0305
Citric acid	Sigma	C2404
Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm	Head Biotechnology	H4566
DEPC-Treated Water	Sangon Biotech	B501005
Digital camera, fluorescence microscope	Nikon	NI-SSR 931479
E3 embryo medium	made in lab	N/A	5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4
Formamide	Invitrogen	AM9342
Goat serum	Sigma	G9023
Heparin sodium salt	J&K Scientific	542858
HYB	made in lab	N/A	preHYB plus 50 µg/mL heparin sodium salt, 100 µg/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt
Immunohistochemical wet box	Mkbio	MH10002
KCl	Sigma	P5405
Low profile leica blades	Leica	819
MABT (1x)	made in lab	N/A	0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5
Maleic acid	Sigma	M0375
Methanol	J&K Scientific	116481
Methylene blue	Macklin	M859248
MgSO4	Sigma	M2643
NaCl	Sigma	S5886
NTMT	made in lab	N/A	0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20
OCT medium	Tissue-Tek	4583
PAP pen	Enzo Life Sciences	ADI-950-233
Paraformaldehyde, 4%	Abbexa	abx082483	made in lab in 1x PBS
PBST (1x)	made in lab	N/A	1x PBS plus 0.1% Tween-20
Phenylthiourea	Merck	103-85-5
Phosphate-buffered saline (10x)	Invitrogen	AM9624
preHYB	made in lab	N/A	50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20
Proteinase K	Roche	1092766
Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt	Sigma	R3629
RNase-free 1.5 mL tubes	Ambion	AM12400
SSC (20x)	Invitrogen	AM9770
SSCT (0.2x)	made in lab	N/A	0.2x SSC plus 0.1% Tween-20
SSCT (1x)	made in lab	N/A	1x SSC plus 0.1% Tween-20
Sucrose	Invitrogen	15503022
Triton X-100	Sigma	T9284
Tween-20	Sigma	P1379
Zebrafish	Laboratory Animal Center of Nantong University	N/A