In situ Hybridisierung kombiniert mit Immunhistochemie in kryogeschnittenen Zebrafischembryonen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt, wie Bilder durch die Kombination von In-situ-Hybridisierung und Immunhistochemie von Zebrafisch-Embryonalschnitten erhalten werden können. Vor der Kryosektion wurde eine In-situ-Hybridisierung durchgeführt, gefolgt von einer Antikörperfärbung. Es ist nützlich, die Expressionsmuster zweier Gene im Zebrafisch nachzuweisen, wenn ein Mangel an Antikörpern vorliegt.

Zusammenfassung

Als Wirbeltier ist der Zebrafisch in biologischen Studien weit verbreitet. Zebrafisch und Mensch teilen eine hohe genetische Homologie, die es ermöglicht, sie als Modell für menschliche Krankheiten zu verwenden. Die Genfunktionsstudie basiert auf der Detektion von Genexpressionsmustern. Obwohl die Immunhistochemie eine leistungsfähige Methode zur Bestimmung der Proteinexpression bietet, schränkt die begrenzte Anzahl kommerziell erhältlicher Antikörper im Zebrafisch die Anwendung der Cofärbung ein. Die In-situ-Hybridisierung wird häufig in Zebrafischembryonen eingesetzt, um die mRNA-Expression nachzuweisen. Dieses Protokoll beschreibt, wie man Bilder durch die Kombination von In-situ-Hybridisierung und Immunhistochemie für Zebrafisch-Embryonenschnitte erhält. Vor der Kryosektion wurde eine In-situ-Hybridisierung durchgeführt, gefolgt von einer Antikörperfärbung. Die Immunhistochemie und die Bildgebung eines einzelnen Kryoschnitts wurden nach in situ Hybridisierung durchgeführt. Das Protokoll ist hilfreich, um das Expressionsmuster zweier Gene zu entschlüsseln, zuerst durch In-situ-Transkriptdetektion und dann durch Immunhistochemie gegen ein Protein im selben Abschnitt.

Einleitung

Der Zebrafisch ist ein leistungsfähiges Wirbeltiermodell für Entwicklungs- und Genetikstudien ^1,2. Zebrafisch und Mensch haben eine hohe genetische Homologie (70 % der Gene werden mit dem menschlichen Genom geteilt), was die Verwendung als Modell für menschliche Krankheiten ermöglicht³. Im Zebrafisch ist es durchaus üblich, die Expressionsmuster zweier Gene und ihre räumliche Beziehung zu erkennen. Die Immunhistochemie wurde erstmals 1941 zum Nachweis von Krankheitserregern in infizierten Geweben durch Anwendung von FITC-markierten Antikörpern eingesetzt⁴. Das Zi....

Protokoll

Alle Tierprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Universität Nantong genehmigt (Nr. S20191210-402).

1. Entnahme von Zebrafisch-Embryonen

1. In der Nacht vor der Entnahme der Eier ein Zebrafischpaar in Zuchtbecken aufstellen, einen transgenen Zebrafisch und einen AB-Wildtyp-Zebrafisch (Tg (foxP2:egfp-caax) X AB Wildtyp oder Tg (hb9:egfp) X AB Wildtyp) (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie eine diagonale Trennwand aus Kunststoff, um den Mann und die Frau zu trennen, um einen physischen Zugang auszuschließen. Setzen Sie am nächsten Tag d....

Ergebnisse

Mit diesem Protokoll kann das Expressionsmuster einer mRNA und eines Proteins gleichzeitig untersucht werden. Abbildung 1 zeigt den experimentellen Arbeitsablauf. Der 5-HT2C-Rezeptor ist ein Subtyp des 5-HT-Rezeptors, der an den Neurotransmitter Serotonin (5-Hydroxytryptamin, 5-HT) gebunden ist. Es ist im zentralen Nervensystem (ZNS) weit verbreitet und kann eine Vielzahl von Gehirnfunktionen wie Appetit, Stimmung, Angst und Fortpflanzungsverhalten erheblich regulieren¹³

Diskussion

Dieses Protokoll schlägt eine Kombination aus In-situ-Hybridisierung und Immunhistochemie vor, ein wichtiger Schritt in den Kolokalisationsexperimenten an Zebrafischembryonen. Diese Methode dient als einfache und effiziente Möglichkeit, gleichzeitig eine mRNA und ein Protein zu analysieren. In-situ-Hybridisierung und Antikörperfärbung wurden an Zebrafischembryonen durchgeführt. Im Gegensatz zu mehreren zuvor veröffentlichten Protokollen^{14,15,16<.......}

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 secondary antibody	Invitrogen	A21202
Anti-Digoxigenin AP Fab fragments	Roche	11093274910
Anti-GFP antibody	Millipore	MAB3580
Blocking solution	made in lab	N/A	0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS
BM purple	Roche	11442074001
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	B2064
CaCl2	Sigma	C5670
Citrate buffer	Leagene	IH0305
Citric acid	Sigma	C2404
Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm	Head Biotechnology	H4566
DEPC-Treated Water	Sangon Biotech	B501005
Digital camera, fluorescence microscope	Nikon	NI-SSR 931479
E3 embryo medium	made in lab	N/A	5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4
Formamide	Invitrogen	AM9342
Goat serum	Sigma	G9023
Heparin sodium salt	J&K Scientific	542858
HYB	made in lab	N/A	preHYB plus 50 µg/mL heparin sodium salt, 100 µg/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt
Immunohistochemical wet box	Mkbio	MH10002
KCl	Sigma	P5405
Low profile leica blades	Leica	819
MABT (1x)	made in lab	N/A	0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5
Maleic acid	Sigma	M0375
Methanol	J&K Scientific	116481
Methylene blue	Macklin	M859248
MgSO4	Sigma	M2643
NaCl	Sigma	S5886
NTMT	made in lab	N/A	0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20
OCT medium	Tissue-Tek	4583
PAP pen	Enzo Life Sciences	ADI-950-233
Paraformaldehyde, 4%	Abbexa	abx082483	made in lab in 1x PBS
PBST (1x)	made in lab	N/A	1x PBS plus 0.1% Tween-20
Phenylthiourea	Merck	103-85-5
Phosphate-buffered saline (10x)	Invitrogen	AM9624
preHYB	made in lab	N/A	50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20
Proteinase K	Roche	1092766
Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt	Sigma	R3629
RNase-free 1.5 mL tubes	Ambion	AM12400
SSC (20x)	Invitrogen	AM9770
SSCT (0.2x)	made in lab	N/A	0.2x SSC plus 0.1% Tween-20
SSCT (1x)	made in lab	N/A	1x SSC plus 0.1% Tween-20
Sucrose	Invitrogen	15503022
Triton X-100	Sigma	T9284
Tween-20	Sigma	P1379
Zebrafish	Laboratory Animal Center of Nantong University	N/A