In situ Hybridisierung kombiniert mit Immunhistochemie in kryogeschnittenen Zebrafischembryonen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt, wie Bilder durch die Kombination von In-situ-Hybridisierung und Immunhistochemie von Zebrafisch-Embryonalschnitten erhalten werden können. Vor der Kryosektion wurde eine In-situ-Hybridisierung durchgeführt, gefolgt von einer Antikörperfärbung. Es ist nützlich, die Expressionsmuster zweier Gene im Zebrafisch nachzuweisen, wenn ein Mangel an Antikörpern vorliegt.

Zusammenfassung

Als Wirbeltier ist der Zebrafisch in biologischen Studien weit verbreitet. Zebrafisch und Mensch teilen eine hohe genetische Homologie, die es ermöglicht, sie als Modell für menschliche Krankheiten zu verwenden. Die Genfunktionsstudie basiert auf der Detektion von Genexpressionsmustern. Obwohl die Immunhistochemie eine leistungsfähige Methode zur Bestimmung der Proteinexpression bietet, schränkt die begrenzte Anzahl kommerziell erhältlicher Antikörper im Zebrafisch die Anwendung der Cofärbung ein. Die In-situ-Hybridisierung wird häufig in Zebrafischembryonen eingesetzt, um die mRNA-Expression nachzuweisen. Dieses Protokoll beschreibt, wie man Bilder durch die Kombination von In-situ-Hybridisierung und Immunhistochemie für Zebrafisch-Embryonenschnitte erhält. Vor der Kryosektion wurde eine In-situ-Hybridisierung durchgeführt, gefolgt von einer Antikörperfärbung. Die Immunhistochemie und die Bildgebung eines einzelnen Kryoschnitts wurden nach in situ Hybridisierung durchgeführt. Das Protokoll ist hilfreich, um das Expressionsmuster zweier Gene zu entschlüsseln, zuerst durch In-situ-Transkriptdetektion und dann durch Immunhistochemie gegen ein Protein im selben Abschnitt.

Einleitung

Der Zebrafisch ist ein leistungsfähiges Wirbeltiermodell für Entwicklungs- und Genetikstudien ^1,2. Zebrafisch und Mensch haben eine hohe genetische Homologie (70 % der Gene werden mit dem menschlichen Genom geteilt), was die Verwendung als Modell für menschliche Krankheiten ermöglicht³. Im Zebrafisch ist es durchaus üblich, die Expressionsmuster zweier Gene und ihre räumliche Beziehung zu erkennen. Die Immunhistochemie wurde erstmals 1941 zum Nachweis von Krankheitserregern in infizierten Geweben durch Anwendung von FITC-markierten Antikörpern eingesetzt⁴. Das Zielprotein im Gewebeschnitt wird zunächst mit einem Primärantikörper markiert und der Schnitt wird dann mit einem Sekundärantikörper gegen die Wirtsspezies Immunglobulin des Primärantikörpers markiert. Die Antikörperfärbung ist ein robuster Ansatz zum Nachweis der Lokalisation von Proteinen, der eine hohe optische Auflösung auf intrazellulärer Ebene bietet. Allerdings ist die Anzahl der verfügbaren Antikörper im Zebrafisch sehr begrenzt. Eine aktuelle Studie zeigt, dass etwa 112.000 Antikörper für Mäuse kommerziell verfügbar sind. Allerdings haben sich nur sehr wenige Antikörper im Zebrafisch als zuverlässig erwiesen⁵.

Stattdessen wurde im Zebrafisch die In-situ-Hybridisierung häufig für die Analyse von Genexpressionsmustern eingesetzt. Diese Methode wurde erstmals in den 1980er Jahren zur Bestimmung der Genexpression in Drosophila-Embryonen verwendet^6,7, und seitdem wurde diese Technologie kontinuierlich weiterentwickelt und verbessert. Zunächst wurden radioaktiv markierte DNA-Sonden verwendet, um mRNA-Transkripte nachzuweisen; Die räumliche Auflösung war jedoch relativ gering, und es gab potenzielle Gesundheitsrisiken, die durch die Radioaktivität verursacht wurden. Anschließend stützt sich die In-situ-Hybridisierung auf die mit Digoxigenin (DIG) oder Fluorescein (Fluo) markierten RNA-Sonden, die mit alkalischer Phosphatase (AP) konjugiert oder durch fluoreszierende Tyramid-Signalamplifikation (TSA⁾ detektiert ^werden8,9. Obwohl TSA zum Nachweis von zwei oder drei Genen verwendet wurde, sind die DIG-Markierung von RNA-Sonden und antiDIG AP-konjugierten Antikörpern immer noch hochempfindliche, stabile und weit verbreitete Ansätze für die In-situ-Hybridisierung. Daher sind kommerzialisierte Antikörper in Kombination mit DIG-markierten in situ Sonden nützlich, um Einblicke in die Proteinlokalisierung und -expression eines Gens zu erhalten.

Whole-Mount-Embryonen können aufgrund der geringen optischen Auflösung die räumliche Beziehung zwischen den Genen nicht aufdecken, obwohl Zebrafischembryonen klein und durchsichtig sind¹⁰. Daher ist es notwendig, die Expressionsmuster von Genen auf intrazellulärer Ebene zu analysieren. Die Kryosektion ist bei Zebrafischen weit verbreitet, da sie einfach durchzuführen ist und das Antigen effektiv erhalten kann. Daher bietet die In-situ-Hybridisierung in Kombination mit Immunhistochemie in Zebrafisch-Kryoschnitten eine leistungsfähige Möglichkeit, die Expressionsmuster zweier Gene zu analysieren. Eine Kombination aus in situ Hybridisierung und Immunhistochemie wurde auf Zebrafische^{angewendet 11}. Die Proteinase-K-Behandlung wurde jedoch verwendet, um die Sondenpenetration auf Kosten der Antigenintegrität zu verbessern. Um diese Einschränkung zu überwinden, verwendet dieses Protokoll Erhitzung, um den Antigenabruf zu induzieren. Dieses Protokoll gilt nicht nur für Embryonen verschiedener Stadien und Gewebeabschnitte unterschiedlicher Dicke (14 μm Kopfabschnitte und 20 μm Rückenmarksabschnitte), sondern wurde auch anhand von Genen verifiziert, die in zwei Organen, einschließlich des Kopfes und des Rückenmarks, exprimiert werden.

In diesem Artikel wird beschrieben, wie In-situ-Hybridisierung und Antikörperfärbung in Zebrafischembryonen in Kryoschnitten kombiniert werden können. Die Vielseitigkeit dieses Protokolls wird durch die Verwendung einer Reihe von in situ Hybridisierungs- und Immunhistochemie-Kombinationen demonstriert, einschließlich in situ Hybridisierungssonden für zwei verschiedene Neuronen. Diese Methode eignet sich zum Nachweis von mRNA und Proteinen in verschiedenen Regionen und Embryonen unterschiedlichen Alters sowie der Expressionsmuster zweier Gene.

Protokoll

Alle Tierprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Universität Nantong genehmigt (Nr. S20191210-402).

1. Entnahme von Zebrafisch-Embryonen

1. In der Nacht vor der Entnahme der Eier ein Zebrafischpaar in Zuchtbecken aufstellen, einen transgenen Zebrafisch und einen AB-Wildtyp-Zebrafisch (Tg (foxP2:egfp-caax) X AB Wildtyp oder Tg (hb9:egfp) X AB Wildtyp) (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie eine diagonale Trennwand aus Kunststoff, um den Mann und die Frau zu trennen, um einen physischen Zugang auszuschließen. Setzen Sie am nächsten Tag den oberen Teil des Zuchtbeckens in einen sauberen unteren Teil ein, der mit frischem Wasser gefüllt ist, und entfernen Sie die Trennwand des Zuchtbeckens. Lassen Sie die Fische 10-20 Minuten lang paaren und sammeln Sie die Eier ein, nachdem sie auf den Boden des Zuchtbeckens gesunken sind.
2. Die Embryonen werden in E3-Embryonenmedium (siehe Materialtabelle) kultiviert, das Methylenblau (1 ml 0,05 % Methylenblau in 1 l E3-Embryonenmedium) bei 28,5 °C enthält.
3. Behandeln Sie die Embryonen 24 h nach der Befruchtung (hpf) mit Phenylthioharnstoff (PTU, siehe Materialtabelle), um die Bildung von Pigmenten zu verhindern.
   HINWEIS: Tiere beiderlei Geschlechts werden in Versuchen verwendet.

2. In-situ-Hybridisierung

Anmerkungen: Das für die Schritte 2.1-2.11 verwendete Wasser ist mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandeltes Wasser (siehe Materialtabelle).

1. Fixieren Sie ~10 Embryonen mit 0,5-1 ml frischem 4%igem Paraformaldehyd (PFA, siehe Materialtabelle) in einem 1,5-ml-Mikrofugenröhrchen bei 4 °C über Nacht für 12-14 h.
   ANMERKUNG: Das Protokoll für die In-situ-Hybridisierung wurde gegenüber der zuvor veröffentlichten Literatur^{leicht modifiziert 12}. PFA muss innerhalb einer Woche nach der Anwendung frisch zubereitet und bei 4 °C oder einen Monat bei -20 °C gelagert werden. Alle folgenden Schritte der In-situ-Hybridisierung wurden mit 1,5-ml-Mikrofugenröhrchen durchgeführt.
2. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Haut nur von Embryonen zu entfernen, die älter als 48 hpf sind.
   HINWEIS: Die Haut wird entfernt, um das Eindringen von RNA-Sonden in die Rumpfregion von Embryonen zu erleichtern, die älter als 48 hpf sind.
3. Die Embryonen werden nach und nach dehydriert, indem sie mit 25%, 50% und 75% Methanol in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 0,1% Tween-20 nacheinander (PBST, siehe Materialtabelle) für jeweils 5 min bei Raumtemperatur gewaschen werden. Waschen Sie die Embryonen dann 5 Minuten lang in 100% Methanol bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie die Embryonen in 100%igem Methanol bei -20 °C für mindestens 12-14 h über Nacht.
   HINWEIS: Dehydrierte Embryonen können 6 Monate lang in 100% Methanol bei -20 °C gelagert werden.
4. Rehydrieren Sie die Embryonen nach und nach, indem Sie sie nacheinander 5 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 75 %, 50 % und 25 % Methanol in PBST waschen. Waschen Sie den Embryo dreimal mit PBST für jeweils 5 Minuten bei Raumtemperatur.
5. Verdauen Sie die Embryonen mit 10 μg/ml Proteinase K (siehe Materialtabelle) in PBST bei Raumtemperatur (siehe Tabelle 1).
6. Waschen Sie die Embryonen 5 Minuten lang mit PBST. Führen Sie diesen Waschschritt dreimal durch.
7. Fixieren Sie die gewaschenen Embryonen in 4% PFA für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
   HINWEIS: Dieser Schritt stoppt die Verdauung, da PFA die Proteinase K inaktiviert. Stellen Sie sicher, dass die Probe vorsichtig gemischt wird, um alle Embryonen PFA auszusetzen. Die Röhrchen können auf die Seite gelegt werden, um die Embryonen gleichmäßig in der Lösung zu verteilen. Diese PFA muss nicht frisch sein (sie kann bis zu 2 Wochen gekühlt werden).
8. Waschen Sie den Embryo dreimal mit PBST und inkubieren Sie ihn bei jeder Wäsche 5 Minuten lang.
9. Führen Sie eine Vorhybridisierung der Embryonen durch, indem Sie sie mit einer Prähybridisierungslösung (preHYB, siehe Materialtabelle) bei 65 °C für 5 min inkubieren. Ersetzen Sie preHYB durch eine Hybridisierungslösung (HYB, siehe Materialtabelle) und prähybridisieren Sie für mindestens 4 h in HYB.
   Anmerkungen: Bevor Sie mit der Vorhybridisierung fortfahren, heizen Sie die Lösungen auf 65 °C vor. Formamid (siehe Materialtabelle) wird verwendet, um die Form und Struktur des Gewebes zu erhalten. Formamid verhindert auch die Bindung von nicht-homologen Fragmenten bei niedrigen Temperaturen.
10. Erhitzen Sie die Sonde (Insm1a oder 5-HT2C) 5 Minuten lang in HYB bei 95 °C, bevor Sie sie zu den Embryonen hinzufügen. Verwenden Sie die Sonde bei 1 μg/ml HYB. Entfernen Sie so viel preHYB wie möglich, ohne dass die Embryonen mit der Luft in Berührung kommen, und geben Sie die vorgewärmte Sonde in HYB in das Röhrchen mit den Embryonen.
    HINWEIS: Eine markierte RNA-Sonde kann verwendet werden, um mit einer mRNA-Zielsequenz in den Embryonen zu hybridisieren. Daher kann die Sonde verwendet werden, um die Expression eines Gens von Interesse und die Position der mRNA zu bestimmen.
11. Lassen Sie die Sonde über Nacht (12-14 h) bei 50-70 °C hybridisieren.
    Anmerkungen: Die Hybridisierungstemperatur ist für verschiedene Sonden unterschiedlich.
12. Am nächsten Tag wird die Sondenlösung mit einer Pipette abgesaugt und in einem Röhrchen bei -20 °C aufbewahrt, damit sie viele Male wiederverwendet werden kann.
13. Waschen Sie die Embryonen wie folgt:
    1. Waschen Sie die Embryonen 15 Minuten lang mit 100% HYB bei 65 °C.
    2. Waschen Sie die Embryonen nacheinander mit 75%, 50% und 25% HYB in 2x Standard-Kochsalzcitrat mit 0,1% Tween-20 (SSCT, siehe Materialtabelle) für jeweils 15 min bei 65 °C.
    3. Waschen Sie die Embryonen für 15 min in 2x SSCT bei 65 °C.
    4. Waschen Sie die Embryonen 15 min lang in 0,2x SSCT bei 65 °C.
14. Waschen Sie die Embryonen zweimal für 10 Minuten in Maleinsäurepuffer mit 0,02 % Tween-20 (MABT, siehe Materialtabelle) bei Raumtemperatur.
15. Blockieren Sie die hybridisierten und gewaschenen Embryonen für mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur mit 2%iger Blocklösung-1 (siehe Materialtabelle).
16. Ersetzen Sie die Blockierlösung-1 durch Antidigoxigenin AP (Verdünnung 1:4.000, siehe Materialtabelle) in einer frischen 2%igen Blocklösung-1 und schütteln Sie sie über Nacht 12-14 h bei 4 °C.
17. Waschen Sie die Embryonen viermal für 30 Minuten in MABT bei Raumtemperatur.
    Anmerkungen: Nehmen Sie den BM purple (siehe Materialtabelle) während des dritten Waschgangs aus dem Kühlschrank und schütteln Sie ihn gelegentlich während der folgenden Wäschen.
18. Waschen Sie die Embryonen zweimal für 10 Minuten in NTMT (0,1 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 1% Tween-20, siehe Materialtabelle).
19. Verwenden Sie eine Pipette, um so viel NTMT wie möglich aus den Embryonen zu entfernen. Ersetzen Sie die Embryonen durch das violette AP-Substrat von BM und färben Sie die Embryonen bei Raumtemperatur im Dunkeln. Überwachen Sie die Farbwechsel alle 30 Minuten, um den Färbegrad zu kontrollieren.
    Anmerkungen: Die spezifische Färbezeit ist unterschiedlich und muss je nach Sonde angepasst werden. Die Inkubation der Embryonen bei 37 °C kann die Reaktion beschleunigen. Die Inkubation der Embryonen bei 4 °C kann die Reaktionszeit verlängern und kann über Nacht erfolgen.
20. Sobald es sich im gewünschten Ausmaß entwickelt hat, stoppen Sie die Reaktion, indem Sie es zweimal kurz mit NTMT spülen. Nach der In-situ-Hybridisierung werden die Embryonen 20 Minuten lang dreimal mit PBST gespült.

3. Einbetten

1. Tauchen Sie die Embryonen in 5%ige Saccharose in 1x PBS (siehe Materialtabelle) über Nacht für 12-14 h bei 4 °C.
2. Wechseln Sie die Lösung, die die Embryonen bedeckt, in 1x PBS auf 15%ige Saccharose und inkubieren Sie sie über Nacht für 12-16 h bei 4 °C.
3. Wechseln Sie die Lösung, die die Embryonen bedeckt, in 1x PBS auf 30%ige Saccharose und inkubieren Sie sie 1-2 Tage bei 4 °C.
   HINWEIS: Inkubieren Sie in dieser Lösung, bis die Embryonen auf den Boden des Röhrchens sinken.
4. Füllen Sie einen Kryomold mit einem Medium für die optimale Schneidtemperatur (OCT) (siehe Materialtabelle). Übertragen Sie die Embryonen in 30%iger Saccharose mit OCT-Medium in das Kryomold. Rühren Sie sie um, um die Saccharose aus den Embryonen zu entfernen.
5. Übertragen Sie die Embryonen in ein neues Kryomold für Gewebe und füllen Sie es vorsichtig mit OCT-Medium, um die Bildung von Blasen zu vermeiden.
6. Tauchen Sie jeden Embryo ein, schieben Sie ihn auf den Boden der Kryoform und platzieren Sie jeden Embryo in der gewünschten Ausrichtung (entweder dorsal-ventral oder lateral). Halten Sie die Embryonen in einer geraden Linie.
   HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, nur einen Embryo in jeden Kryomold zu setzen (siehe Materialtabelle).
7. Legen Sie die eingebetteten Embryonen in Kryoformen in ein Trockeneis-Ethanolbad.
8. Bei -80 °C mindestens über Nacht 12-14 h lagern.
   HINWEIS: Die Kryoformen können mindestens einen Monat lang bei -80 °C aufbewahrt werden.

4. Kryosektion

1. Stellen Sie die Kryoschnitte mit einem Kryostaten auf -20 °C ein.
2. Entfernen Sie den Probenblock aus dem Kryomast und legen Sie ihn in den Kryostaten. Legen Sie das OCT-Medium auf den Boden des gekühlten Futters und legen Sie den Block darauf.
3. Stellen Sie sicher, dass der Probenblock parallel zur Rasierklinge steht. Schneiden Sie überschüssiges OCT-Medium vorsichtig um die Probe herum ab.
4. Mit einem Kryostaten in 12-20 μm dicke Abschnitte schneiden. Übertragen Sie die Abschnitte schnell auf Glasobjektträger, so dass jeder Objektträger 3-4 Abschnitte hat. Lassen Sie die Proben Raumtemperatur erreichen und lagern Sie die Abschnitte in einem verschlossenen Objektträgerkasten bei -80 °C für die spätere Verwendung.

5. Immunfärbung

HINWEIS: Die GFP-Färbung wird an den Schnitten durchgeführt.

1. Waschen Sie die Objektträger, die die Abschnitte enthalten, 5 Minuten lang mit PBS.
2. Citratpuffer in der Mikrowelle zum Kochen bringen.
3. Legen Sie die Objektträger in den Puffer und erhitzen Sie sie weiter, um die Lösung etwa 20 Minuten lang nahe dem Sieden zu halten.
   HINWEIS: Dieser Schritt hilft bei der Antigengewinnung. Das Gewebe bleibt auch bei hohen Temperaturen intakt, was die Färbequalität verbessert, indem es Faltungen, Beschädigungen oder Ablösungen des Gewebes verhindert.
4. Lassen Sie die Proben langsam auf Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie mit dem nächsten Schritt beginnen. Lassen Sie die überschüssige Lösung abtropfen, trocknen Sie den Bereich um jeden Abschnitt vorsichtig mit einem Stück Taschentuch ab und zeichnen Sie mit einem wasserabweisenden Stift (siehe Materialtabelle) einen Kreis um den Abschnitt, um eine hydrophobe Barriere zu bilden. Achten Sie darauf, die Gewebeabschnitte nicht auszutrocknen.
5. Waschen Sie die Objektträger zweimal mit PBS und inkubieren Sie sie bei jedem Waschgang 10 Minuten lang.
6. 2 h in Blocklösung-2 (siehe Materialtabelle) bei Raumtemperatur blockieren.
7. Pipettieren Sie die primäre Antikörperlösung (monoklonales α-GFP der Maus, 1:250, siehe Materialtabelle) pro Objektträger und inkubieren Sie die Objektträger in einer immunhistochemischen Nassbox bei 4 °C über Nacht.
8. Waschen Sie die Objektträger dreimal mit PBS und inkubieren Sie sie bei jedem Waschgang 10 Minuten lang.
9. Überschüssiges PBS ablassen. Inkubieren Sie die Objektträger mit dem entsprechenden Sekundärantikörper (1:400, siehe Materialtabelle) für 1 h bei Raumtemperatur in PBS.
10. Waschen Sie die Objektträger dreimal mit PBS und inkubieren Sie sie bei jedem Waschgang 10 Minuten lang.
11. Lassen Sie das überschüssige PBS ab, pipettieren Sie das Eindeckmedium auf den Objektträger und montieren Sie es mit einem Objektträger-Deckglas.

Ergebnisse

Mit diesem Protokoll kann das Expressionsmuster einer mRNA und eines Proteins gleichzeitig untersucht werden. Abbildung 1 zeigt den experimentellen Arbeitsablauf. Der 5-HT2C-Rezeptor ist ein Subtyp des 5-HT-Rezeptors, der an den Neurotransmitter Serotonin (5-Hydroxytryptamin, 5-HT) gebunden ist. Es ist im zentralen Nervensystem (ZNS) weit verbreitet und kann eine Vielzahl von Gehirnfunktionen wie Appetit, Stimmung, Angst und Fortpflanzungsverhalten erheblich regulieren¹³

Diskussion

Dieses Protokoll schlägt eine Kombination aus In-situ-Hybridisierung und Immunhistochemie vor, ein wichtiger Schritt in den Kolokalisationsexperimenten an Zebrafischembryonen. Diese Methode dient als einfache und effiziente Möglichkeit, gleichzeitig eine mRNA und ein Protein zu analysieren. In-situ-Hybridisierung und Antikörperfärbung wurden an Zebrafischembryonen durchgeführt. Im Gegensatz zu mehreren zuvor veröffentlichten Protokollen^14,15,16<...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 secondary antibody	Invitrogen	A21202
Anti-Digoxigenin AP Fab fragments	Roche	11093274910
Anti-GFP antibody	Millipore	MAB3580
Blocking reagent	Roche	11096176001
Blocking solution-1	made in lab	N/A	Dissolve the blocking reagent in 1X MAB to a final concentration of 10% (wt/vol). Autoclave and store at -20 °C before use.
Blocking solution-2	made in lab	N/A	0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS
BM purple	Roche	11442074001
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	B2064
CaCl2	Sigma	C5670
Citrate buffer	Leagene	IH0305
Citric acid	Sigma	C2404
Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm	Head Biotechnology	H4566
DEPC-Treated Water	Sangon Biotech	B501005
Digital camera, fluorescence microscope	Nikon	NI-SSR 931479
E3 embryo medium	made in lab	N/A	5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4
Formamide	Invitrogen	AM9342
Goat serum	Sigma	G9023
Heparin sodium salt	J&K Scientific	542858
HYB	made in lab	N/A	preHYB plus 50 µg/mL heparin sodium salt, 100 µg/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt
Immunohistochemical wet box	Mkbio	MH10002
KCl	Sigma	P5405
Low profile leica blades	Leica	819
MABT (1x)	made in lab	N/A	0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5
Maleic acid	Sigma	M0375
Methanol	J&K Scientific	116481
Methylene blue	Macklin	M859248
MgSO4	Sigma	M2643
NaCl	Sigma	S5886
NTMT	made in lab	N/A	0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20
OCT medium	Tissue-Tek	4583
PAP pen	Enzo Life Sciences	ADI-950-233
Paraformaldehyde, 4%	Abbexa	abx082483	made in lab in 1x PBS
PBST (1x)	made in lab	N/A	1x PBS plus 0.1% Tween-20
Phenylthiourea	Merck	103-85-5
Phosphate-buffered saline (10x)	Invitrogen	AM9624
preHYB	made in lab	N/A	50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20
Proteinase K	Roche	1092766
Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt	Sigma	R3629
RNase-free 1.5 mL tubes	Ambion	AM12400
SSC (20x)	Invitrogen	AM9770
SSCT (0.2x)	made in lab	N/A	0.2x SSC plus 0.1% Tween-20
SSCT (1x)	made in lab	N/A	1x SSC plus 0.1% Tween-20
Sucrose	Invitrogen	15503022
Triton X-100	Sigma	T9284
Tween-20	Sigma	P1379
Zebrafish	Laboratory Animal Center of Nantong University	N/A