血液透析通路相关手功能障碍的小鼠模型

摘要

该协议详细介绍了鼠髂总动脉静脉瘘形成的手术步骤。我们开发了这个模型来研究血液透析通路相关的肢体病理生理学。

摘要

慢性肾脏病是一个主要的公共卫生问题，需要血液透析等慢性肾脏替代疗法的终末期肾病（ESRD）的患病率持续增加。自体动静脉瘘 （AVF） 放置仍然是 ESRD 患者的主要血管通路选择。不幸的是，大约一半的血液透析患者会出现透析通路相关的手功能障碍（ARHD），从轻微的感觉异常到手指坏疽。值得注意的是，导致ARHD的潜在生物学驱动因素知之甚少，并且没有适当的动物模型来阐明其机制和/或开发预防/治疗ARHD的新疗法。在本文中，我们描述了一种新的小鼠模型，其中在左髂总动脉和静脉之间产生AVF，从而有助于评估肢体病理生理学。显微手术包括血管隔离、纵向静脉切开术、动静脉吻合术和静脉重建。假手术包括除AVF创建之外的所有关键步骤。髂骨 AVF 放置会导致中枢血流动力学、外周缺血和后肢神经运动性能受损的临床相关改变。这种新颖的临床前AVF模型提供了一个有用的平台，可以概括血液透析患者报告的常见神经运动扰动，使研究人员能够研究ARHD病理生理学的机制并测试潜在的治疗方法。

引言

建立和保存功能性血管通路仍然是通过血液透析接受肾脏替代治疗的终末期肾病（ESRD）患者的重要主要^目标1。重复的血液透析治疗对于清除废物、使电解质正常化并在肾功能不足时维持体液平衡是必要的，因此对于长期生存是必要的²。因此，血管通路是 ESRD 患者的"生命线"，自体动静脉瘘 （AVF） 放置仍然是该队列³ 的首选透析通路。然而，大约30%-60%的血液透析患者会出现一系列手部残疾，临床定义为通路相关性手部功能障碍（ARHD）。ARHD 的症状可以从虚弱和不协调到单瘫和手指坏疽，这些症状可能在 AVF 产生后早期发生，也可能随着瘘管成熟而逐渐发展。此外，AHD使ESRD治疗方案复杂化，这与生活质量差，心血管疾病高风险和死亡率增加有关²，^3，4。

已经开发了几种动物模型来研究AVF产生后血流动力学改变引起的血管重塑⁵，⁶，⁷，⁸，⁹，^10，11，^12，13，^14，15。具有髂动脉或股动脉AVF¹⁶，^17，18，¹⁹，20的大型动物模型和使用颈动脉 - 颈静脉吻合术或肾下主动脉 - 下腔静脉瘘形成的啮齿动物模型已经建立^，以检查AVF成熟和通畅的上述方面²¹.例如，静脉高压、管腔直径增大和静脉壁厚度增加是 AVF 成功成熟的标志，而中枢大量纤维化和内膜增生或血栓形成且血流无变化通常是 AVF 衰竭的特征^6，15。然而，大型动物模型缺乏小鼠模型的实验灵活性或转基因能力，而目前的啮齿动物模型由于解剖位置和/或缺乏相关的肢体病理学，不容易促进ARHD的研究。事实上，由于缺乏一个既定的临床前动物模型来概括相关的临床表型，尽管有症状的ARDH患者数量逐渐增加，但阐明病理生物学机制和开发新治疗策略的研究进展仍然停滞不前。因此，本研究的主要目的是引入一种独特的AHD小鼠模型，提供AVF显微外科手术的程序步骤和AVF相关病理生理学的表征。

研究方案

所有程序均由佛罗里达大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）和Malcom Randall退伍军人事务医疗中心批准。

注意:从杰克逊实验室购买年轻成年（8-10周龄）雄性C57BL / 6J小鼠，并饲养在光线（12小时光照:12小时黑暗循环），温度（22°C±1°C）和湿度（50%±10%）受控动物设施中。允许五只小鼠在每个笼子（宽:18厘米x 长:29厘米x 高:12.5厘米）中停留，并 随意提供筑巢材料，食物和水。在用标准食物适应栖息地7天后，将小鼠改为酪蛋白食物饮食7天作为饮食过渡阶段。此后，如前所述^{22，23，24，在}AVF手术之前，将小鼠喂食含有0.2%-0.15%腺嘌呤补充剂的酪蛋白食物2-3周以诱导肾功能障碍（CKD）。对照小鼠接受基于酪蛋白的饮食而不补充腺嘌呤（对照）。对照和CKD饮食在整个术后恢复期（POD）保持不变。

1. 术前测量

1. 如前所述，使用双功超声成像和激光多普勒后肢灌注评估基线/术前结局测量、主髂血管直径和血流动力学流量参数²⁵。
2. 如前所述，确定单侧后肢握力和跑步机步态评估^，以建立基线后肢^功能。
3. 通过 FITC-菊粉清除率和/或血清尿素氮 （BUN） 水平测量肾小球滤过率 （GFR） 来评估肾功能，如前所述²²，^24，27。

2. 手术准备

1. 准备以下手术工具和用品（材料表）:热珠消毒器，眼睛润滑剂，笔修剪器，酒精制剂，洗必泰湿巾，超细格雷夫钳，灭菌的0.9%盐水，29 G和31 G针头注射器，2 x 2无纺布海绵，中型单端圆形（SC-9）和小型双头硬，锋利，尖头（SC-4）棉签，低温烧灼， 直杜蒙钳、45° 角杜蒙镊子、直瓦纳斯弹簧剪刀、弯曲万纳弹簧剪刀、圆柄针架、多种尺寸的缝合线（4-0 丝、5-0 PGA、6-0 丝和 10-0 尼龙缝合线）、肝素、可吸收明胶海绵、直针架和丁丙诺啡。
   注意:腹部和腿部的肢体固定橡皮筋和牵开器是手工制作的。
2. 使用高压灭菌器在120-125°C下蒸汽灭菌30分钟，然后在手术前干燥30分钟。利用70%乙醇清洁，然后在每次动物手术之间进行热珠灭菌（240-270°C3分钟）。
3. 使用 29-31 G 针头注射器制备灭菌的 0.9% 生理盐水、肝素化盐水 （100 IU/mL） 和丁丙诺啡 （0.01 mg/mL）。

3.麻醉和定位

1. 在诱导室（0.8mL / min，2.5%异氟醚）中启动小鼠麻醉。一旦小鼠充分麻醉，将小鼠仰卧在由无菌窗帘覆盖的手术台上。在剃须和定位步骤中将异氟醚浓度降低至~1.2%。
2. 在手术过程中涂抹眼部润滑剂以保护眼睛免受干燥。
3. 使用笔式修剪器，剃掉手术用的腹毛和术后灌注测量的腿毛。清除手术区域的毛发。
4. 用橡皮筋和大头钉固定上肢和下肢，通过监测脚趾捏反射检查麻醉深度，并根据需要滴定麻醉。在整个外科手术过程中，每3-5分钟进行一次呼吸模式评估，以校准麻醉水平。

4. 手术靶区探索

1. 清洁剃光的皮肤区域几次，在酒精准备和洗必泰湿巾之间以圆形模式交替进行消毒手术区域。
2. 从胸骨边缘下缘到耻骨联合进行中线剖腹手术。解剖耻骨脂肪垫以获得更广阔的手术区域。
3. 打开腹腔切开术，用牵开器进入腹膜内容物，并使用中等单端圆形棉签掏空小肠和大肠。用盐水浸泡的无纺布海绵覆盖肠道。
4. 一旦获得足够的腹膜后脉管系统暴露，用盐水浸泡的小无纺布海绵覆盖剩余的肠道、肾脏和输尿管。根据需要用中等单端圆形棉签轻轻挤压膀胱圆顶，以排空膨胀的膀胱。
5. 使用直 Dumont 镊子和小双头硬、锋利、尖头棉签，仔细解剖从主动脉分叉近端约 1 cm 处延伸至左髂分叉水平的血管周围筋膜和脂肪组织。
   注意:左髂动脉和静脉彼此粘附，同时集体隔离动静脉结构。这一步将提供足够的船只动员，以促进AVF的创建。
6. 如果遇到任何源自左髂总静脉或与左髂总静脉汇合的小静脉分支，请根据需要使用低温烧灼术进行结扎，联合或不联合 6-0 丝线。
7. 将倾斜的镊子尖端穿过左髂总血管束下方，并轻轻张开多次以从下面的腹膜后肌肉组织动员血管（图1A）。

5.形成髂总动静脉瘘吻合术

1. 在孤立的左髂总动静脉束周围放置两条 4-0 丝缝线，并将它们用作血管束的结扎（例如交叉夹）。用每条4-0的真丝领带打一个结，并按从近端到远端的顺序打结。
2. 确保丝带交叉夹放置得足够远，以隔离~2毫米的血管长度，并且缝合线结扎的顺序应用将沉淀左髂静脉充血。
3. 使用4-0丝缝合线作为手柄，顺时针旋转左髂动静脉血管束并微调位置以暂时定位动脉前方的静脉（图1B）。
4. 用直的Vannas弹簧剪刀进行纵向静脉切开术（~1毫米），并用0.9%盐水轻轻冲洗出静脉腔中的残留血液（图1C）。在此步骤中要小心，因为高压盐水冲洗会导致静脉破裂。
   注意:静脉冲洗后髂动脉中残留的红色区域为下一步提供了一个视觉窗口。
5. 将浸润的10-0尼龙缝合线穿过静脉的后壁。
   注意:这部分髂静脉应立即与髂动脉前壁相连，并且髂动脉壁自然粘附。缝合线应穿过两壁，并用一个结将缝合线绑住（图1D）。请注意，一旦针穿过双壁，就会出现少量出血，这些出血源于髂动脉中的停滞血液。如果在这一步中腔内出血持续，则丝线交叉夹可能太松，需要进一步收紧。
6. 抓住缝合线末端并将它们置于轻微的张力下，以将前壁从髂动脉后壁移位。使用弯曲的Vannas弹簧剪刀做一个~1.0 mm x 0.3 mm椭圆形切口，去除髂动脉和静脉的粘附壁。
   注意:一旦建立该公共通道，就会产生动静脉瘘。在此步骤中，由于髂后静脉/髂前动脉壁切口是通过静脉切开术进行的，因此可能会损伤静脉的侧壁。应注意避免这种并发症，因为这可以显着减小瘘管直径并导致血栓形成。
7. 用0.9%盐水和肝素化盐水（100 IU / mL）轻轻冲洗暴露动脉腔的残留血液²⁸ （图1E）。
8. 创建AVF后，使用两个或三个10-0尼龙缝合线以中断方式修复初始前壁静脉切开术（图1F）。
9. 将血管束恢复到其原始解剖方向，并在修复的静脉切开术附近放置一小块盐水浸泡的可吸收明胶海绵，以促进止血。
10. 从远端到近端依次松开 4-0 单结交叉夹结扎。密切监测静脉切开部位是否有过多出血，同时松开每条缝合线。
11. 如果修复不能充分止血，请重新应用交叉夹具，并在出血部位放置另一条10-0尼龙缝合线。如果确定止血，请拆下缝合线，然后取下可吸收的明胶海绵。
12. 用小的双头硬，锋利，尖锐的棉签轻轻擦拭血管束，进一步促进血流的恢复。使用进入髂静脉并与从后肢返回的深色静脉血混合的脉动性鲜红色含氧血液的可视化来确认手术的技术成功。
13. 将肝素化盐水 （0.2 IU/g）¹⁵ 注射到 IVC 中进行全身抗凝治疗，以改善 AVF 通畅性结局。
    注意:虽然此步骤发生在血管重建之后（与在血管交叉钳夹之前发生肝素化的人类类似物相反），但在手术的这个阶段进行时观察到术中出血减少和AVF通畅性改善。最好注射到被筋膜和/或脂肪覆盖的部位，以防止穿刺部位出血。
14. 注射肝素化盐水后重新检查手术部位是否有止血。如果没有出血问题，请以跑步方式关闭中线筋膜，然后用可吸收的5-0 PGA缝合线关闭皮肤切口。
15. 对于假手术，请遵循除 AVF 形成之外的所有关键步骤。在左髂动静脉束的近端应用一个 4-0 丝结扎的单结，并将夹紧时间与 AVF 手术相匹配（例如，~20 分钟，取决于显微外科医生的熟练程度）。

6. 术后护理和测量

1. 剖腹闭合术后，使用激光多普勒成像测量双侧胫骨前肌和腹爪的血液灌注。
   注意:单侧灌注缺陷将证实动脉血流的瘘管改道（"偷窃"）。
2. 皮下施用0.1mg / kg丁丙诺啡，并将小鼠放回预热的小鼠笼中，该笼子带有高可吸收的带巢的柔软床上用品。
3. 让小鼠在预热的小鼠笼中恢复，直到麻醉消失，当小鼠流动和互动（~2小时）时，这将很明显。在恢复期间，让小鼠轻松获得滋润、柔软的饮食。
4. 每12小时至48小时给予丁丙诺啡和/或皮下盐水补液，并在术后5天进行每日监测。对病情恶化或组织坏死过多的动物实施安乐死，分类为改良缺血评分≥2²⁹。
5. 使用连续多普勒超声评估评估术后瘘管通畅性;患有瘘管血栓形成的小鼠被排除在后续分析之外，除非实验的目的是表征AVF成熟失败。
6. 确定其他术后结局测量值，例如恢复期间的局部血流动力学、握力和步态表现。在处死期间收集瘘管和肌肉组织以评估实验结束时的组织形态学^25，27。

结果

暴露于腺嘌呤饮食的动物肾小球滤过率降低（对照:441.3±54.2μL/min，CKD:165.1±118.3μL/min，p<0.05），血清尿素 氮水平升高（对照:20.39±4.2μL/min与CKD:38.20±10.65μL/min，p<0.05）相比，证实了动静脉瘘手术前存在肾功能不全。

AVF 通畅性的验证
虽然术中视觉确认技术成功是瘘管通畅的初步识别，但它并不能完全保证整个研究期间的通畅或生理成熟。术后通畅...

讨论

产生AVF后，AHD血液透析患者的患病率继续增加^30，31。事实上，未解决的症状并发症⁴，32，33，如疼痛，虚弱，感觉异常和/或运动范围减少会对患者的健康产生负面影响4，³²，^33，34，35，³⁶

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.15% Adenine diet	ENVIGO	TD.130899	20% casein, 0.15% adenine, 0.9% P
0.2% Adenine diet	ENVIGO	TD.130900	20% casein, 0.2% adenine, 0.9% P
10-0 Nylon suture	AD surgical	XXS-N1005T4
29 G needle syringes	Exel International	14-841-32
31 G needle syringes	Advocate	U-100 insulin syringe
4-0 silk suture	AD surgical	S-S41813
45-degree angled dumont forceps	Fine Science Tools	11253-25
5-0 PGA suture	AD surgical	PSGU-518R13
6-0 silk suture	AD surgical	S-S618R13
Absorbable gelatin sponge	ETHICON	1975
Alcohol preps	Covidien	5110-cs4000	70% isopropyl alcohol
Buprenorphine	NA	NA	0.01 g/mL
C57BL6/J mice	Jaxon Laboratory
Casein diet	ENVIGO	TD.130898	20% casein, 0.9% P
Cotton swabs	CONSTIX	SC-9	Medium single-ended round cotton swab
Cotton swabs	CONSTIX	SC-4	Small double-ended hard, sharp, pointed cotton swab
Curity non-woven sponges (2x2)	Covidien	9022
Curved Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15001-08
Doppler ultrasound	VisualSonics	Vevo 2100
Extra fine graefe forceps	Fine Science Tools	11150-10	2 pairs
Eye lubricant	CLCMEDICA	Optixcare eye lube
Heparin (5000 U/mL)	National Drug Codes List	63739-953-25	100 IU/mL
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-50
Low-temperature cautery	Bovie	AA04
Pen trimmer	Wahl	5640-600
Powder-free surgical gloves	Ansell	7824PF
Round handled needle holders	Fine Science Tools	12076-12
Sterile towel drape	Dynarex	DY440-MI
Sterilized 0.9% saline	National Drug Codes List	46066-807-25
Straight dumont forceps	Fine Science Tools	11253-20
Straight needle holder	Fine Science Tools	FST 12001-13
Straight vannas spring scissors	Fine Science Tools	25001-08
TrizChLOR4	National Drug Codes List	17033-279-50