מודל מורין של המודיאליזה גישה לתפקוד לקוי של היד

Summary

פרוטוקול זה מפרט את השלבים הכירורגיים של יצירת פיסטולה עורקית איליאק משותפת. פיתחנו מודל זה כדי לחקור פתופיזיולוגיה של הגפיים הקשורות להמודיאליזה.

Abstract

מחלת כליות כרונית היא בעיה מרכזית בבריאות הציבור, והשכיחות של מחלת כליות סופנית (ESRD) הדורשת טיפולים כרוניים בתחליפי כליות כגון המודיאליזה ממשיכה לעלות. מיקום פיסטולה עורקית אוטוגנית (AVF) נותר אפשרות גישה וסקולרית עיקרית עבור חולי ESRD. למרבה הצער, כמחצית מחולי המודיאליזה חווים הפרעות בתפקוד היד הקשור לדיאליזה (ARHD), החל מנימול עדין ועד נמק דיגיטלי. יש לציין כי המניעים הביולוגיים הבסיסיים האחראים ל- ARHD אינם מובנים היטב, ולא קיים מודל מתאים של בעלי חיים כדי להבהיר את המנגנונים ו / או לפתח טיפולים חדשניים למניעה/טיפול ב- ARHD. במאמר זה נתאר מודל עכברי חדש שבו נוצר AVF בין העורק האיליאק המשותף השמאלי לווריד, ובכך מקל על הערכת הפתופיזיולוגיה של הגפיים. המיקרו-כירורגיה כוללת בידוד כלי דם, ורנוטומיה אורכית, יצירת אנסטומוזה עורקית ושחזור ורידי. ניתוחי דאם כוללים את כל השלבים הקריטיים למעט יצירת AVF. מיקום Iliac AVF גורם לשינויים רלוונטיים מבחינה קלינית בהמודינמיקה המרכזית, איסכמיה היקפית וליקויים בביצועים נוירומוטוריים בגפיים האחוריות. מודל AVF פרה-קליני חדשני זה מספק פלטפורמה שימושית המשחזרת הפרעות נוירומוטוריות נפוצות שדווחו על ידי חולי המודיאליזה, ומאפשר לחוקרים לחקור את המנגנונים של פתופיזיולוגיה של ARHD ולבחון טיפולים פוטנציאליים.

Introduction

הקמה ושימור של גישה תפקודית לכלי הדם נותרה מטרה עיקרית חשובה עבור חולי מחלת כליות סופנית (ESRD) המקבלים טיפול בתחליפי כליות באמצעות המודיאליזה¹. טיפולי המודיאליזה חוזרים ונשנים נחוצים כדי להסיר מוצרי פסולת, לנרמל אלקטרוליטים ולשמור על איזון נוזלים ברגע שתפקוד הכליות הופך ללקוי, ולכן הם נחוצים להישרדות לטווח ארוך². לכן, גישה וסקולרית מייצגת "חבל הצלה" עבור חולים עם ESRD, ומיקום פיסטולה עורקית אוטוגנית (AVF) נותר אפשרות גישה מועדפת לדיאליזה בקרב קבוצה^{זו 3}. עם זאת, כ-30%-60% מחולי המודיאליזה חווים ספקטרום של נכויות ידיים, המוגדרות קלינית כתפקוד לקוי של היד (ARHD). הסימפטומים של ARHD יכולים לנוע בין חולשה וחוסר תיאום למונופלגיה ונמק דיגיטלי, אשר יכול להתרחש מוקדם לאחר יצירת AVF או להתפתח בהדרגה עם התבגרות פיסטולה. יתר על כן, ARHD מסבך את לוח הזמנים לטיפול ESRD, אשר קשורה לאיכות חיים ירודה, סיכון גבוה למחלות לב וכלי דם, ותמותה מוגברת ^2,3,4.

מספר מודלים של בעלי חיים פותחו כדי לחקור עיצוב מחדש של כלי דם הנגרמים על ידי שינויים המודינמיים לאחר יצירת AVF 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. מודלים גדולים של בעלי חיים עם AVF 16,17,18,19,20 ומודלים של מכרסמים המשתמשים באנסטומוזה של עורק התרדמה-עורק הצוואר או בהיווצרות פיסטולה אינפרא-כלייתית של אבי העורקים הנבוב התחתון מבוססים היטב כדי לבחון את ההיבטים הנ"ל של התבגרות AVF ופטנטיות ²¹ . לדוגמה, יתר לחץ דם ורידי, קוטר לומינלי גדול יותר ועובי דופן ורידי מוגבר הם סימנים להבשלה מוצלחת של AVF, בעוד שפיברוזיס משמעותי של המדיה והתפתחות היפרפלזיה אינטימית או פקקת ללא שינויים בזרימה מאפיינים לעתים קרובות כשלים של AVF ^6,15. עם זאת, מודלים של בעלי חיים גדולים חסרים את הגמישות הניסיונית או את היכולות המהונדסות של מודלים של מורין, בעוד שמודלים עכשוויים של מכרסמים אינם מאפשרים בקלות חקירה של ARHD בשל המיקום האנטומי ו / או היעדר פתולוגיה של הגפיים הקשורות. ואכן, בשל היעדר מודל מבוסס של בעלי חיים פרה-קליניים המשחזר את הפנוטיפ הקליני הרלוונטי, התקדמות המחקר להבהרת המנגנונים הפתוביולוגיים ופיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות נותרה קפואה, למרות עלייה הדרגתית במספר חולי ARHD סימפטומטיים. לכן, המטרה העיקרית של מחקר זה היא להציג מודל עכבר ייחודי של ARHD, מתן צעדים פרוצדורליים של מיקרו-כירורגיה AVF ואפיון של פתופיזיולוגיה הקשורה ל- AVF.

Protocol

כל ההליכים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת פלורידה והמרכז הרפואי לענייני חיילים משוחררים מלקום רנדל.

הערה: עכברי C57BL/6J זכרים בוגרים צעירים (בני 8-10 שבועות) נרכשו ממעבדת ג'קסון ושוכנו באור (12 שעות אור: 12 שעות מחזור כהה), טמפרטורה (22 ° C ± 1 ° C) ולחות (50% ± 10%) מתקן בעלי חיים נשלט. חמישה עכברים הורשו לשהות בכל כלוב (W:18 cm x L:29 cm x H:12.5 cm) עם חומרי קינון, מזון ומים זמינים עד לליביטום. לאחר 7 ימים של התאקלמות בית גידול עם צ'או סטנדרטי, העכברים שונו לתזונת צ'או מבוססת קזאין למשך 7 ימים כשלב מעבר לתזונה. לאחר מכן, עכברים קיבלו צ'או מבוסס קזאין עם תוספת אדנין של 0.2%-0.15% במשך 2-3 שבועות כדי לגרום לתפקוד כלייתי לקוי (CKD) לפני ניתוח AVF כפי שתואר קודם לכן^22,23,24. עכברי ביקורת קיבלו דיאטת צ'או מבוססת קזאין ללא תוספת אדנין (ביקורת). דיאטות הבקרה וה- CKD נשמרו לאורך כל תקופת ההחלמה שלאחר הניתוח (POD).

1. מדידות טרום ניתוחיות

1. להעריך מדידות תוצאה בסיסיות/טרום ניתוחיות, קוטר כלי דם אבי העורקים ופרמטרי זרימה המודינמיים באמצעות הדמיית אולטרסאונד דופלקס וזילוח הגפיים האחוריות באמצעות דופלר לייזר כמתואר לעיל²⁵.
2. קבע את חוזק אחיזת הגפיים האחוריות החד-צדדיות ואת הערכת ההליכה של ההליכון כדי לבסס את תפקוד הגפה האחורית הבסיסית כפי שתואר קודם לכן^25,26.
3. להעריך את תפקוד הכליות על ידי מדידת קצב סינון גלומרולרי (GFR) באמצעות פינוי FITC-אינולין ו / או רמת חנקן אוריאה בדם בסרום (BUN) כפי שתואר קודם לכן:^22,24,27.

2. הכנה כירורגית

1. הכינו את הכלים והציוד הכירורגיים הבאים (טבלת חומרים): מעקר חרוזים חם, חומר סיכה לעיניים, גוזם עטים, מכיני אלכוהול, מגבוני כלורהקסידין, מלקחיים Graefe דקים במיוחד, מלח 0.9% מעוקר, מזרקי מחט 29 גרם ו-31 גרם, 2 x 2 ספוגים לא ארוגים, עגולים בינוניים חד-צדדיים (SC-9) וצמר גפן קטן דו-צדדי קשה, חד, מחודד (SC-4), צמר גפן בטמפרטורה נמוכה, מלקחיים ישרים של Dumont, מלקחיים של Dumont בזווית 45°, מספריים קפיציים ישרים של Vannas, מספריים קפיציים מעוקלים של Vannas, מחזיקי מחטים עגולים עם ידית, תפרים בגדלים שונים (משי 4-0, 5-0 PGA, משי 6-0 ותפרי ניילון 10-0), הפרין, ספוג ג'לטין נספג, מחזיק מחט ישר ובופרנורפין.
   הערה: גומיות לקיבוע גפיים ומחזירים לבטן ולרגליים נעשו בעבודת יד.
2. יש לעקר את ההכנות הכירורגיות באמצעות אוטוקלאבה עם עיקור בקיטור בטמפרטורה של 120-125 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולאחר מכן לייבוש למשך 30 דקות לפני הניתוח. יש להשתמש בניקוי אתנול 70% ואחריו עיקור חרוזים חמים (240-270 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות) בין כל ניתוח לבעלי חיים.
3. הכינו מי מלח רגילים מעוקרים 0.9%, מלוחים הפרינים (100 IU/mL) ובופרנורפין (0.01 מ"ג/מ"ל) באמצעות מזרקי מחט 29-31 גרם.

3. הרדמה ומיקום

1. יש להתחיל הרדמה של עכבר בתא האינדוקציה (0.8 מ"ל/דקה, 2.5% איזופלורן). לאחר שהעכבר מורדם כראוי, הניחו את העכבר במצב שכיבה על תחנת הניתוח המכוסה על ידי רפש סטרילי. יש להוריד את ריכוז האיזופלורן ל~1.2% במהלך שלבי הגילוח והמיקום.
2. יש למרוח את חומר הסיכה העיני כדי להגן על העיניים מפני התייבשות במהלך הניתוח.
3. בעזרת גוזם עטים, מגלחים את שיער הבטן לצורך הניתוח ואת שיער הרגליים למדידות זילוח לאחר הניתוח. נקו את השיער משדה הניתוח.
4. יש לקבע את הגפיים העליונות והתחתונות בעזרת גומיות ונגיעות, לבדוק את עומק ההרדמה על ידי ניטור רפלקס צביטת הבוהן ולבצע הרדמה לפי הצורך. בצע את הערכת דפוס הנשימה כל 3-5 דקות לאורך ההליך הכירורגי כדי לכייל את רמת ההרדמה.

4. חקר אזור המטרה הניתוחית

1. נקו את אזור העור המגולח מספר פעמים, לסירוגין בין הכנת אלכוהול למגבוני כלורהקסידין בתבנית מעגלית לחיטוי שדה הניתוח.
2. בצע לפרטומיה בקו האמצע מהקצה התחתון של שולי עצם החזה לסימפיזת הערווה. נתחו את כרית השומן של הפאביס כדי לקבל שדה ניתוחי רחב יותר.
3. פתח את הצליוטומיה כדי לגשת לתוכן הצפק עם retractors ו outucerate המעי הדק והגס באמצעות צמר גפן עגול בינוני, חד צדדי. מכסים את המעיים בספוג לא ארוג ספוג במי מלח.
4. לאחר קבלת חשיפה מספקת של כלי הדם הרטרופריטוניאליים, כסו את המעי, הכליות והשופכנים הנותרים בספוגים קטנים ספוגי מלח לא ארוגים. יש לפנות שלפוחית שתן נפוחה על ידי סחיטה עדינה של כיפת השלפוחית בעזרת מקלוני צמר גפן עגולים בינוניים בעלי קצה אחד לפי הצורך.
5. נתחו בזהירות את הפאשיה הפריווסקולרית ואת רקמת השומן מכ-1 ס"מ פרוקסימלי לביפורקציה של אבי העורקים המשתרע עד לרמת הביפורקציה האיליאק השמאלית באמצעות מלקחיים ישרים של Dumont ומקלוני צמר גפן קטנים דו-צדדיים קשים, חדים ומחודדים.
   הערה: העורק האיליאק השמאלי והווריד נותרים דבוקים זה לזה תוך בידוד מבני העורקים בהמוניהם. צעד זה יספק גיוס כלי שיט מספיק כדי להקל על יצירת AVF.
6. אם נתקלים בענפים ורידיים קטנים שמקורם או מתמזגים עם וריד האיליאק המשותף השמאלי, יש לקשור אותם באמצעות צריבה בטמפרטורה נמוכה עם או בלי תפר משי 6-0 לפי הצורך.
7. העבירו את קצה המלקחיים הזוויתיים מתחת לצרור כלי הדם האיליאק המשותף השמאלי ופרשו בעדינות מספר פעמים כדי לגייס את כלי הדם מהשרירים הרטרופריטוניאליים שמתחתיו (איור 1A).

5. יצירת אנסטומוזה משותפת של פיסטולה עורקית איליאק

1. הניחו שני תפרי משי 4-0 סביב צרור העורקים האיליאק המשותף השמאלי המבודד והשתמשו בהם כליגטורות (למשל, מלחציים צולבים) לצרור כלי הדם. צור קשר יחיד עם כל עניבת משי 4-0 והחל אותם ברצף מפרוקסימלי לדיסטלי.
2. ודא כי מלחציים צולבים משי ממוקמים מספיק רחוק זה מזה כדי לבודד ~ 2 מ"מ של אורך כלי הדם, ואת היישום הרציף של ליגטורות התפר יהיה לזרז גודש ורידים iliac שמאל.
3. באמצעות מיתרי תפרי משי 4-0 כידיות, סובבו את צרור כלי הדם האיליאק השמאלי בכיוון השעון וכווננו את המיקום כדי למקם באופן זמני את הווריד הקדמי לעורק (איור 1B).
4. הכינו ארס אורכי (~1 מ"מ) עם מספריים קפיציים ישרים של Vannas ושטפו בעדינות שאריות דם מלומן ורידי עם 0.9% מלוחים (איור 1C). יש לנקוט משנה זהירות במהלך שלב זה, שכן סומק מי מלח בלחץ גבוה עלול לגרום להפרעה ורידית.
   הערה: האזור של צבע אדום שנשאר בעורק האיליאק לאחר שטיפה ורידית מספק חלון חזותי לשלב הבא.
5. מניחים תפר ניילון 10-0 דרך הדופן האחורית של הווריד.
   הערה: חלק זה של הווריד האיליאק צריך להיות בחיבור מיידי לקיר הקדמי של העורק האיליאק, והקירות דבוקים באופן טבעי. התפר צריך לעבור דרך שני הדפנות ולקשור את התפר בקשר יחיד (איור 1D). שימו לב שכמות קטנה של דימום, שמקורו בדם העומד בעורק האיליאק, תופיע ברגע שהמחט תעבור דרך שני הדפנות. אם הדימום התוך-לומינלי נמשך במהלך שלב זה, מלחציים צולבים של תפר המשי עשויים להיות רופפים מדי ויש צורך להדק אותם עוד יותר.
6. אחזו בקצוות התפר המאולתר והניחו אותם תחת מתח עדין כדי להזיז את הקיר הקדמי מהקיר האחורי של העורק האיליאק. בצע חתך אליפטי ~ 1.0 מ"מ x 0.3 מ"מ באמצעות מספריים קפיציים מעוקלים של Vannas, תוך הסרת הדפנות הדבוקות של העורק האיליאק והווריד.
   הערה: הפיסטולה העורקית נוצרת לאחר יצירת תעלה משותפת זו. בשלב זה ניתן לפגוע בדפנות הצידיות של הווריד כאשר החתך בדופן הווריד האיליאק האחורי/הקדמי מתבצע באמצעות חשיפה לוורידים. יש לנקוט משנה זהירות כדי למנוע סיבוך זה מכיוון שזה יכול להפחית באופן משמעותי את קוטר הפיסטולה ולהוביל להתפתחות פקקת.
7. שטפו בעדינות את שאריות הדם של לומן העורקים החשופים עם 0.9% מלוחים ומלוחים הפריניזציה (100 IU/mL)²⁸ (איור 1E).
8. לאחר יצירת ה-AVF, תקנו את הווריד הראשוני של הדופן הקדמית באמצעות שניים או שלושה תפרי ניילון 10-0 באופן קטוע (איור 1F).
9. החזירו את צרור כלי הדם לאוריינטציה האנטומית המקורית שלו והניחו חתיכה קטנה של ספוג ג'לטין נספג במי מלח בסמוך לוורונוטומיה המתוקנת כדי להקל על המוסטאזיס.
10. שחררו את ליגטורות המהדק הצולבות 4-0-0 ברצף מדיסטלי לפרוקסימלי. עקוב מקרוב אחר אתר הווריד לדימום יתר תוך התרופפות כל תפר.
11. אם התיקון אינו המוסטטי כראוי, להחיל מחדש את מלחציים צולבים ומניחים עוד תפר ניילון 10-0 באתר הדימום. אם המוסטאזיס מובטח, הסר את התפרים ולאחר מכן את ספוג הג'לטין נספג.
12. שפשפו בעדינות את צרור כלי הדם עם מקלוני צמר גפן קטנים קשיחים, חדים ומחודדים, אשר מקלים עוד יותר על שיקום זרימת הדם. לאשר הצלחה טכנית של הניתוח באמצעות הדמיה של דם מחומצן אדום פועם, אדום בוהק נכנס לווריד iliac וערבוב עם דם ורידי כהה חוזר מן הגפה האחורית.
13. הזריקו מי מלח הפריניזציה (0.2 IU/g)¹⁵ לתוך IVC עבור נוגדי קרישה מערכתיים לשיפור תוצאות הפטנט של AVF.
    הערה: למרות ששלב זה מתרחש לאחר שחזור כלי הדם (בניגוד לאנלוגיה האנושית שבה מתרחשת הפריניזציה לפני הידוק כלי הדם), נצפתה הפחתה בדימום תוך ניתוחי ושיפור בפטנט AVF כאשר בוצעו בשלב זה של ההליך. הזרקה לאתר מכוסה בפאשיה ו/או שומן עדיפה למניעת דימום ממקום הניקוב.
14. בדוק מחדש את האתר הכירורגי עבור hemostasis לאחר הזרקת מי מלח heparinized. אם אין חשש לדימום, סגרו את הפאשיה בקו האמצע ולאחר מכן את החתך בעור עם תפרים נספגים של 5-0 PGA בצורה רציפה.
15. עבור פעולות דמה, בצע את כל השלבים העיקריים של ההליך למעט היווצרות AVF. יש למרוח קשר יחיד של ליגטורת משי 4-0 בקצה הפרוקסימלי של צרור העורקים האיליאק השמאלי ולהתאים את זמני ההידוק לניתוחי AVF (למשל, ~20 דקות, תלוי במיומנות המיקרוכירורג).

6. טיפול ומדידה לאחר הניתוח

1. לאחר סגירת הלפרטומיה, יש למדוד את זילוח הדם של שרירי הטיביאליס הקדמיים הדו-צדדיים וכפות הגחון באמצעות הדמיית דופלר לייזר.
   הערה: גירעונות זילוח חד צדדיים יאשרו הסטת פיסטולה של זרימת העורקים ("גניבה").
2. יש לתת 0.1 מ"ג/ק"ג בופרנורפין תת עורית ולהחזיר את העכבר לכלוב עכבר שחומם מראש עם מצעים רכים בעלי כושר ספיגה גבוה עם קן.
3. אפשר לעכבר להתאושש בכלוב העכבר שחומם מראש עד שההרדמה פגה, מה שיהיה ברור כאשר העכבר אמבולטורי ואינטראקטיבי (~ 2 שעות). במהלך ההתאוששות, תן לעכבר גישה קלה לתזונה רכה ולחה.
4. מתן buprenorphine ו / או לחות מלוחים תת עורית כל 12 שעות עד 48 שעות ולבצע ניטור יומי במשך 5 ימים לאחר הניתוח. המתת חסד לבעלי חיים עם מצב מתדרדר או נמק רקמות מוגזם, המסווגים כציון איסכמיה שונה ≥2²⁹.
5. השתמש בהערכות אולטרסאונד דופלקס סדרתי כדי להעריך את הפטנט פיסטולה לאחר הניתוח; עכברים עם פקקת פיסטולה אינם נכללים בניתוחים הבאים, אלא אם מטרת הניסויים היא לאפיין כישלון הבשלה AVF.
6. קבע מדידות תוצאה אחרות לאחר הניתוח, כגון המודינמיקה מקומית, חוזק אחיזה וביצועי הליכה במהלך תקופת ההתאוששות. אספו פיסטולה ורקמות שריר כדי להעריך את ההיסטומורפולוגיה בסוף הניסוי במהלך ההקרבה^25,27.

תוצאות

בעלי חיים שנחשפו לדיאטת אדנין הפחיתו את שיעורי הסינון הגלומרולרי (בקרה: 441.3 ± 54.2 מיקרוליטר/דקה לעומת CKD: 165.1 ± 118.3 מיקרוליטר/דקה, p < 0.05) ורמות גבוהות יותר של חנקן אוריאה בדם בסרום (בקרה: 20.39 ± 4.2 מיקרוליטר/דקה לעומת CKD: 38.20 ± 10.65 מיקרוליטר/דקה, p < 0.05) בהשוואה לבעלי החיים שקיבלו צ'או מבוסס ק?...

Discussion

השכיחות של חולי המודיאליזה עם ARHD לאחר יצירת AVF המשיכה לעלות^30,31. ואכן, סיבוכים סימפטומטיים לא פתורים 4,32,33 כגון כאב, חולשה, נימול ו / או טווח תנועה מופחת יכולים להשפיע לרעה על רווחת המטופלים 4,32,33,34,35,36 ולאיים על יכולתם לקבל טיפול המודיאליזה חוזר באיכ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.15% Adenine diet	ENVIGO	TD.130899	20% casein, 0.15% adenine, 0.9% P
0.2% Adenine diet	ENVIGO	TD.130900	20% casein, 0.2% adenine, 0.9% P
10-0 Nylon suture	AD surgical	XXS-N1005T4
29 G needle syringes	Exel International	14-841-32
31 G needle syringes	Advocate	U-100 insulin syringe
4-0 silk suture	AD surgical	S-S41813
45-degree angled dumont forceps	Fine Science Tools	11253-25
5-0 PGA suture	AD surgical	PSGU-518R13
6-0 silk suture	AD surgical	S-S618R13
Absorbable gelatin sponge	ETHICON	1975
Alcohol preps	Covidien	5110-cs4000	70% isopropyl alcohol
Buprenorphine	NA	NA	0.01 g/mL
C57BL6/J mice	Jaxon Laboratory
Casein diet	ENVIGO	TD.130898	20% casein, 0.9% P
Cotton swabs	CONSTIX	SC-9	Medium single-ended round cotton swab
Cotton swabs	CONSTIX	SC-4	Small double-ended hard, sharp, pointed cotton swab
Curity non-woven sponges (2x2)	Covidien	9022
Curved Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15001-08
Doppler ultrasound	VisualSonics	Vevo 2100
Extra fine graefe forceps	Fine Science Tools	11150-10	2 pairs
Eye lubricant	CLCMEDICA	Optixcare eye lube
Heparin (5000 U/mL)	National Drug Codes List	63739-953-25	100 IU/mL
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-50
Low-temperature cautery	Bovie	AA04
Pen trimmer	Wahl	5640-600
Powder-free surgical gloves	Ansell	7824PF
Round handled needle holders	Fine Science Tools	12076-12
Sterile towel drape	Dynarex	DY440-MI
Sterilized 0.9% saline	National Drug Codes List	46066-807-25
Straight dumont forceps	Fine Science Tools	11253-20
Straight needle holder	Fine Science Tools	FST 12001-13
Straight vannas spring scissors	Fine Science Tools	25001-08
TrizChLOR4	National Drug Codes List	17033-279-50