血液透析アクセス関連手機能障害のマウスモデル

要約

このプロトコルは、マウスの総腸骨動静脈瘻作成の外科的ステップを詳述しています。我々は、血液透析アクセス関連の四肢の病態生理を研究するためにこのモデルを開発しました。

要約

慢性腎臓病は公衆衛生上の大きな問題であり、血液透析などの慢性腎代替療法を必要とする末期腎疾患(ESRD)の有病率は増加し続けています。自家動静脈瘻(AVF)の配置は、ESRD患者にとって依然として主要な血管アクセスオプションです。残念ながら、血液透析患者の約半数は、微妙な感覚異常からデジタル壊疽に至るまで、透析アクセス関連手機能障害(ARHD)を経験しています。特に、ARHDの原因となる根本的な生物学的要因は十分に理解されておらず、ARHDの予防/治療のためのメカニズムを解明したり、新しい治療法を開発したりするための適切な動物モデルは存在しません。ここでは、左総腸骨動脈と静脈の間にAVFを作成し、四肢の病態生理の評価を容易にする新しいマウスモデルについて説明します。顕微手術には、血管の隔離、縦方向の静脈切開、動静脈吻合の作成、および静脈再建が含まれます。偽の手術には、AVFの作成を除くすべての重要なステップが含まれます。腸骨AVF配置は、中枢血行動態、末梢虚血、および後肢神経運動能力の障害に臨床的に関連する変化をもたらします。.この新しい前臨床AVFモデルは、血液透析患者によって報告された一般的な神経運動摂動を再現する有用なプラットフォームを提供し、研究者がARHD病態生理学のメカニズムを調査し、潜在的な治療法をテストすることを可能にします。

概要

機能的な血管アクセスの確立と保存は、血液透析による腎代替療法を受けている末期腎疾患(ESRD)患者にとって依然として重要な主要な目標^です1。腎機能が不十分になった後、老廃物の除去、電解質の正常化、体液バランスの維持には血液透析治療の繰り返しが必要であり、長期生存に必要です²。したがって、血管アクセスはESRD患者の「ライフライン」であり、自家動静脈瘻(AVF)の配置は、このコ^ホート3の間で依然として好ましい透析アクセスオプションです。しかし、血液透析患者の約30%〜60%は、臨床的にアクセス関連手機能障害(ARHD)として定義される一連の手の障害を経験しています。ARHDの症状は、脱力感や協調障害から単麻痺や指神経疽までさまざまであり、AVFの作成後早期に発生するか、瘻孔の成熟とともに徐々に発症する可能性があります。さらに、ARHDはESRD治療スケジュールを複雑にし、生活の質の低下、心血管疾患のリスクの高さ、および死亡率の増加に関連しています^2,3,4。

AVF作成後の血行力学的変化によって誘発される血管リモデリングを研究するために、いくつかの動物モデルが開発されています⁵、⁶、⁷、⁸、⁹、^10、11、¹²、¹³、^14、15。腸骨または大腿骨AVF 16,17,18,19,20の大型動物モデル、および頸動脈頸静脈吻合または腎下大動脈-下大静脈瘻形成のいずれかを使用するげっ歯類モデルは、AVFの成熟と開存性の前述の側面を調べるために十分に確立されています²¹.たとえば、静脈高血圧、管腔径の増加、および静脈壁の厚さの増加は、AVF成熟の成功の兆候ですが、流れの変化のない中膜の実質的な線維症および内膜過形成または血栓の発達は、AVF障害を特徴付けることがよくあります^6,15。しかし、大型動物モデルはマウスモデルの実験的柔軟性またはトランスジェニック能力を欠いているが、現在のげっ歯類モデルは、解剖学的位置および/または関連する四肢病理の欠如のいずれかのためにARHDの調査を容易に促進しない。実際、関連する臨床表現型を再現する確立された前臨床動物モデルがないため、症候性ARHD患者の数が徐々に増加しているにもかかわらず、病態生物学的メカニズムを解明し、新しい治療戦略を開発するための研究の進歩は停滞したままです。したがって、この研究の主な目的は、ARHDのユニークなマウスモデルを導入し、AVF顕微手術の手順とAVF関連の病態生理学の特性評価を提供することです。

プロトコル

すべての手順は、フロリダ大学の施設動物管理および使用委員会(IACUC)およびマルコムランドール退役軍人医療センターによって承認されました。

注:若年成人(8〜10週齢)のオスC57BL / 6Jマウスは、ジャクソン研究所から購入し、光(12時間の光:12時間の暗サイクル)、温度(22°C±1°C)、および湿度(50%±10%)の制御された動物施設に収容しました。ケージ(幅:18 cm x 長さ:29 cm x 高さ:12.5 cm)ごとに5匹のマウスを住まわせ、巣作り材料、餌、水を自由に利用できるようにしました。標準的なチョウで7日間の生息地順応の後、マウスは食餌移行段階として7日間カゼインベースの飼料に変更されました。その後、マウスに、カゼインベースの固形飼料に0.2%〜0.15%のアデニン補給を2〜3週間与えて、前述のようにAVF手術の前に腎機能障害(CKD)を誘発した²²、^23、24。対照マウスは、アデニン補給なしでカゼインベースの飼料を受けた(対照)。対照食およびCKD食は、術後回復期間(POD)を通して維持された。

1.術前測定

1. ベースライン/術前の転帰測定値、大動脈腸血管の直径、および血行動態フローパラメータを評価します 前述のように、二重超音波画像とレーザードップラーを介した後肢灌流を使用します²⁵。
2. 片側後肢の握力とトレッドミルの歩行評価を決定して、前述のようにベースラインの後肢機能を確立します^25,26。
3. 前述のように、FITCイヌリンクリアランスおよび/または血清血中尿素窒素(BUN)レベルを介して糸球体濾過率(GFR)を測定することにより、腎機能を評価します22,24,27。

2.手術の準備

1. 次の手術器具と消耗品を準備します(材料表):ホットビーズ滅菌器、目の潤滑剤、ペントリマー、アルコール準備、クロルヘキシジンワイプ、極細グレーフェ鉗子、滅菌0.9%生理食塩水、29 Gおよび31 G針注射器、2 x 2不織布スポンジ、中型シングルエンドラウンド(SC-9)および小型ダブルエンドハード、シャープ、先のとがった(SC-4)綿棒、低温焼灼、 ストレートデュモン鉗子、45°角度デュモン鉗子、ストレートバンナスプリングはさみ、湾曲したバンナスプリングはさみ、丸ハンドルニードルホルダー、複数のサイズの縫合糸(4-0シルク、5-0PGA、6-0シルク、10-0ナイロン縫合糸)、ヘパリン、吸収性ゼラチンスポンジ、ストレートニードルホルダー、ブプレノルフィン。
   注:腹部と脚の四肢固定輪ゴムと開創器は手作りでした。
2. オートクレーブを使用して、120〜125°Cで30分間蒸気滅菌し、その後30分間乾燥させてから手術準備を滅菌します。70%エタノールクレンジングとそれに続く各動物手術の間にホットビーズ滅菌(240-270°Cで3分間)を利用します。
3. 29〜31 Gの針注射器を使用して、滅菌した0.9%生理食塩水、ヘパリン化生理食塩水(100 IU / mL)、およびブプレノルフィン(0.01 mg / mL)を準備します。.

3.麻酔とポジショニング

1. 誘導チャンバー(0.8 mL /分、2.5%イソフルラン)でマウス麻酔を開始します。マウスが適切に麻酔されたら、滅菌ドレープで覆われた手術ステーションの仰臥位にマウスを置きます。シェービングおよび位置決めステップ中にイソフルラン濃度を~1.2%までテーパリングします。
2. 手術中の乾燥から目を保護するために、眼の潤滑剤を塗布します。
3. ペントリマーを使用して、手術用の腹毛と術後の灌流測定用の脚毛を剃ります。手術野から髪を取り除きます。
4. 輪ゴムと鋲で上肢と下肢を固定し、つま先のつまみ反射を監視して麻酔の深さを確認し、必要に応じて麻酔を滴定します。麻酔レベルを調整するために、外科的処置を通して3〜5分ごとに呼吸パターン評価を実行します。

4. 手術対象領域の探索

1. 剃った皮膚領域を数回洗浄し、アルコール調製とクロルヘキシジンワイプを円形に交互に繰り返して、手術野を消毒します。
2. 胸骨縁の下端から恥骨結合まで正中線開腹術を行います。恥骨脂肪パッドを解剖して、より広い手術野を取得します。
3. 腹腔切開術を開き、開創器で腹膜の内容物にアクセスし、中程度のシングルエンドの丸い綿棒を使用して小腸と大腸を骨抜きにします。生理食塩水に浸した不織布スポンジで腸を覆います。
4. 後腹膜血管系の適切な露出が得られたら、残りの腸、腎臓、尿管を生理食塩水に浸した小さな不織布スポンジで覆います。必要に応じて、中程度のシングルエンドの丸い綿棒で膀胱ドームをそっと絞って、膨張した膀胱を排出します。
5. まっすぐなデュモン鉗子と小さな両端の硬くて鋭い先のとがった綿棒を使用して、左腸骨分岐部のレベルまで伸びる大動脈分岐部まで約1 cm近位の血管周囲筋膜と脂肪組織を注意深く解剖します。
   注:左腸骨動脈と静脈は、動静脈構造をまとめて隔離しながら、互いに接着したままになります。このステップは、AVFの作成を容易にするのに十分な船舶動員を提供します。
6. 左総腸骨静脈に由来する、または左総腸骨静脈と収束する小さな静脈枝に遭遇した場合は、必要に応じて6-0シルク縫合糸の有無にかかわらず低温焼灼を使用して結紮します。
7. 角度の付いた鉗子の先端を左の総腸骨血管束の下に通し、ゆっくりと複数回広げて、下にある後腹膜筋組織から血管を動員します(図1A)。

5.総腸骨動静脈瘻合の作成

1. 孤立した左総腸骨動静脈束の周りに2本の4-0シルク縫合糸を配置し、血管束への結紮糸(クロスクランプなど)として使用します。各4-0シルクタイで単一の結び目を作成し、近位から遠位まで順番に適用します。
2. シルクタイクロスクランプが血管長~2mmを分離するのに十分な距離に配置され、縫合糸結紮糸を順次適用すると左腸骨静脈充血が促進されることを確認してください。
3. 4-0絹縫合糸をハンドルとして使用し、左腸骨動静脈血管束を時計回りに回転させ、位置を微調整して静脈を動脈の前方に一時的に配置します(図1B)。
4. まっすぐなVannasスプリングハサミで縦方向の静脈切開(~1 mm)を行い、0.9%生理食塩水で静脈内腔から残留血液を穏やかに洗い流します(図1C)。高圧生理食塩水フラッシュは静脈破壊を引き起こす可能性があるため、このステップでは注意してください。
   注:静脈紅潮後に腸骨動脈に残る赤色の領域は、次のステップの視覚的なウィンドウを提供します。
5. 静脈の後壁に10-0ナイロン縫合糸を埋め込みます。
   注:腸骨静脈のこの部分は、腸骨動脈の前壁にすぐに配置されている必要があり、壁は自然に接着しています。縫合糸は両方の壁を通過し、縫合糸を単一の結び目で縛る必要があります(図1D)。腸骨動脈の停滞した血液に由来する少量の出血は、針が両方の壁を通過すると現れることに注意してください。このステップ中に管腔内出血が続く場合は、絹縫合クロスクランプが緩すぎる可能性があり、さらに締め付ける必要があります。
6. 埋入した縫合糸の端をつかみ、穏やかな張力下に置いて、腸骨動脈の後壁から前壁を移動させます。湾曲したバンナススプリングハサミを使用して~1.0 mm x 0.3 mmの楕円形の切開を行い、腸骨動脈と静脈の両方の接着壁を取り除きます。
   注:動静脈瘻は、この共通のチャネルが確立されると作成されます。静脈切開による後腸骨静脈/前腸骨動脈壁切開が行われるため、このステップ中に静脈の側壁を損傷する可能性があります。この合併症は瘻孔の直径を大幅に減少させ、血栓の発生につながる可能性があるため、注意が必要です。.
7. 露出した動脈内腔の残留血液を0.9%生理食塩水とヘパリン化生理食塩水(100 IU / mL)で穏やかに洗い流します²⁸ (図1E)。
8. AVFの作成後、中断された方法で2つまたは3つの10-0ナイロン縫合糸を使用して最初の前壁切開術を修復します(図1F)。
9. 血管束を元の解剖学的方向に復元し、生理食塩水に浸した吸収性ゼラチンスポンジの小片を修復された静脈切開術の隣に置き、止血を促進します。
10. 4-0シングルノットクロスクランプ結紮糸を遠位から近位まで順番に緩めます。各縫合糸を緩めながら、過度の出血がないか静脈切開部位を注意深く監視します。
11. 修復が適切に止血していない場合は、クロスクランプを再適用し、出血部位に別の10-0ナイロン縫合糸を配置します。止血が保証されている場合は、縫合糸を取り除き、次に吸収性ゼラチンスポンジを取り外します。
12. 血管束を小さな両端の硬くて鋭利な先のとがった綿棒でそっとこすり、血流の回復をさらに促進します。腸骨静脈に入り、後肢から戻ってくる暗色静脈血と混合する拍動性の真っ赤な酸素化血液を可視化し、手術の技術的成功を確認します。
13. ヘパリン化生理食塩水(0.2 IU / g)¹⁵ をIVCに注入して全身抗凝固を行い、AVF開存性の結果を改善します。.
    注:このステップは血管再建後に発生しますが(血管クロスクランプの前にヘパリン化が起こるヒトアナログとは対照的に)、手順のこの段階で実行すると、術中出血の減少とAVF開存性の改善が観察されました。筋膜および/または脂肪で覆われた部位への注射は、穿刺部位からの出血を防ぐために好ましい。
14. ヘパリン化生理食塩水の注射後の止血について手術部位を再検査する。出血の懸念がない場合は、正中線筋膜を閉じてから、吸収性の5-0PGA縫合糸で皮膚切開部をランニング方式で閉じます。
15. 偽の操作の場合は、AVF フォーメーションを除く手順のすべての重要な手順に従います。左腸骨動静脈束の近位端に4-0シルク結紮糸の単一の結び目を適用し、クランプ時間をAVF手術に合わせます(たとえば、マイクロ外科医の習熟度に応じて~20分)。

6.術後のケアと測定

1. 開腹閉鎖後、レーザードップラーイメージングを使用して両側脛骨筋の前筋と腹側足の血液灌流を測定します。
   注:片側灌流欠損は、動脈流の瘻孔転換(「盗む」)を確認します。
2. 0.1 mg / kgのブプレノルフィンを皮下投与し、マウスを巣のある吸収性の高い柔らかい寝具を備えた予熱したマウスケージに戻します。.
3. 麻酔が切れるまで、予熱したマウスケージでマウスを回復させますが、これはマウスが歩行可能でインタラクティブであるときに明らかになります(~2時間)。回復中は、マウスに保湿された柔らかい食事に簡単にアクセスできるようにします。
4. ブプレノルフィンおよび/または皮下生理食塩水和を12時間ごとに最大48時間投与し、術後5日間毎日モニタリングを実行します。.悪化状態または過度の組織壊死を有する動物を安楽死させ、修正虚血スコア≥2²⁹として分類する。
5. シリアルデュプレックス超音波評価を使用して、術後の瘻孔開存性を評価します。瘻孔血栓症のマウスは、実験の目的がAVF成熟障害を特徴付けることでない限り、その後の分析から除外されます。
6. 回復期間中の局所血行動態、握力、歩行パフォーマンスなどの他の術後転帰測定値を決定します。瘻孔および筋肉組織を収集して、犠牲中の実験終了時に組織形態を評価する^25,27。

結果

アデニン食に曝露された動物は、カゼインベースの固形飼料を投与された動物と比較して、糸球体濾過率が低下し(対照:441.3±54.2μL/分対CKD:165.1±118.3μL /分、p < 0.05)、血清血中尿素窒素レベルが上昇した(対照:20.39 ± 4.2 μL/分 対 CKD:38.20 ± 10.65 μL/min、p < 0.05)カゼインベースの固形物を投与された動物と比較して、動静脈瘻手術前の腎不全の存在が確認されました。

ディスカッション

AVF作成後のARHDの血液透析患者の有病率は増加し続けています^30,31。実際、痛み、脱力感、感覚異常、および/または可動域の減少などの未解決の症状性合併症4,32,33は、患者の健康に悪影響を及ぼし4、32、^33、34、^35、...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.15% Adenine diet	ENVIGO	TD.130899	20% casein, 0.15% adenine, 0.9% P
0.2% Adenine diet	ENVIGO	TD.130900	20% casein, 0.2% adenine, 0.9% P
10-0 Nylon suture	AD surgical	XXS-N1005T4
29 G needle syringes	Exel International	14-841-32
31 G needle syringes	Advocate	U-100 insulin syringe
4-0 silk suture	AD surgical	S-S41813
45-degree angled dumont forceps	Fine Science Tools	11253-25
5-0 PGA suture	AD surgical	PSGU-518R13
6-0 silk suture	AD surgical	S-S618R13
Absorbable gelatin sponge	ETHICON	1975
Alcohol preps	Covidien	5110-cs4000	70% isopropyl alcohol
Buprenorphine	NA	NA	0.01 g/mL
C57BL6/J mice	Jaxon Laboratory
Casein diet	ENVIGO	TD.130898	20% casein, 0.9% P
Cotton swabs	CONSTIX	SC-9	Medium single-ended round cotton swab
Cotton swabs	CONSTIX	SC-4	Small double-ended hard, sharp, pointed cotton swab
Curity non-woven sponges (2x2)	Covidien	9022
Curved Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15001-08
Doppler ultrasound	VisualSonics	Vevo 2100
Extra fine graefe forceps	Fine Science Tools	11150-10	2 pairs
Eye lubricant	CLCMEDICA	Optixcare eye lube
Heparin (5000 U/mL)	National Drug Codes List	63739-953-25	100 IU/mL
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-50
Low-temperature cautery	Bovie	AA04
Pen trimmer	Wahl	5640-600
Powder-free surgical gloves	Ansell	7824PF
Round handled needle holders	Fine Science Tools	12076-12
Sterile towel drape	Dynarex	DY440-MI
Sterilized 0.9% saline	National Drug Codes List	46066-807-25
Straight dumont forceps	Fine Science Tools	11253-20
Straight needle holder	Fine Science Tools	FST 12001-13
Straight vannas spring scissors	Fine Science Tools	25001-08
TrizChLOR4	National Drug Codes List	17033-279-50