Un modello murino di disfunzione della mano correlata all'accesso all'emodialisi

Riepilogo

Questo protocollo descrive in dettaglio le fasi chirurgiche della creazione della fistola artero-venosa iliaca comune murina. Abbiamo sviluppato questo modello per studiare la fisiopatologia degli arti correlata all'emodialisi.

Abstract

La malattia renale cronica è un grave problema di salute pubblica e la prevalenza della malattia renale allo stadio terminale (ESRD) che richiede terapie sostitutive renali croniche come l'emodialisi continua ad aumentare. Il posizionamento della fistola artero-venosa autogena (AVF) rimane un'opzione di accesso vascolare primaria per i pazienti con ESRD. Sfortunatamente, circa la metà dei pazienti in emodialisi sperimenta una disfunzione della mano correlata alla dialisi (ARHD), che va dalla parestesia sottile alla cancrena digitale. In particolare, i driver biologici sottostanti responsabili dell'ARHD sono poco conosciuti e non esiste un modello animale adeguato per chiarire i meccanismi e / o sviluppare nuove terapie per la prevenzione / trattamento dell'ARHD. Qui, descriviamo un nuovo modello murino in cui viene creato un AVF tra l'arteria iliaca comune sinistra e la vena, facilitando così la valutazione della fisiopatologia degli arti. La microchirurgia comprende l'isolamento dei vasi, la venotomia longitudinale, la creazione di anastomosi artero-venosa e la ricostruzione venosa. Gli interventi chirurgici fittizi includono tutti i passaggi critici ad eccezione della creazione di AVF. Il posizionamento dell'AVF iliaca determina alterazioni clinicamente rilevanti nell'emodinamica centrale, ischemia periferica e compromissione delle prestazioni neuromotorie degli arti posteriori. Questo nuovo modello preclinico di AVF fornisce un'utile piattaforma che ricapitola le comuni perturbazioni neuromotorie riportate dai pazienti in emodialisi, consentendo ai ricercatori di studiare i meccanismi della fisiopatologia ARHD e testare potenziali terapie.

Introduzione

La creazione e la conservazione dell'accesso vascolare funzionale rimangono un importante obiettivo primario per i pazienti con malattia renale allo stadio terminale (ESRD) che ricevono una terapia sostitutiva renale tramite emodialisi¹. Ripetuti trattamenti di emodialisi sono necessari per rimuovere i prodotti di scarto, normalizzare gli elettroliti e mantenere l'equilibrio dei liquidi una volta che la funzione renale diventa inadeguata, e quindi sono necessari per la sopravvivenza a lungo termine². Pertanto, l'accesso vascolare rappresenta un'ancora di salvezza per i pazienti con ESRD e il posizionamento della fistola artero-venosa autogena (AVF) rimane un'opzione di accesso alla dialisi preferita tra questa coorte³. Tuttavia, circa il 30% -60% dei pazienti in emodialisi sperimenta uno spettro di disabilità della mano, clinicamente definito come disfunzione della mano correlata all'accesso (ARHD). I sintomi dell'ARHD possono variare da debolezza e discoordinazione alla monoplegia e alla cancrena digitale, che possono verificarsi precocemente dopo la creazione di AVF o svilupparsi gradualmente con la maturazione della fistola. Inoltre, l'ARHD complica il programma di trattamento ESRD, che è associato a scarsa qualità della vita, alto rischio di malattie cardiovascolari e aumento della mortalità ^2,3,4.

Diversi modelli animali sono stati sviluppati per studiare il rimodellamento vascolare indotto da alterazioni emodinamiche dopo la creazione di AVF 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. I modelli animali di grandi dimensioni con AVF iliaca o femorale 16,17,18,19,20 e modelli di roditori che utilizzano anastomosi della vena carotide-giugulare o formazione di fistola infrarenale della vena cava inferiore dell'aorta sono ben consolidati per esaminare i suddetti aspetti della maturazione e della pervietà AVF ²¹ . Ad esempio, l'ipertensione venosa, il maggior diametro luminale e l'aumento dello spessore della parete venosa sono segni di successo della maturazione dell'AVF, mentre la fibrosi sostanziale della media e l'iperplasia intimale o lo sviluppo di trombi senza cambiamenti nel flusso spesso caratterizzano i fallimenti dell'AVF ^6,15. Tuttavia, i modelli animali di grandi dimensioni mancano della flessibilità sperimentale o delle capacità transgeniche dei modelli murini, mentre gli attuali modelli di roditori non facilitano prontamente lo studio dell'ARHD a causa della posizione anatomica e / o della mancanza di patologia degli arti associata. Infatti, a causa della mancanza di un modello animale preclinico stabilito che riassuma il fenotipo clinico rilevante, i progressi della ricerca per chiarire i meccanismi patobiologici e sviluppare nuove strategie terapeutiche sono rimasti stagnanti, nonostante un progressivo aumento del numero di pazienti con ARHD sintomatici. Pertanto, l'obiettivo principale di questo studio è quello di introdurre un modello murino unico di ARHD, fornendo fasi procedurali della microchirurgia AVF e caratterizzazione della fisiopatologia correlata all'AVF.

Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università della Florida e dal Malcom Randall Veterans Affairs Medical Center.

NOTA: I topi maschi C57BL / 6J giovani adulti (8-10 settimane) sono stati acquistati dal Jackson Laboratory e ospitati in una struttura per animali controllata con luce (12 ore di luce: ciclo di buio di 12 ore), temperatura (22 ° C ± 1 ° C) e umidità (50% ± 10%). Cinque topi sono stati autorizzati a dimorare per gabbia (L: 18 cm x L: 29 cm x A: 12,5 cm) con materiali di nidificazione, cibo e acqua resi disponibili ad libitum. Dopo 7 giorni di acclimatazione dell'habitat con chow standard, i topi sono stati cambiati in una dieta a base di caseina per 7 giorni come fase di transizione della dieta. Successivamente, i topi sono stati alimentati con il chow a base di caseina con un'integrazione di adenina allo 0,2% -0,15% per 2-3 settimane per indurre disfunzione renale (CKD) prima dell'intervento chirurgico AVF come precedentemente descritto^22,23,24. I topi di controllo hanno ricevuto una dieta a base di caseina senza supplementazione di adenina (controllo). Le diete di controllo e CKD sono state mantenute per tutto il periodo di recupero postoperatorio (POD).

1. Misurazioni preoperatorie

1. Valutare le misurazioni degli esiti basali / preoperatori, i diametri dei vasi aortoiliaci e i parametri di flusso emodinamico utilizzando l'ecografia duplex e la perfusione degli arti posteriori tramite laser Doppler come descritto in precedenza²⁵.
2. Determinare la forza unilaterale dell'aderenza degli arti posteriori e la valutazione dell'andatura del tapis roulant per stabilire la funzione basale degli arti posteriori come descritto in precedenza^25,26.
3. Valutare la funzionalità renale misurando la velocità di filtrazione glomerulare (GFR) tramite clearance dell'inulina FITC e/o il livello di azoto ureico nel sangue sierico (BUN) come descritto in precedenza^22,24,27.

2. Preparazione chirurgica

1. Preparare i seguenti strumenti chirurgici e forniture (tabella dei materiali): uno sterilizzatore a perline calde, un lubrificante per gli occhi, un tagliapenne, preparazioni di alcool, salviette alla clorexidina, pinze Graefe extrafini, soluzione salina sterilizzata allo 0,9%, siringhe ad aghi da 29 G e 31 G, 2 spugne non tessute, tondi medi a un estremità singola (SC-9) e piccoli tamponi di cotone duri, affilati, appuntiti (SC-4), cauterizzazione a bassa temperatura, pinza Dumont dritta, pinza Dumont angolata a 45°, forbici a molla Vannas dritte, forbici a molla Vannas curve, portaaghi con manico rotondo, suture multiple (seta 4-0, 5-0 PGA, seta 6-0 e suture in nylon 10-0), eparina, spugna di gelatina assorbibile, un portaaghi dritto e buprenorfina.
   NOTA: Gli elastici di fissaggio delle estremità e i divaricatori per l'addome e le gambe sono stati fatti a mano.
2. Sterilizzare le preps chirurgiche utilizzando l'autoclave con sterilizzazione a vapore a 120-125 °C per 30 minuti seguita da asciugatura per 30 minuti prima dell'intervento. Utilizzare una pulizia con etanolo al 70% seguita da sterilizzazione con perline calde (240-270 ° C per 3 minuti) tra ogni intervento chirurgico sugli animali.
3. Preparare soluzione salina normale sterilizzata allo 0,9%, soluzione salina eparinizzata (100 UI / ml) e buprenorfina (0,01 mg / ml) utilizzando siringhe ad ago da 29-31 G.

3. Anestesia e posizionamento

1. Iniziare l'anestesia del topo nella camera di induzione (0,8 ml/min, isoflurano al 2,5%). Una volta che il topo è adeguatamente anestetizzato, posizionare il topo in posizione supina sulla postazione chirurgica coperta da un drappeggio sterile. Ridurre la concentrazione di isoflurano fino a ~ 1,2% durante le fasi di rasatura e posizionamento.
2. Applicare il lubrificante oculare per proteggere gli occhi dall'asciugatura durante l'intervento.
3. Utilizzando un trimmer a penna, radersi i peli addominali per l'operazione e i peli delle gambe per le misurazioni della perfusione postoperatoria. Eliminare i capelli dal campo chirurgico.
4. Fissare gli arti superiori e inferiori con elastici e chiodi, controllare la profondità dell'anestesia monitorando il riflesso del pizzicamento della punta e titolare l'anestesia se necessario. Eseguire la valutazione del modello respiratorio ogni 3-5 minuti durante la procedura chirurgica per calibrare il livello di anestesia.

4. Esplorazione dell'area bersaglio chirurgico

1. Pulire più volte l'area della pelle rasata, alternando la preparazione dell'alcool e le salviette alla clorexidina in uno schema circolare per disinfettare il campo chirurgico.
2. Fare una laparotomia della linea mediana dal bordo inferiore del margine sternale alla sinfisi pubica. Sezionare il cuscinetto adiposo pubico per ottenere un campo operatorio più ampio.
3. Aprire la celiotomia per accedere al contenuto peritoneale con divaricatori ed eviscerare l'intestino tenue e crasso utilizzando tamponi di cotone rotondi medi a punta singola. Coprire le viscere con una spugna non tessuta imbevuta di soluzione salina.
4. Una volta ottenuta un'adeguata esposizione della vascolarizzazione retroperitoneale, coprire l'intestino, i reni e gli ureteri rimanenti con piccole spugne non tessute imbevute di soluzione salina. Evacuare una vescica distesa schiacciando delicatamente la cupola della vescica con tamponi di cotone rotondi medi a terminazione singola, se necessario.
5. Sezionare attentamente la fascia perivascolare e il tessuto adiposo da circa 1 cm prossimale alla biforcazione aortica che si estende fino al livello della biforcazione iliaca sinistra usando una pinza di Dumont dritta e piccoli tamponi di cotone duri, affilati e appuntiti a doppia estremità.
   NOTA: L'arteria iliaca sinistra e la vena sono lasciate aderenti l'una all'altra mentre isolano le strutture artero-venose in massa. Questo passaggio fornirà una mobilitazione sufficiente dei vasi per facilitare la creazione di AVF.
6. Se si incontrano piccoli rami venosi originati o convergenti con la vena iliaca comune sinistra, ligarali usando cauterizzazione a bassa temperatura con o senza sutura di seta 6-0 secondo necessità.
7. Passare la punta della pinza angolata sotto il fascio vascolare iliaco comune sinistro e distribuire delicatamente più volte per mobilizzare i vasi dalla muscolatura retroperitoneale sottostante (Figura 1A).

5. Creazione di una comune anastomosi della fistola arteriosa iliaca

1. Posizionare due suture di seta 4-0 attorno al fascio arterioso iliaco comune isolato e usarli come legature (ad esempio, morsetti incrociati) al fascio vascolare. Crea un singolo nodo con ogni cravatta di seta 4-0 e applicali in sequenza da prossimale a distale.
2. Assicurarsi che i morsetti incrociati della cravatta di seta siano posizionati sufficientemente distanti per isolare ~ 2 mm di lunghezza del vaso e l'applicazione sequenziale delle legature di sutura precipiterà l'ingorgo della vena iliaca sinistra.
3. Utilizzando le corde di sutura di seta 4-0 come maniglie, ruotare il fascio vascolare arterioso iliaco sinistro in senso orario e mettere a punto la posizione per localizzare temporaneamente la vena anteriore all'arteria (Figura 1B).
4. Effettuare una venotomia longitudinale (~1 mm) con forbici a molla Vannas dritte e lavare delicatamente il sangue residuo dal lume venoso con soluzione salina allo 0,9% (Figura 1C). Prestare attenzione durante questa fase, poiché un lavaggio salino ad alta pressione può causare interruzioni venose.
   NOTA: la regione di colore rosso che rimane nell'arteria iliaca dopo il rossore venoso fornisce una finestra visiva per il passaggio successivo.
5. Posizionare una sutura di nylon 10-0 imbricante attraverso la parete posteriore della vena.
   NOTA: Questa porzione della vena iliaca dovrebbe essere in apposizione immediata alla parete anteriore dell'arteria iliaca e le pareti sono naturalmente aderenti. La sutura dovrebbe passare attraverso entrambe le pareti e legare la sutura verso il basso con un singolo nodo (Figura 1D). Si noti che una piccola quantità di sanguinamento, che ha origine dal sangue stagnante nell'arteria iliaca, apparirà una volta che l'ago passa attraverso entrambe le pareti. Se il sanguinamento intra-luminale continua durante questa fase, i morsetti incrociati della sutura di seta potrebbero essere troppo allentati e devono essere ulteriormente serrati.
6. Afferrare le estremità di sutura imbricate e metterle sotto una leggera tensione per spostare la parete anteriore dalla parete posteriore dell'arteria iliaca. Fai un'incisione ellittica ~ 1,0 mm x 0,3 mm usando le forbici a molla Vannas curve, rimuovendo le pareti aderenti sia dell'arteria iliaca che della vena.
   NOTA: La fistola artero-venosa viene così creata una volta stabilito questo canale comune. È possibile ferire le pareti laterali della vena durante questa fase poiché l'incisione della parete della vena iliaca posteriore / arteria iliaca anteriore viene eseguita attraverso l'esposizione alla venotomia. Si deve prestare attenzione per evitare questa complicanza in quanto ciò può ridurre considerevolmente il diametro della fistola e portare allo sviluppo di trombi.
7. Lavare delicatamente il sangue residuo del lume arterioso esposto con soluzione salina allo 0,9% ed eparinizzata (100 UI / ml)²⁸ (Figura 1E).
8. Dopo la creazione dell'AVF, riparare la venotomia iniziale della parete anteriore utilizzando due o tre suture di nylon 10-0 in modo interrotto (Figura 1F).
9. Ripristinare il fascio vascolare al suo orientamento anatomico originale e posizionare un piccolo pezzo di spugna di gelatina assorbibile imbevuta di soluzione salina adiacente alla venotomia riparata per facilitare l'emostasi.
10. Allenta le legature a nodo singolo 4-0 in sequenza da distale a prossimale. Monitorare attentamente il sito di venotomia per un eccessivo sanguinamento mentre si allenta ogni sutura.
11. Se la riparazione non è adeguatamente emostatica, riapplicare i morsetti trasversali e posizionare un'altra sutura di nylon 10-0 nel sito di sanguinamento. Se l'emostasi è assicurata, rimuovere i punti di sutura e quindi la spugna di gelatina assorbibile.
12. Strofinare delicatamente il fascio vascolare con piccoli tamponi di cotone duri, affilati e appuntiti a doppia estremità, che facilitano ulteriormente il ripristino del flusso sanguigno. Confermare il successo tecnico dell'operazione utilizzando la visualizzazione del sangue ossigenato rosso vivo pulsante che entra nella vena iliaca e si mescola con il sangue venoso scuro che ritorna dall'arto posteriore.
13. Iniettare soluzione salina eparinizzata (0,2 UI / g) ¹⁵ nell'IVC per l'anticoagulazione sistemica per migliorare i risultati della pervietà AVF.
    NOTA: Sebbene questa fase si verifichi dopo la ricostruzione vascolare (al contrario dell'analogo umano in cui l'eparinizzazione si verifica prima del cross-clampaggio dei vasi), una riduzione del sanguinamento intraoperatorio e una migliore pervietà AVF sono state osservate quando eseguite in questa fase della procedura. L'iniezione in un sito coperto da fascia e / o grasso è preferibile per prevenire il sanguinamento dal sito di puntura.
14. Ispezionare nuovamente il sito chirurgico per l'emostasi dopo l'iniezione di soluzione salina eparinizzata. Se non ci sono problemi di sanguinamento, chiudere la fascia mediana e quindi l'incisione cutanea con suture PGA 5-0 assorbibili in modo corrente.
15. Per le operazioni fittizie, seguire tutti i passaggi chiave della procedura ad eccezione della formazione AVF. Applicare un singolo nodo della legatura della seta 4-0 all'estremità prossimale del fascio artero-venoso iliaco sinistro e abbinare i tempi di morsetto agli interventi chirurgici AVF (ad esempio, ~ 20 minuti, a seconda della competenza del microchirurgo).

6. Cura e misurazione postoperatoria

1. Dopo la chiusura della laparotomia, misurare la perfusione sanguigna dei muscoli tibiali bilaterali anteriori e delle zampe ventrali utilizzando l'imaging laser Doppler.
   NOTA: I deficit unilaterali di perfusione confermeranno la diversione della fistola del flusso arterioso ("steal").
2. Somministrare 0,1 mg/kg di buprenorfina per via sottocutanea e riportare il topo in una gabbia di topo preriscaldata con lettiera morbida altamente assorbibile con nido.
3. Lasciare che il topo si riprenda nella gabbia del topo preriscaldata fino a quando l'anestesia svanisce, il che sarà evidente quando il mouse è ambulatoriale e interattivo (~ 2 h). Durante il recupero, dare al mouse un facile accesso a una dieta idratata e morbida.
4. Somministrare buprenorfina e/o idratazione salina sottocutanea ogni 12 h fino a 48 h ed eseguire il monitoraggio giornaliero per 5 giorni post-operatori. Eutanasia degli animali con una condizione di deterioramento o eccessiva necrosi tissutale, classificati come punteggio di ischemia modificata ≥ 2²⁹.
5. Utilizzare valutazioni ecografiche duplex seriali per valutare la pervietà della fistola post-operatoria; i topi con trombosi della fistola sono esclusi dalle analisi successive, a meno che lo scopo degli esperimenti non sia quello di caratterizzare il fallimento della maturazione dell'AVF.
6. Determinare altre misurazioni degli esiti postoperatori come l'emodinamica locale, la forza di presa e le prestazioni dell'andatura durante il periodo di recupero. Raccogliere fistola e tessuti muscolari per valutare l'istomorfologia al termine dell'esperimento durante il sacrificio^25,27.

Risultati

Gli animali esposti a una dieta adenina hanno ridotto i tassi di filtrazione glomerulare (controllo: 441,3 ± 54,2 μL/min vs. CKD: 165,1 ± 118,3 μL/min, p < 0,05) e aumentato i livelli sierici di azoto ureico nel sangue (controllo: 20,39 ± 4,2 μL/min vs. CKD: 38,20 ± 10,65 μL/min, p < 0,05) rispetto agli animali che hanno ricevuto chow a base di caseina, confermando la presenza di insufficienza renale prima dell'intervento chirurgico alla fistola artero-venosa.

Discussione

La prevalenza dei pazienti in emodialisi con ARHD dopo la creazione di AVF ha continuato ad aumentare^30,31. Infatti, le complicanze sintomatiche irrisolte 4,32,33 come dolore, debolezza, parestesia e/o ridotta gamma di movimento possono avere un impatto negativo sul benessere del paziente 4,32,33,34,35,36 e minacciare la loro capacità di ricevere un trattamento di emodialisi ripetitiva di alta qualità.<...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.15% Adenine diet	ENVIGO	TD.130899	20% casein, 0.15% adenine, 0.9% P
0.2% Adenine diet	ENVIGO	TD.130900	20% casein, 0.2% adenine, 0.9% P
10-0 Nylon suture	AD surgical	XXS-N1005T4
29 G needle syringes	Exel International	14-841-32
31 G needle syringes	Advocate	U-100 insulin syringe
4-0 silk suture	AD surgical	S-S41813
45-degree angled dumont forceps	Fine Science Tools	11253-25
5-0 PGA suture	AD surgical	PSGU-518R13
6-0 silk suture	AD surgical	S-S618R13
Absorbable gelatin sponge	ETHICON	1975
Alcohol preps	Covidien	5110-cs4000	70% isopropyl alcohol
Buprenorphine	NA	NA	0.01 g/mL
C57BL6/J mice	Jaxon Laboratory
Casein diet	ENVIGO	TD.130898	20% casein, 0.9% P
Cotton swabs	CONSTIX	SC-9	Medium single-ended round cotton swab
Cotton swabs	CONSTIX	SC-4	Small double-ended hard, sharp, pointed cotton swab
Curity non-woven sponges (2x2)	Covidien	9022
Curved Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15001-08
Doppler ultrasound	VisualSonics	Vevo 2100
Extra fine graefe forceps	Fine Science Tools	11150-10	2 pairs
Eye lubricant	CLCMEDICA	Optixcare eye lube
Heparin (5000 U/mL)	National Drug Codes List	63739-953-25	100 IU/mL
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-50
Low-temperature cautery	Bovie	AA04
Pen trimmer	Wahl	5640-600
Powder-free surgical gloves	Ansell	7824PF
Round handled needle holders	Fine Science Tools	12076-12
Sterile towel drape	Dynarex	DY440-MI
Sterilized 0.9% saline	National Drug Codes List	46066-807-25
Straight dumont forceps	Fine Science Tools	11253-20
Straight needle holder	Fine Science Tools	FST 12001-13
Straight vannas spring scissors	Fine Science Tools	25001-08
TrizChLOR4	National Drug Codes List	17033-279-50