Um modelo murino de disfunção da mão relacionada ao acesso para hemodiálise

Resumo

Este protocolo detalha os passos cirúrgicos da criação da fístula arteriovenosa ilíaca comum murina. Desenvolvemos este modelo para estudar a fisiopatologia do membro relacionada ao acesso hemodialítico.

Resumo

A doença renal crônica é um importante problema de saúde pública, e a prevalência de doença renal terminal (DRT) que requer terapias renais substitutivas crônicas, como hemodiálise, continua a aumentar. A colocação de fístula arteriovenosa autógena (FAV) continua sendo uma opção de acesso vascular primário para pacientes com DRCT. Infelizmente, aproximadamente metade dos pacientes em hemodiálise apresenta disfunção da mão relacionada ao acesso dialítico (DRA), variando de parestesia sutil a gangrena digital. Notavelmente, os fatores biológicos subjacentes responsáveis pela DRA são pouco compreendidos, e não existe um modelo animal adequado para elucidar os mecanismos e/ou desenvolver novas terapêuticas para a prevenção/tratamento da DRSA. Descrevemos um novo modelo de camundongo no qual uma FAV é criada entre a artéria ilíaca comum esquerda e a veia, facilitando a avaliação da fisiopatologia do membro. A microcirurgia inclui isolamento de vasos, venotomia longitudinal, criação de anastomose arteriovenosa e reconstrução venosa. As cirurgias simuladas incluem todas as etapas críticas, exceto a criação de FAV. A colocação de FAV ilíaca resulta em alterações clinicamente relevantes na hemodinâmica central, isquemia periférica e prejuízos no desempenho neuromotor dos membros posteriores. Este novo modelo pré-clínico de FAV fornece uma plataforma útil que recapitula perturbações neuromotoras comuns relatadas por pacientes em hemodiálise, permitindo que os pesquisadores investiguem os mecanismos da fisiopatologia da DRA e testem potenciais terapêuticas.

Introdução

O estabelecimento e a preservação do acesso vascular funcional continuam sendo uma meta primária importante para pacientes com doença renal terminal (DRT) em terapia renal substitutiva via hemodiálise¹. Tratamentos repetidos de hemodiálise são necessários para remover os resíduos, normalizar eletrólitos e manter o equilíbrio hídrico uma vez que a função renal se torne inadequada e, portanto, são necessários para a sobrevida em longo prazo². Portanto, o acesso vascular representa uma "tábua de salvação" para pacientes com DRCT, e a colocação de fístula arteriovenosa autógena (FAV) continua sendo uma opção preferencial de acesso para diálise entre essa coorte3. No entanto, aproximadamente 30%-60% dos pacientes em hemodiálise experimentam um espectro de incapacidades da mão, clinicamente definidas como disfunção da mão relacionada ao acesso (DRA). Os sintomas da DRA podem variar de fraqueza e descoordenação a monoplegia e gangrena digital, que podem ocorrer precocemente após a criação da FAV ou desenvolver-se gradualmente com a maturação da fístula. Além disso, a DRA complica o esquema de tratamento da DRCT, que está associado a pior qualidade de vida, alto risco de doença cardiovascular e aumento da mortalidade ^2,3,4.

Vários modelos animais têm sido desenvolvidos para estudar o remodelamento vascular induzido por alterações hemodinâmicas após a criação da FAV5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Modelos de animais de grande porte com FAV ilíaca ou femoral 16,17,18,19,20 e modelos de roedores utilizando anastomose artéria jugular carotídea ou formação de fístula aorta-veia cava inferior infrarrenal estão bem estabelecidos para examinar os aspectos acima mencionados da maturação e perviedade da ^FAV21 . Por exemplo, hipertensão venosa, maior diâmetro luminal e aumento da espessura da parede da veia são sinais de sucesso na maturação da FAV, enquanto fibrose substancial da camada média e hiperplasia intimal ou desenvolvimento de trombo sem alterações no fluxo frequentemente caracterizam falhas na FAV ^6,15. No entanto, os modelos animais de grande porte não possuem a flexibilidade experimental ou as capacidades transgênicas dos modelos murinos, enquanto os modelos atuais de roedores não facilitam prontamente a investigação da DRA devido à localização anatômica e/ou à falta de patologia associada aos membros. De fato, devido à falta de um modelo animal pré-clínico estabelecido que recapitule o fenótipo clínico relevante, o progresso da pesquisa para elucidar os mecanismos patobiológicos e desenvolver novas estratégias terapêuticas permaneceu estagnado, apesar de um aumento progressivo no número de pacientes sintomáticos com DRA. Portanto, o objetivo primário deste estudo é apresentar um modelo único de DRA em camundongos, fornecendo etapas do procedimento de microcirurgia de FAV e caracterização da fisiopatologia relacionada à FAV.

Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Universidade da Flórida e pelo Malcom Randall Veterans Affairs Medical Center.

NOTA: Camundongos C57BL/6J machos adultos jovens (8-10 semanas de idade) foram adquiridos do The Jackson Laboratory e alojados em um biotério controlado com luz (12 h de luz: ciclo de 12 h de escuro), temperatura (22 °C ± 1 °C) e umidade (50% ± 10%). Cinco camundongos foram autorizados a habitar por gaiola (W:18 cm x L:29 cm x H:12,5 cm) com materiais de nidificação, alimento e água sendo disponibilizados ad libitum. Após 7 dias de aclimatação do habitat com ração padrão, os camundongos foram alterados para uma dieta à base de caseína por 7 dias como uma fase de transição da dieta. Posteriormente, camundongos foram alimentados com ração à base de caseína com suplementação de adenina 0,2%-0,15% por 2-3 semanas para induzir disfunção renal (DRC) antes da cirurgia de FAV, conforme descrito anteriormente^22,23,24. Camundongos controle receberam ração à base de caseína sem suplementação de adenina (controle). As dietas controle e DRC foram mantidas durante todo o período de recuperação pós-operatória (DPO).

1. Medidas pré-operatórias

1. Avaliar os resultados basais/pré-operatórios, os diâmetros dos vasos aorto-ilíacos e os parâmetros de fluxo hemodinâmico usando imagens de ultrassom duplex e a perfusão do membro posterior via laser Doppler, conforme descrito anteriormente²⁵.
2. Determinar a força de preensão unilateral do membro pélvico e a avaliação da marcha em esteira para estabelecer a função basal do membro pélvico, conforme descrito^{anteriormente25,26}.
3. Avaliar a função renal medindo a taxa de filtração glomerular (TFG) via depuração de CTFI-inulina e/ou nível sérico de nitrogênio ureico (ureia) no sangue, conforme descrito anteriormente^22,24,27.

2. Preparo cirúrgico

1. Preparar as seguintes ferramentas e suprimentos cirúrgicos (Tabela de Materiais): esterilizador de contas quentes, lubrificante para os olhos, aparador de caneta, preparadores de álcool, lenços de clorexidina, pinças Graefe extrafinas, soro fisiológico 0,9% esterilizado, seringas de agulha 29 G e 31 G, esponjas não tecidas 2 x 2, cotonetes médios de ponta única (SC-9) e pequenos de ponta dupla, pontiagudos (SC-4), cautério a baixa temperatura, pinça Dumont reta, pinça Dumont angulada de 45°, tesoura de mola Vannas reta, tesoura de mola Vannas curva, porta-agulhas de cabo redondo, suturas de múltiplos tamanhos (4-0 de seda, 5-0 PGA, 6-0 de seda e 10-0 de nylon), heparina, esponja de gelatina absorvível, porta-agulha reto e buprenorfina.
   OBS: Os elásticos de fixação das extremidades e afastadores para abdome e pernas foram feitos à mão.
2. Esterilizar os preparativos cirúrgicos em autoclave com esterilização a vapor a 120-125 °C por 30 min seguido de secagem por 30 min antes da cirurgia. Utilizar limpeza com etanol a 70% seguida de esterilização por esferas quentes (240-270 °C por 3 min) entre cada cirurgia animal.
3. Preparar solução salina normal 0,9% esterilizada, solução salina heparinizada (100 UI/mL) e buprenorfina (0,01 mg/mL) usando seringas com agulha 29-31 G.

3. Anestesia e posicionamento

1. Iniciar anestesia em camundongos na câmara de indução (0,8 mL/min, isoflurano a 2,5%). Uma vez que o camundongo esteja adequadamente anestesiado, coloque-o em decúbito dorsal no posto cirúrgico coberto por um campo estéril. Reduzir a concentração de isoflurano até ~1,2% durante as etapas de barbear e posicionamento.
2. Aplique o lubrificante ocular para proteger os olhos do ressecamento durante a cirurgia.
3. Usando um aparador de caneta, raspe os cabelos abdominais para a operação e os pelos da perna para as medidas de perfusão pós-operatórias. Limpe os cabelos do campo cirúrgico.
4. Fixar os membros superiores e inferiores com elásticos e tachas, verificar a profundidade da anestesia monitorando o reflexo de pinça dos dedos dos pés e titular a anestesia conforme necessário. Realizar a avaliação do padrão respiratório a cada 3-5 min durante todo o procedimento cirúrgico para calibrar o nível de anestesia.

4. Exploração da área alvo cirúrgica

1. Limpe a área da pele raspada várias vezes, alternando entre preparação de álcool e lenços umedecidos de clorexidina em um padrão circular para desinfetar o campo cirúrgico.
2. Realizar laparotomia mediana desde a borda inferior da margem esternal até a sínfise púbica. Dissecar o coxim gorduroso do púbis para obter um campo operatório mais amplo.
3. Abra a celiotomia para acessar o conteúdo peritoneal com afastadores e eviscere os intestinos delgado e grosso usando cotonetes redondos médios e de extremidade única. Cubra os intestinos com uma esponja não tecida embebida em soro fisiológico.
4. Uma vez obtida a exposição adequada da vasculatura retroperitoneal, cubra o intestino remanescente, os rins e os ureteres com pequenas esponjas não tecidas embebidas em soro fisiológico. Evacue uma bexiga distendida apertando suavemente a cúpula da bexiga com cotonetes redondos médios e de extremidade única, conforme necessário.
5. Dissecar cuidadosamente a fáscia perivascular e o tecido adiposo de aproximadamente 1 cm proximal à bifurcação aórtica estendendo-se até o nível da bifurcação ilíaca esquerda usando pinça Dumont reta e pequenos cotonetes duros, pontiagudos e pontiagudos.
   NOTA: A artéria e a veia ilíaca esquerda são deixadas aderidas uma à outra enquanto isolam as estruturas arteriovenosas em massa. Essa etapa proporcionará mobilização suficiente dos vasos para facilitar a criação de FAV.
6. Se forem encontrados pequenos ramos venosos originados ou convergindo com a veia ilíaca comum esquerda, liga-os com cautério a baixa temperatura com ou sem fio de seda 6-0, conforme necessário.
7. Passar a ponta da pinça angulada sob o feixe vascular ilíaco comum esquerdo e espalhar suavemente várias vezes para mobilizar os vasos da musculatura retroperitoneal subjacente (Figura 1A).

5. Criação de uma anastomose de fístula arteriovenosa ilíaca comum

1. Coloque duas suturas de seda 4-0 ao redor do feixe arteriovenoso comum esquerdo isolado e use-as como ligaduras (por exemplo, pinças cruzadas) ao feixe vascular. Crie um único nó a cada gravata de seda 4-0 e aplique-os sequencialmente de proximal para distal.
2. Certifique-se de que as pinças cruzadas de gravata de seda estejam suficientemente afastadas para isolar ~2 mm de comprimento do vaso, e a aplicação sequencial das ligaduras de sutura precipitará o ingurgitamento da veia ilíaca esquerda.
3. Usando as cordas de sutura de seda 4-0 como alças, gire o feixe vascular arteriovenoso da ilíaca esquerda no sentido horário e ajuste fino da posição para localizar temporariamente a veia anterior à artéria (Figura 1B).
4. Realizar venotomia longitudinal (~1 mm) com tesoura reta de mola Vannas e lavar suavemente o sangue residual da luz venosa com solução fisiológica a 0,9% (Figura 1C). Tenha cuidado durante esta etapa, pois uma descarga de soro fisiológico de alta pressão pode causar ruptura venosa.
   NOTA: A região de cor vermelha que permanece na artéria ilíaca após o flushing venoso fornece uma janela visual para a etapa seguinte.
5. Coloque uma sutura de náilon 10-0 imbricante através da parede posterior da veia.
   OBS: Esta porção da veia ilíaca deve estar em aposição imediata à parede anterior da artéria ilíaca, e as paredes são naturalmente aderentes. A sutura deve atravessar ambas as paredes e amarrá-la com um nó único (Figura 1D). Observe que uma pequena quantidade de sangramento, que se origina do sangue estagnado na artéria ilíaca, aparecerá quando a agulha passar por ambas as paredes. Se o sangramento intraluminal continuar durante essa etapa, as pinças cruzadas de sutura de seda podem estar muito soltas e precisam ser mais apertadas.
6. Segure as extremidades da sutura imbricada e coloque-as sob tensão suave para deslocar a parede anterior da parede posterior da artéria ilíaca. Faça uma incisão elíptica de ~1,0 mm x 0,3 mm usando tesoura curva de mola de Vannas, removendo as paredes aderentes da artéria e veia ilíacas.
   NOTA: A fístula arteriovenosa é assim criada uma vez que este canal comum é estabelecido. É possível lesar as paredes laterais da veia durante essa etapa, pois a incisão da parede da veia ilíaca posterior/artéria ilíaca anterior é realizada através da exposição à venotomia. Deve-se ter cautela para evitar essa complicação, pois ela pode reduzir consideravelmente o diâmetro da fístula e levar ao desenvolvimento de trombo.
7. Lavar suavemente o sangue residual da luz arterial exposta com solução fisiológica a 0,9% e heparinizada (100 UI/mL)²⁸ (Figura 1E).
8. Após a confecção da FAV, reparar a venotomia inicial da parede anterior com duas ou três suturas de náilon 10-0 de forma interrompida (Figura 1F).
9. Restaurar o feixe vascular à sua orientação anatômica original e colocar um pequeno pedaço de esponja de gelatina absorvível embebida em soro fisiológico adjacente à venotomia reparada para facilitar a hemostasia.
10. Soltar as ligaduras de pinça cruzada de nó único 4-0 sequencialmente de distal para proximal. Monitore atentamente o local da venotomia quanto ao sangramento excessivo enquanto afrouxa cada sutura.
11. Se o reparo não for adequadamente hemostático, reaplique as pinças cruzadas e coloque outra sutura de náilon 10-0 no local do sangramento. Se a hemostasia estiver assegurada, remova as suturas e, em seguida, a esponja de gelatina absorvível.
12. Esfregue suavemente o feixe vascular com pequenos cotonetes duros, afiados e pontiagudos, que facilitam ainda mais a restauração do fluxo sanguíneo. Confirmar o sucesso técnico da operação usando a visualização de sangue oxigenado vermelho vivo pulsátil entrando na veia ilíaca e misturando-se com sangue venoso escuro retornando do membro posterior.
13. Injetar solução salina heparinizada (0,2 UI/g)¹⁵ na VCI para anticoagulação sistêmica para melhorar os resultados de perviedade da FAV.
    NOTA: Embora esta etapa ocorra após a reconstrução vascular (ao contrário do análogo humano, onde a heparinização ocorre antes do pinçamento do vaso), observou-se redução do sangramento intraoperatório e melhora da patência da FAV quando realizada nesta fase do procedimento. A injeção em um local coberto por fáscia e/ou gordura é preferível para evitar sangramento do local da punção.
14. Inspecionar novamente o sítio cirúrgico em busca de hemostasia após a injeção de solução salina heparinizada. Se não houver problemas de sangramento, feche a fáscia da linha média e, em seguida, a incisão da pele com suturas absorvíveis de PGA 5-0 de forma corrida.
15. Para operações simuladas, siga todas as etapas principais do procedimento, exceto a formação de FAV. Aplicar um nó único da ligadura de seda 4-0 na extremidade proximal do feixe arteriovenoso ilíaco esquerdo e combinar os tempos de pinça com as cirurgias de FAV (por exemplo, ~20 min, dependendo da proficiência do microcirurgião).

6. Cuidados pós-operatórios e mensuração

1. Após o fechamento da laparotomia, medir a perfusão sanguínea dos músculos tibial anterior bilateral e patas ventrais usando laser Doppler.
   NOTA: Déficits de perfusão unilaterais confirmarão o desvio do fluxo arterial da fístula ("roubar").
2. Administrar 0,1 mg/kg de buprenorfina por via subcutânea e devolver o rato a uma gaiola pré-aquecida com cama macia altamente absorvível com ninho.
3. Permita que o mouse se recupere na gaiola pré-aquecida até que a anestesia se desgaste, o que será óbvio quando o mouse estiver deambulando e interagindo (~2 h). Durante a recuperação, dê ao rato acesso fácil a uma dieta hidratada e suave.
4. Administrar buprenorfina e/ou hidratação salina subcutânea a cada 12 h até 48 h e realizar monitorização diária por 5 dias de pós-operatório. Eutanásia de animais com deterioração ou necrose tecidual excessiva, classificada como escore de isquemia modificado ≥2²⁹.
5. Utilizar ultrassonografia duplex seriada para avaliar a patência da fístula no pós-operatório; camundongos com trombose de fístula são excluídos de análises subsequentes, a menos que o objetivo dos experimentos seja caracterizar falha na maturação da FAV.
6. Determinar outras medidas de desfecho pós-operatório, como hemodinâmica local, força de preensão manual e desempenho da marcha durante o período de recuperação. Coletar fístula e tecidos musculares para avaliação histomorfológica ao final do experimento durante o sacrifício^25,27.

Resultados

Animais expostos à dieta com adenina apresentaram taxas de filtração glomerular reduzidas (controle: 441,3 ± 54,2 μL/min vs. DRC: 165,1 ± 118,3 μL/min, p < 0,05) e níveis séricos de nitrogênio ureico (controle: 20,39 ± 4,2 μL/min vs. DRC: 38,20 ± 10,65 μL/min, p < 0,05) em comparação aos animais que receberam ração à base de caseína, confirmando a presença de insuficiência renal prévia à cirurgia de fístula arteriovenosa.

Validação da pervi...

Discussão

A prevalência de pacientes em hemodiálise com DRA após a criação de FAV continua a aumentar^30,31. De fato, complicações sintomáticas não resolvidas 4,32,33 como dor, fraqueza, parestesia e/ou redução da amplitude de movimento podem afetar negativamente o bem-estar do paciente 4,32,33,34,35,36 e ameaçar sua capacidade de receber tratamento repetitivo de hemodiálise de alta qualidade.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.15% Adenine diet	ENVIGO	TD.130899	20% casein, 0.15% adenine, 0.9% P
0.2% Adenine diet	ENVIGO	TD.130900	20% casein, 0.2% adenine, 0.9% P
10-0 Nylon suture	AD surgical	XXS-N1005T4
29 G needle syringes	Exel International	14-841-32
31 G needle syringes	Advocate	U-100 insulin syringe
4-0 silk suture	AD surgical	S-S41813
45-degree angled dumont forceps	Fine Science Tools	11253-25
5-0 PGA suture	AD surgical	PSGU-518R13
6-0 silk suture	AD surgical	S-S618R13
Absorbable gelatin sponge	ETHICON	1975
Alcohol preps	Covidien	5110-cs4000	70% isopropyl alcohol
Buprenorphine	NA	NA	0.01 g/mL
C57BL6/J mice	Jaxon Laboratory
Casein diet	ENVIGO	TD.130898	20% casein, 0.9% P
Cotton swabs	CONSTIX	SC-9	Medium single-ended round cotton swab
Cotton swabs	CONSTIX	SC-4	Small double-ended hard, sharp, pointed cotton swab
Curity non-woven sponges (2x2)	Covidien	9022
Curved Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15001-08
Doppler ultrasound	VisualSonics	Vevo 2100
Extra fine graefe forceps	Fine Science Tools	11150-10	2 pairs
Eye lubricant	CLCMEDICA	Optixcare eye lube
Heparin (5000 U/mL)	National Drug Codes List	63739-953-25	100 IU/mL
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-50
Low-temperature cautery	Bovie	AA04
Pen trimmer	Wahl	5640-600
Powder-free surgical gloves	Ansell	7824PF
Round handled needle holders	Fine Science Tools	12076-12
Sterile towel drape	Dynarex	DY440-MI
Sterilized 0.9% saline	National Drug Codes List	46066-807-25
Straight dumont forceps	Fine Science Tools	11253-20
Straight needle holder	Fine Science Tools	FST 12001-13
Straight vannas spring scissors	Fine Science Tools	25001-08
TrizChLOR4	National Drug Codes List	17033-279-50