Hemodiyaliz Erişimi ile İlişkili El Disfonksiyonunun Bir Murine Modeli

Özet

Bu protokol, murin ortak iliak arteriyovenöz fistül oluşumunun cerrahi adımlarını detaylandırır. Bu modeli hemodiyaliz erişimi ile ilişkili ekstremite patofizyolojisini incelemek için geliştirdik.

Özet

Kronik böbrek hastalığı önemli bir halk sağlığı sorunudur ve hemodiyaliz gibi kronik renal replasman tedavileri gerektiren son dönem böbrek hastalığı (SDBY) prevalansı artmaya devam etmektedir. Otojen arteriyovenöz fistül (AVF) yerleştirilmesi, SDBY'li hastalar için primer vasküler erişim seçeneği olmaya devam etmektedir. Ne yazık ki, hemodiyaliz hastalarının yaklaşık yarısı, ince paresteziden dijital kangrene kadar değişen diyaliz erişimi ile ilişkili el disfonksiyonu (ARHD) yaşamaktadır. Özellikle, ARHD'den sorumlu olan altta yatan biyolojik faktörler tam olarak anlaşılamamıştır ve mekanizmaları aydınlatmak ve / veya ARHD'nin önlenmesi / tedavisi için yeni terapötikler geliştirmek için yeterli hayvan modeli yoktur. Burada, sol ortak iliak arter ve ven arasında bir AVF'nin oluşturulduğu ve böylece ekstremite patofizyolojisinin değerlendirilmesini kolaylaştıran yeni bir fare modeli tanımlanmıştır. Mikrocerrahi, damar izolasyonu, uzunlamasına venotomi, arteriyovenöz anastomoz oluşumu ve venöz rekonstrüksiyonu içerir. Sahte ameliyatlar, AVF oluşturma dışındaki tüm kritik adımları içerir. İliak AVF yerleşimi santral hemodinamik, periferik iskemi ve arka ekstremite nöromotor performansında bozulmalara klinik olarak anlamlı değişiklikler ile sonuçlanır. Bu yeni preklinik AVF modeli, hemodiyaliz hastaları tarafından bildirilen yaygın nöromotor pertürbasyonları özetleyen ve araştırmacıların ARHD patofizyolojisinin mekanizmalarını araştırmalarına ve potansiyel terapötikleri test etmelerine olanak tanıyan yararlı bir platform sunmaktadır.

Giriş

Fonksiyonel vasküler erişimin sağlanması ve korunması, hemodiyaliz yoluyla renal replasman tedavisi alan son dönem böbrek hastalığı (SDBY) hastaları için önemli bir birincil hedef olmaya devam etmektedir¹. Tekrarlanan hemodiyaliz tedavileri, atık ürünleri uzaklaştırmak, elektrolitleri normalleştirmek ve böbrek fonksiyonu yetersiz kaldığında sıvı dengesini korumak için gereklidir ve bu nedenle uzun süreli sağkalım için gereklidir². Bu nedenle, vasküler erişim SDBY'li hastalar için bir "yaşam çizgisi" dir ve otojen arteriyovenöz fistül (AVF) yerleşimi bu kohort³ arasında tercih edilen bir diyaliz erişim seçeneği olmaya devam etmektedir. Bununla birlikte, hemodiyaliz hastalarının yaklaşık% 30-60'ı, klinik olarak erişimle ilişkili el disfonksiyonu (ARHD) olarak tanımlanan bir el sakatlığı spektrumu yaşamaktadır. ARHD'nin semptomları zayıflık ve koordinasyonsuzluktan monopleji ve dijital kangrene kadar değişebilir, bu da AVF oluşturulduktan hemen sonra ortaya çıkabilir veya fistül olgunlaşması ile yavaş yavaş gelişebilir. Ayrıca, ARHD, düşük yaşam kalitesi, yüksek kardiyovasküler hastalık riski ve artmış mortalite ^2,3,4 ile ilişkili SDBY tedavi programını karmaşıklaştırmaktadır.

AVF oluşumunu takiben hemodinamik değişikliklerin neden olduğu vasküler yeniden şekillenmeyi incelemek için çeşitli hayvan modelleri geliştirilmiştir 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. İliak veya femoral AVF 16,17,18,19,20 olan büyük hayvan modelleri ve karotis arter-juguler ven anastomozu veya infrarenal aort-inferior vena kava fistül formasyonu kullanan kemirgen modelleri^, AVF olgunlaşmasının ve açıklığının yukarıda belirtilen yönlerini incelemek için iyi kurulmuştur ²¹ . Örneğin, venöz hipertansiyon, daha büyük luminal çap ve artmış ven duvarı kalınlığı başarılı AVF olgunlaşmasının imzalarıdır, oysa medyanın önemli fibrozisi ve akışta herhangi bir değişiklik olmaksızın intimal hiperplazi veya trombüs gelişimi sıklıkla AVF başarısızlıklarını karakterize eder ^6,15. Bununla birlikte, büyük hayvan modelleri, murin modellerinin deneysel esnekliğinden veya transgenik yeteneklerinden yoksunken, mevcut kemirgen modelleri, anatomik konum ve / veya ilişkili uzuv patolojisinin eksikliği nedeniyle ARHD'nin araştırılmasını kolayca kolaylaştırmamaktadır. Gerçekten de, ilgili klinik fenotipi özetleyen yerleşik bir preklinik hayvan modelinin eksikliği nedeniyle, semptomatik ARHD hastalarının sayısındaki ilerleyici artışa rağmen, patobiyolojik mekanizmaları aydınlatmak ve yeni terapötik stratejiler geliştirmek için araştırma ilerlemesi durgun kalmıştır. Bu nedenle, bu çalışmanın temel amacı, AVF mikrocerrahisinin prosedürel adımlarını ve AVF ile ilişkili patofizyolojinin karakterizasyonunu sağlayan benzersiz bir ARHD fare modelini tanıtmaktır.

Protokol

Tüm prosedürler Florida Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) ve Malcom Randall Gazi İşleri Tıp Merkezi tarafından onaylanmıştır.

NOT: Genç yetişkin (8-10 haftalık) erkek C57BL/6J fareler Jackson Laboratuvarı'ndan satın alınmış ve ışık (12 saat ışık: 12 saat karanlık döngü), sıcaklık (22 °C ± 1 °C) ve nem (%50 ± %10) kontrollü bir hayvan tesisinde barındırılmıştır. Beş farenin kafes başına (W: 18 cm x L: 29 cm x H: 12.5 cm) oturmasına izin verildi ve yuvalama malzemeleri, yiyecek ve su ad libitum olarak sağlandı. Standart chow ile 7 günlük habitat alışmasının ardından, fareler diyet geçiş aşaması olarak 7 gün boyunca kazein bazlı bir chow diyetine dönüştürüldü. Bundan sonra, fareler, daha önce tarif edildiği gibi AVF ameliyatından önce böbrek fonksiyon bozukluğunu (KBH) indüklemek için 2-3 hafta boyunca% 0.2 -% 0.15 adenin takviyesi ile kazein bazlı chow ile beslendi ^22,23,24. Kontrol fareleri, adenin takviyesi (kontrol) olmadan kazein bazlı bir chow diyeti aldı. Kontrol ve KBH diyetleri postoperatif iyileşme dönemi (POD) boyunca sürdürüldü.

1. Ameliyat öncesi ölçümler

1. Daha önce tarif edildiği gibi dupleks ultrason görüntüleme ve lazer Doppler ile arka ekstremite perfüzyonunu kullanarak başlangıç/ameliyat öncesi sonuç ölçümlerini, aortoiliak damar çaplarını ve hemodinamik akım parametrelerini değerlendirin²⁵.
2. Daha önce tarif edildiği gibi taban çizgisi arka bacak fonksiyonunu oluşturmak için tek taraflı arka bacak kavrama gücünü ve koşu bandı yürüyüş değerlendirmesini belirleyin^25,26.
3. Daha önce tarif edildiği gibi FITC-inülin klerensi ve / veya serum kan üre azotu (BUN) seviyesi ile glomerüler filtrasyon hızını (GFR) ölçerek böbrek fonksiyonunu değerlendirin ^22,24,27.

2. Cerrahi hazırlık

1. Aşağıdaki cerrahi alet ve malzemeleri hazırlayın (Malzeme Tablosu): sıcak boncuk sterilizatörü, göz yağlayıcı, kalem düzeltici, alkol preparatları, klorheksidin mendiller, ekstra ince Graefe forseps, sterilize edilmiş% 0.9 salin, 29 G ve 31 G iğne şırıngaları, 2 x 2 dokunmamış sünger, orta tek uçlu yuvarlak (SC-9) ve küçük çift uçlu sert, keskin, sivri uçlu (SC-4) pamuklu çubuklar, düşük sıcaklıkta koter, düz Dumont forseps, 45° açılı Dumont forseps, düz Vannas yay makasları, kavisli Vannas yay makasları, yuvarlak saplı iğne tutucular, birden fazla dikiş boyutu (4-0 ipek, 5-0 PGA, 6-0 ipek ve 10-0 naylon sütürler), heparin, emilebilir jelatin sünger, düz iğne tutucu ve buprenorfin.
   NOT: Ekstremite sabitleme lastik bantları ve karın ve bacaklar için retraktörler el yapımıdır.
2. Cerrahi hazırlıkları otoklav kullanarak 120-125 °C'de buhar sterilizasyonu ile 30 dakika boyunca sterilize edin, ardından ameliyattan önce 30 dakika kurutun. Her hayvan ameliyatı arasında% 70 etanol temizliği ve ardından sıcak boncuk sterilizasyonu (3 dakika boyunca 240-270 ° C) kullanın.
3. 29-31 G iğne şırıngaları kullanarak sterilize edilmiş% 0.9 normal salin, heparinize salin (100 IU / mL) ve buprenorfin (0.01 mg / mL) hazırlayın.

3. Anestezi ve konumlandırma

1. İndüksiyon odasında fare anestezisini başlatın (0.8 mL / dak,% 2.5 izofluran). Fare yeterince uyuşturulduktan sonra, fareyi steril bir örtü ile kaplı ameliyat istasyonuna sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Tıraş ve konumlandırma adımları sırasında izofluran konsantrasyonunu ~% 1.2'ye kadar azaltın.
2. Ameliyat sırasında gözlerin kurumasını önlemek için oküler kayganlaştırıcıyı uygulayın.
3. Bir kalem düzeltici kullanarak, operasyon için karın kıllarını ve postoperatif perfüzyon ölçümleri için bacak kıllarını tıraş edin. Saçları cerrahi alandan temizleyin.
4. Üst ve alt ekstremiteleri lastik bantlar ve tutamaklarla sabitleyin, ayak parmağı sıkışma refleksini izleyerek anestezinin derinliğini kontrol edin ve gerektiğinde anesteziyi titre edin. Anestezi seviyesini kalibre etmek için cerrahi prosedür boyunca her 3-5 dakikada bir solunum paterni değerlendirmesi yapın.

4. Cerrahi hedef bölgenin araştırılması

1. Cerrahi alanı dezenfekte etmek için alkol hazırlığı ve klorheksidin mendiller arasında dairesel bir düzende geçiş yaparak tıraş edilen cilt bölgesini birkaç kez temizleyin.
2. Sternal sınırın alt kenarından pubis simfizine kadar orta hat laparotomi yapın. Daha geniş bir ameliyat alanı elde etmek için pubis yağ yastığını diseke edin.
3. Retraktörlerle periton içeriğine erişmek için seliyotomiyi açın ve orta, tek uçlu yuvarlak pamuklu çubuklar kullanarak ince ve kalın bağırsakları boşaltın. Bağırsakları tuzlu suya batırılmış dokunmamış bir süngerle örtün.
4. Retroperitoneal vaskülatürün yeterli maruziyeti elde edildikten sonra, kalan bağırsakları, böbrekleri ve üreterleri küçük tuzlu batırılmış dokunmamış süngerlerle örtün. Mesane kubbesini gerektiğinde orta, tek uçlu yuvarlak pamuklu çubuklarla hafifçe sıkarak şişkin bir mesaneyi boşaltın.
5. Düz Dumont forsepsleri ve küçük çift uçlu sert, keskin, sivri pamuklu çubuklar kullanarak perivasküler fasyayı ve yağ dokusunu yaklaşık 1 cm proksimalden sol iliak bifurkasyon seviyesine kadar uzanan aort bifurkasyonuna dikkatlice diseke edin.
   NOT: Sol iliak arter ve ven, arteriyovenöz yapılar topluca izole edilirken birbirine yapışık bırakılır. Bu adım, AVF'nin oluşturulmasını kolaylaştırmak için yeterli gemi mobilizasyonu sağlayacaktır.
6. Sol ortak iliak damardan kaynaklanan veya onunla yakınlaşan küçük venöz dallarla karşılaşılırsa, gerektiğinde 6-0 ipek dikişli veya dikişsiz düşük sıcaklıklı koter kullanarak bunları bağlayın.
7. Açılı forsepsin ucunu sol ortak iliak vasküler demetin altından geçirin ve damarları altta yatan retroperitoneal kas sisteminden harekete geçirmek için birkaç kez yavaşça yayın (Şekil 1A).

5. Ortak iliak arteriyovenöz fistül anastomozunun oluşturulması

1. İzole sol ortak iliak arteriyovenöz demetin etrafına iki adet 4-0 ipek sütür yerleştirin ve bunları vasküler demetin üzerine bitişik harfler (örneğin çapraz kelepçeler) olarak kullanın. Her 4-0 ipek kravat ile tek bir düğüm oluşturun ve bunları proksimalden distal'e sırayla uygulayın.
2. İpek bağ çapraz kelepçelerinin ~ 2 mm damar uzunluğunu izole etmek için yeterince uzağa yerleştirildiğinden emin olun ve sütür ligatürlerinin sıralı uygulaması sol iliak ven engorgementini hızlandıracaktır.
3. 4-0 ipek sütür tellerini tutamak olarak kullanarak, sol iliak arteriyovenöz vasküler demeti saat yönünde döndürün ve venin ön tarafını artere geçici olarak yerleştirmek için pozisyona ince ayar yapın (Şekil 1B).
4. Düz Vannas yay makası ile uzunlamasına venotomi (~ 1 mm) yapın ve kalan kanı venöz lümenden %0.9 salin ile nazikçe temizleyin (Şekil 1C). Bu adımda dikkatli olun, çünkü yüksek basınçlı salin yıkama venöz bozulmaya neden olabilir.
   NOT: Venöz kızarmadan sonra iliak arterde kalan kırmızı renkli bölge, bir sonraki adım için görsel bir pencere sağlar.
5. Damarın arka duvarından 10-0 naylon sütür yerleştirin.
   NOT: İliak venin bu kısmı, iliak arterin ön duvarına derhal yerleştirilmelidir ve duvarlar doğal olarak yapışkandır. Dikiş her iki duvardan da geçmeli ve tek bir düğüm ile dikiş bağlanmalıdır (Şekil 1D). İliak arterdeki durgun kandan kaynaklanan az miktarda kanamanın, iğne her iki duvardan geçtikten sonra ortaya çıkacağını unutmayın. Bu adımda intraluminal kanama devam ederse, ipek sütür çapraz kelepçeleri çok gevşek olabilir ve daha fazla sıkılması gerekebilir.
6. İmbriye sütür uçlarını kavrayın ve ön duvarı iliak arterin arka duvarından çıkarmak için yumuşak bir gerginlik altına yerleştirin. Kavisli Vannas yay makası kullanarak ~ 1.0 mm x 0.3 mm eliptik bir kesi yapın, hem iliak arterin hem de venin yapışkan duvarlarını çıkarın.
   NOT: Arteriyovenöz fistül, bu ortak kanal kurulduktan sonra oluşturulur. Venotomi maruziyeti ile posterior iliak ven/anterior iliak arter duvarı insizyonu yapıldığı için bu basamakta venin lateral duvarlarına zarar vermek mümkündür. Bu komplikasyondan kaçınmak için dikkatli olunmalıdır, çünkü bu fistül çapını önemli ölçüde azaltabilir ve trombüs gelişimine yol açabilir.
7. Maruz kalan arteriyel lümenin kalan kanını %0,9 salin ve heparinize salin (100 IU/mL)²⁸ ile nazikçe temizleyin (Şekil 1E).
8. AVF'nin oluşturulmasını takiben, ilk ön duvar venotomisinin iki veya üç adet 10-0 naylon dikiş kullanarak kesintiye uğramış bir şekilde onarılması (Şekil 1F).
9. Vasküler demeti orijinal anatomik oryantasyonuna geri döndürün ve hemostazı kolaylaştırmak için onarılan venotominin bitişiğinde küçük bir parça tuzlu suya batırılmış emilebilir jelatin sünger yerleştirin.
10. 4-0 tek düğümlü çapraz kelepçe ligatürlerini distalden proksimale sırayla gevşetin. Her dikişi gevşetirken aşırı kanama için venotomi bölgesini yakından izleyin.
11. Onarım yeterince hemostatik değilse, çapraz kelepçeleri tekrar uygulayın ve kanama bölgesine başka bir 10-0 naylon dikiş yerleştirin. Hemostaz garanti edilirse, dikişleri ve ardından emilebilir jelatin süngeri çıkarın.
12. Damar demetini, kan akışının restorasyonunu daha da kolaylaştıran küçük, çift uçlu sert, keskin, sivri uçlu pamuklu çubuklarla hafifçe ovalayın. İlyak damara giren pulsatilen, parlak kırmızı oksijenli kanın görselleştirilmesini ve arka bacaktan dönen koyu venöz kanla karıştırılmasını kullanarak operasyonun teknik başarısını onaylayın.
13. AVF açıklık sonuçlarını iyileştirmek için sistemik antikoagülasyon için IVC'ye heparinize salin (0.2 IU / g)¹⁵ enjekte edin.
    NOT: Bu basamak vasküler rekonstrüksiyondan sonra meydana gelmesine rağmen (damar çapraz klemplemesinden önce heparinizasyonun meydana geldiği insan analogunun aksine), prosedürün bu aşamasında uygulandığında intraoperatif kanamada bir azalma ve AVF açıklığında iyileşme gözlenmiştir. Delinme bölgesinden kanamayı önlemek için fasya ve / veya yağ ile kaplı bir bölgeye enjeksiyon tercih edilir.
14. Heparinize salin enjeksiyonundan sonra hemostaz için cerrahi bölgeyi tekrar inceleyin. Kanama endişesi yoksa, orta hat fasyasını kapatın ve ardından cilt insizyonunu emilebilir 5-0 PGA dikişleriyle çalışan bir şekilde kapatın.
15. Sahte operasyonlar için, AVF oluşumu dışında prosedürün tüm önemli adımlarını izleyin. Sol iliak arteriyovenöz demetin proksimal ucuna 4-0 ipek ligatürün tek bir düğümünü uygulayın ve kelepçe sürelerini AVF ameliyatlarıyla eşleştirin (örneğin, mikrocerrahın yeterliliğine bağlı olarak ~ 20 dakika).

6. Postoperatif bakım ve ölçüm

1. Laparotomi kapatıldıktan sonra lazer Doppler görüntüleme ile bilateral tibialis ön kaslarının ve ventral pençelerinin kan perfüzyonunu ölçün.
   NOT: Tek taraflı perfüzyon eksiklikleri, arteriyel akımın fistül saptırılmasını ("çalma") doğrulayacaktır.
2. Deri altından 0,1 mg/kg buprenorfin uygulayın ve fareyi yuvalı yüksek oranda emilebilir yumuşak yataklarla önceden ısıtılmış bir fare kafesine geri koyun.
3. Anestezi tükenene kadar farenin önceden ısıtılmış fare kafesinde iyileşmesine izin verin, bu fare ambulatuar ve etkileşimli olduğunda (~ 2 saat) belirgin olacaktır. İyileşme sırasında, fareye nemlendirilmiş, yumuşak bir diyete kolay erişim sağlayın.
4. Buprenorfin ve / veya subkutan salin hidrasyonunu her 12 saatte bir 48 saate kadar uygulayın ve ameliyat sonrası 5 gün boyunca günlük izleme yapın. Modifiye iskemi skoru olarak sınıflandırılan kötüleşen bir durumu veya aşırı doku nekrozu olan hayvanları ötenazi yapın ≥2²⁹.
5. Ameliyat sonrası fistül açıklığını değerlendirmek için seri dupleks ultrason değerlendirmelerini kullanın; Fistül trombozu olan fareler, deneylerin amacı AVF olgunlaşma başarısızlığını karakterize etmek olmadıkça sonraki analizlerden hariç tutulur.
6. İyileşme süresi boyunca lokal hemodinamik, kavrama kuvveti ve yürüme performansı gibi diğer postoperatif sonuç ölçümlerini belirleyin. Fedakarlık sırasında deneyin sonunda histomorfolojiyi değerlendirmek için fistül ve kas dokularını toplayın^25,27.

Sonuçlar

Adenin diyetine maruz kalan hayvanlar, kazein bazlı chow alan hayvanlara kıyasla glomerüler filtrasyon hızlarını azaltmış (kontrol: 441.3 ± 54.2 μL / dak ile KBH: 165.1 ± 118.3 μL / dak, p < 0.05) ve artmış serum kan üre azot seviyeleri (kontrol: 20.39 ± 4.2 μL / dak vs KBH: 38.20 ± 10.65 μL / dak, p < 0.05) artmış ve arteriyovenöz fistül cerrahisinden önce böbrek yetmezliğinin varlığını doğrulamıştır.

AVF açıklığının doğrulan...

Tartışmalar

AVF oluşumunu takiben AHB'li hemodiyaliz hastalarının prevalansı^30,31 artmaya devam etmiştir. Gerçekten de, ağrı, halsizlik, parestezi ve / veya azalmış hareket açıklığı gibi çözülmemiş semptomatik komplikasyonlar 4,32,33,34,35,36 hasta refahını olumsuz yönde etkileyebilir ve yüksek kaliteli tekrarlayan hemodiyaliz tedavisi alma kapasitelerini tehdit edebilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.15% Adenine diet	ENVIGO	TD.130899	20% casein, 0.15% adenine, 0.9% P
0.2% Adenine diet	ENVIGO	TD.130900	20% casein, 0.2% adenine, 0.9% P
10-0 Nylon suture	AD surgical	XXS-N1005T4
29 G needle syringes	Exel International	14-841-32
31 G needle syringes	Advocate	U-100 insulin syringe
4-0 silk suture	AD surgical	S-S41813
45-degree angled dumont forceps	Fine Science Tools	11253-25
5-0 PGA suture	AD surgical	PSGU-518R13
6-0 silk suture	AD surgical	S-S618R13
Absorbable gelatin sponge	ETHICON	1975
Alcohol preps	Covidien	5110-cs4000	70% isopropyl alcohol
Buprenorphine	NA	NA	0.01 g/mL
C57BL6/J mice	Jaxon Laboratory
Casein diet	ENVIGO	TD.130898	20% casein, 0.9% P
Cotton swabs	CONSTIX	SC-9	Medium single-ended round cotton swab
Cotton swabs	CONSTIX	SC-4	Small double-ended hard, sharp, pointed cotton swab
Curity non-woven sponges (2x2)	Covidien	9022
Curved Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15001-08
Doppler ultrasound	VisualSonics	Vevo 2100
Extra fine graefe forceps	Fine Science Tools	11150-10	2 pairs
Eye lubricant	CLCMEDICA	Optixcare eye lube
Heparin (5000 U/mL)	National Drug Codes List	63739-953-25	100 IU/mL
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-50
Low-temperature cautery	Bovie	AA04
Pen trimmer	Wahl	5640-600
Powder-free surgical gloves	Ansell	7824PF
Round handled needle holders	Fine Science Tools	12076-12
Sterile towel drape	Dynarex	DY440-MI
Sterilized 0.9% saline	National Drug Codes List	46066-807-25
Straight dumont forceps	Fine Science Tools	11253-20
Straight needle holder	Fine Science Tools	FST 12001-13
Straight vannas spring scissors	Fine Science Tools	25001-08
TrizChLOR4	National Drug Codes List	17033-279-50