透析液和导管腹膜纤维化的临床相关小鼠模型

摘要

严重腹膜纤维化患者的发病率和死亡率高。腹膜纤维化的机制尚不清楚。在这项研究中，我们描述了一种由注射腹膜透析液诱导的腹膜纤维化的简单实验小鼠模型。

摘要

腹膜纤维化可发生在接受腹膜透析 （PD） 的患者中，严重腹膜纤维化患者的发病率和死亡率高。腹膜炎、高糖腹膜透析液和长时间 PD 会诱发腹膜纤维化的发生。由于人类和 体外 研究的局限性，需要对腹膜纤维化进行动物研究。然而，大多数动物模型并不模拟临床状况。为了研究腹膜纤维化，我们开发了一种临床相关的小鼠模型，方法是植入腹膜导管并每天向腹膜腔注射 2.5% 高葡萄糖 PD 液和 20 mM 甲基乙二醛 （MGO），持续 21 天。腹膜导管的植入避免了针头对腹膜的损伤，并模仿了临床 PD 患者。免疫荧光染色显示肌成纤维细胞在纤维化腹膜中积累。实验组超滤量和腹膜转运功能较低 （腹膜平衡试验）。在本文中，我们提供了该模型的详细协议。

引言

腹膜透析 （PD） 是一种肾脏替代疗法，约有 11% 的终末期肾病 （ESRD） 患者接受¹。研究报告称，接受 PD² 的患者会发生腹膜纤维化。包膜性腹膜硬化症 （EPS） 是一种严重的腹膜纤维化，会导致高发病率和死亡率³。腹膜纤维化的危险因素包括腹膜炎、高糖腹膜透析液、长期 PD 和遗传因素⁴。腹膜纤维化的机制涉及腹膜微环境的复杂变化和不同细胞类型之间的串扰。 体外 实验和临床观察仅限于提供对腹膜纤维化的机制见解，因此需要动物模型。人类^{疾病研究通常}以狗、兔、猪、大鼠、小鼠等实验动物为主5，其中小鼠因其体积小、成本低、易于实验等优点而成为最常用的。此外，可以使用谱系追踪技术在小鼠的疾病模型中研究特定细胞。

建立合适的动物模型将有助于了解腹膜纤维化的病理生理学。理想情况下，这种模型应该是廉价的，易于复制的，并为腹膜纤维化的临床治疗提供基础。

目前可用的腹膜纤维化动物模型是通过每天腹膜内注射高葡萄糖 PD 液持续 28 天，葡萄糖酸氯己定 （CG） 每周三次，持续 3 周，或单剂量次氯酸钠 ^6,7,8 建立的。但是，这些模型具有局限性。注射高葡萄糖 PD 液虽然与临床实践高度相关，但仅诱导轻度腹膜纤维化，无法概括严重腹膜纤维化（如 EPS）的临床情况。CG 或次氯酸盐可通过化学损伤诱导类似于 EPS 的严重腹膜纤维化⁹。然而，CG 和次氯酸盐可能通过与高葡萄糖 PD 液不同的机制诱导腹膜损伤和纤维化。

本研究描述了开发腹膜纤维化小鼠模型的方案。在该模型中，首先插入 PD 导管，然后每天注射高葡萄糖 PD 液加甲基乙二醛 （MGO），持续 21 天。MGO 是 PD 液中的一种有毒葡萄糖降解产物，它促进晚期糖基化终末产物的形成，从而诱导炎症和血管生成^10,11。将 MGO 添加到高葡萄糖 PD 液中会诱导肌成纤维细胞的积累并促进腹膜纤维化。因此，该模型模拟了临床状况。

研究方案

实验是根据国立台湾大学医学院和公共卫生学院机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 批准和进行的。所有小鼠均在标准护理下饲养。

1. 动物实验

1. 使用超过 11 周龄的雄性和雌性 C57BL/6 野生型 （WT） 小鼠。
2. 准备手术材料，包括小鼠 4 法式硅胶端口、手套、窗帘、导管、缝合线和针头。
3. 按如下方式植入鼠标端口：
   1. 通过皮下注射用氯胺酮/甲苯噻嗪 （100/10 mg/kg 体重） 麻醉小鼠。
      1. 检查小鼠在手术过程中的呼吸频率和麻醉深度，以确保麻醉状况。
         注意：如果小鼠的呼吸频率变得快速和短促，则添加先前剂量的 20%。
   2. 麻醉期间将小鼠置于俯卧位。剃除并清洁左背部 2 厘米 x 3 厘米大小的手术区域，并用聚维酮碘消毒皮肤。
   3. 在左背部的皮肤上做一个 1.5 厘米的切口。
   4. 仔细解剖左背部的皮肤和肌肉，创造一个 1 cmx 2 cm 的空间来植入鼠标端口。
   5. 在左背部肌肉上穿孔一个小孔。
   6. 将鼠标端口的 4 法式远端部分插入腹膜腔
   7. 缝合线 （4-0 nylon） 鼠标端口到背部肌肉的根部。
   8. 将鼠标端口的头部放在皮肤和背部肌肉之间。
   9. 用反射夹 （7 mm） 闭合皮肤。
      注意：反射夹比缝合更好，因为老鼠经常咬伤伤口。
   10. 小鼠端口植入 7 天后开始实验。将小鼠随机分为实验组和对照组。
   11. 注射液体前，用聚维酮碘对通路部位的皮肤进行消毒。
   12. 每天腹膜内注射 PD 液 （PDF） 组 2.5% PD 液和 20 mM MGO，总共 2 mL，持续 21 天。用生理盐水 （NS） 注射对照组。

2. 腹膜功能检查（腹膜平衡试验）

1. 准备 2.5% PD 液 （2 mL） 并测量 PD 液的葡萄糖浓度，定义为初始葡萄糖浓度 （D0）。
2. 将 PD 液注入鼠标端口。
3. 30 分钟后，通过异氟醚 （100%） 过量处死小鼠。
4. 用注射器收集腹腔内液，然后测量液体体积，定义为超滤体积。
5. 测量腹腔内液的葡萄糖浓度，定义为最终葡萄糖浓度 （D）。
6. 计算腹膜平衡或腹膜功能¹².
   注意：腹膜平衡试验¹² = 最终 PD 液体葡萄糖浓度 （D）/初始 PD 液体葡萄糖浓度 （D0）。葡萄糖浓度用生化分析仪¹³ 通过己糖激酶法检测。

3. 组织制备和组织学分析

1. 收集腹膜组织：右上腹壁 （1 cm x 1 cm） 和肝脏。用 4% 多聚甲醛固定腹膜组织 2 小时，然后在 18% 蔗糖溶液中过夜⁷.
2. 准备 4 μm 厚的腹膜组织冷冻切片，并按照先前发表的方式进行组织学分析⁷。
3. 进行免疫荧光染色。
   1. 使用针对以下蛋白质的一抗进行免疫标记：α-平滑肌肌动蛋白 （SMA;2 h， 1：200） 用于检测肌成纤维细胞，细胞角蛋白 （2 h， 1：200） 用于间皮细胞检测，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） （5 min， 1：1000） 用于检测细胞核。
4. 以适当的格式表示获得的数据。
   注意：在本研究中，数据表示为 SEM ±平均值。使用适当的统计分析软件（材料表）进行统计分析，并通过单因素方差分析或 t 检验评估统计显着性。

结果

检查腹膜组织组织学，显示 PD 液加 MGO （PDF） 组成功诱导腹膜纤维化。肝脏表面内脏腹膜的免疫荧光染色显示 PDF 组受伤腹膜中的肌成纤维细胞积累比对照组多（图1）。如图 2A 所示，PDF 组的超滤体积低于对照组。如图 2B 所示，与对照组相比，PDF 组的腹膜平衡试验较低。这些结果表明，每?...

讨论

腹膜有内脏和壁层腹膜，覆盖腹部器官和腹壁。它由单层间皮细胞、间皮下层、浆膜、成纤维细胞、淋巴细胞和分泌蛋白组成¹⁴。腹膜纤维化是间皮细胞的丢失和剥脱、间皮下增厚以及许多炎症细胞（如肌成纤维细胞和巨噬细胞）的积累 ^4,14。

腹膜纤维化的动物模型使用腹膜透析来诱导急?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-wide spectrum Cytokeratin antibody	abcam	ab9377
Beckman Coulter	Beckman Coulter	AU5800	Biochemical analyzer
DAPI, 4′,6-diamidino-2-phenylindole antibody	Sigma-Aldrich	98718-90-3
Drapes			any
FITC goat anti-rabbit	Jackson ImmunoResearch Secondary Antibody	111-095-144
Gloves			any
GraphPad Prizm	GraphPad Software	GraphPad Software 9.0
Kellys			any
Methylglyoxal (MGO)	Sigma-Aldrich
Mini-UTE Mouse Port	Access Technologies	MMP-4S 061108B	Mouse 4-French silicone port
Monoclonal anti-actin, α-smooth muscle-Cy3 antibody	Sigma-Aldrich	C6198
Needles			any
Reflex clips 7 mm			any
Suture 4-0 Nylon			any